鄭惟嘉,王曉燕,白臻祖,姜 凱,黃 珊，柳 瓏

(國防科技大學(xué)理學(xué)院生物與化學(xué)系，湖南 長沙 410073)

骨組織工程生物支架的三個主體部分可以概括為：支架材料、種子細胞及生長因子三大部分[1]。構(gòu)建人體移植不排異的骨支架是骨組織工程研究的重點任務(wù)。支架可以提供細胞黏附、遷移、增殖的微環(huán)境，伴隨生長因子的作用，可以更快地令缺損的骨組織再生[2]。組織工程中的生物支架往往都具有三維結(jié)構(gòu)，可以為細胞吸收營養(yǎng)物質(zhì)、增殖分化、代謝廢物及細胞間的信息傳遞提供一定的空間；同時為種子細胞分泌細胞外基質(zhì)，提供一個有利于相應(yīng)的組織或器官細胞生長與愈傷的良好微環(huán)境。理想的骨組織工程支架材料應(yīng)具備以下條件[3]：①良好的生物相容性，避免使用有毒或者有致畸可能的材料制作生物支架；②良好的機械強度與可塑性，與人體骨組織的機械強度和硬度越接近越好，以便支撐新生組織成形；③疏松的孔隙結(jié)構(gòu)，便于細胞完成黏附、增殖、分化以及促進骨組織修復(fù)的礦化等生命活動；④優(yōu)良的降解能力，隨著組織的逐漸修復(fù)，支架應(yīng)該緩慢地降解，以便在提供支撐后不影響組織的正常功能。

骨的主要成分是I型膠原與納米羥基磷灰石的復(fù)合體[4]以及在其上生長的細胞。細胞外基質(zhì)中富含膠原蛋白，其主要以納米纖維(10～100 nm)的形式組成高孔隙率網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能夠?qū)毎磉^程進行調(diào)控。Yang等[5]研究發(fā)現(xiàn)，納米纖維直徑越小，其上生長的細胞分化程度就越高。納米纖維支架可以作為細胞外基質(zhì)的非生物替代品，為細胞的體外增殖、分化、礦化及細胞間信號通路提供更優(yōu)質(zhì)的環(huán)境。

使用靜電紡絲方法制備的生物支架由直徑基本均一的納米級纖維絲堆疊組成，結(jié)構(gòu)均勻，具有高孔隙率。紡絲時可以使用性質(zhì)穩(wěn)定、生物友好的高分子材料作為原料，同時可以添加具有促成骨效應(yīng)的生長因子或無機鹽，可促進骨細胞在支架上增殖分化，并進一步沉積成骨，因此在骨組織工程中前景良好，值得研究[6]。

1 靜電紡絲技術(shù)

1934年，F(xiàn)ormhals[7]申請了一項專利，其內(nèi)容是利用高壓靜電作為驅(qū)動力使用聚合物溶液像蠶吐絲一樣生成纖維的實驗裝置的創(chuàng)造。專利公布了通過裝置讓聚合物溶液在電極間產(chǎn)生射流的技術(shù)，第一次具體描述并解釋了靜電驅(qū)動制備纖維裝置，標志著電紡纖維技術(shù)研究的開始[6]。

其后的六十年間，電紡技術(shù)發(fā)展很緩慢，有時幾乎處于停滯，研究者大多為裝置本身所束縛，期間專利發(fā)布數(shù)量較多，也沒有得到太多關(guān)注。直到20年前，美國阿克隆大學(xué)Reneker研究小組[8]對電紡工藝和應(yīng)用產(chǎn)生了興趣，不僅對電紡纖維做了電鏡掃描，還進行了電子衍射實驗。用靜電紡絲技術(shù)從各向同性溶液中紡制的小直徑聚對苯二甲酰對苯二胺(poly-p-phenylene terephthamide, PPTA)纖維顯示出優(yōu)異的有序性，與從液晶狀態(tài)紡制的商品化PPTA纖維相似。這些細纖維具有熱穩(wěn)定性。退火后，其晶體結(jié)構(gòu)開始轉(zhuǎn)變，即PPTA在低濃度溶液中凝聚的特征。電鏡顯示了纖維中微晶的部分形態(tài)和排列。Reneker研究小組還運用原子力顯微鏡圖像提取粗糙度參數(shù)，并發(fā)現(xiàn)這些參數(shù)可用于改善加工條件。

近年來，納米技術(shù)逐漸進入到研究者們的視野中，靜電紡絲技術(shù)也跟隨納米技術(shù)逐漸在科研領(lǐng)域和工業(yè)應(yīng)用中占有一席之地。靜電紡絲技術(shù)的發(fā)展過程被大致總結(jié)為以下四個研究階段：①聚合物的電紡能力以及工藝和參數(shù)調(diào)節(jié)與纖維直徑、性能的關(guān)系和優(yōu)化等[9]；②多樣化材料制備電紡纖維及如何精準控制其結(jié)構(gòu)[10]；③電紡纖維在資源[11]、環(huán)境[12]、醫(yī)療[13]、光電[14]等領(lǐng)域的應(yīng)用；④電紡纖維的量產(chǎn)[15]。

靜電紡絲設(shè)備主要由高壓直流電源、數(shù)字注射泵和收集器三部分構(gòu)成[16]。靜電紡絲是帶電聚合物流體以高壓靜電場作為驅(qū)動力產(chǎn)生射流形成纖維的技術(shù)[17]。液滴從針尖中被擠壓而出，暴露在針尖和收集器之間的靜電場中。通過電場作用，液滴形成指向收集器的尖峰，以泰勒錐的形式向收集器進一步延伸，延伸過程中直徑不斷縮減，最終制備得到納米纖維[18]。

2 電紡納米纖維在骨組織工程中的應(yīng)用

靜電紡絲技術(shù)制備的聚合物纖維具有納米級形貌和孔隙率高的特性，具有類天然細胞外基質(zhì)的性質(zhì)，所以能夠促進細胞生長及其它生理過程[19]。這一優(yōu)點使得靜電紡絲技術(shù)在骨組織工程中被廣泛應(yīng)用。本文根據(jù)靜電紡絲溶液特點和制備方式的不同將其分為溶液靜電紡絲、摻雜靜電紡絲、同軸靜電紡絲，這幾種紡絲對骨組織修復(fù)有不同程度和類別的促進作用。近年來靜電紡絲技術(shù)與骨組織工程的結(jié)合正蓬勃發(fā)展，方興未艾，是十分值得調(diào)研和研究的領(lǐng)域。

2.1 溶液靜電紡絲

溶液靜電紡絲法是一種初級的，高效率連續(xù)制備納米纖維的重要方法。和熔體、熔噴紡絲法相比，溶液電紡的纖維直徑更小更均一，應(yīng)用更廣泛[20]。單一組分或多個組分直接混合成溶液作為原料電紡成納米纖維，用于組織工程，這一方法在過去的研究中已經(jīng)進行了廣泛的嘗試。如聚ε-己內(nèi)酯(polycaprolactone，PCL)[21]、聚己內(nèi)酯/聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)[22]、海藻酸鈉(sodium alginate, SA)/聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)[23]、絲素蛋白(silk fibroin, SF)[24]、再生絲素蛋白/甲酸(formic acid, FA)/殼聚糖(chitosan，CS)[25]、聚乙烯醇/水性聚氨酯(water polyurethane, WPU)/水溶性尼龍[20]以及豬骨脫細胞基質(zhì)/左旋聚乳酸(L-polylactic acid, PLLA)[26]等都是較為常見的用于溶液靜電紡絲的材料。這些直接由單一或復(fù)合溶液作為材料紡絲得到的支架部分由于理化性質(zhì)單一，不足以對組織細胞的體外生理過程有促進作用；部分由于機械強度較弱，難以在組織修復(fù)過程前期提供較好的支撐；或者是由于支架孔隙過小，給組織細胞的粘附和生長增加了難度[27]?；谶@些基礎(chǔ)研究，近些年陸續(xù)有對紡絲方法改進和對制備的靜電紡絲材料進行后續(xù)修飾處理的方法等相關(guān)文章發(fā)表。將改性后的材料用于靜電紡絲制備三維支架或是直接對制備好的納米纖維膜進行改性等都是很好的發(fā)展方向。

薛錢華等[28]首先電紡出再生SF/聚乳酸納米膜，其上纖維無規(guī)則排列。甲醇改性處理后，纖維變得形貌良好、質(zhì)地堅固，是因為絲素蛋白被甲醇處理后，其二級結(jié)構(gòu)從無規(guī)向有序轉(zhuǎn)變并獲得了較好的力學(xué)性能。其還將高速旋轉(zhuǎn)的滾軸用來收集制備的納米纖維膜。結(jié)果顯示，收集裝置的轉(zhuǎn)速與纖維的取向程度成正相關(guān)，并與纖維直徑成負相關(guān)。還可將制備的支架研磨破碎，并進行熱誘導(dǎo)，再退火冷卻，使支架結(jié)構(gòu)變得更加疏松多孔[29]；氧氣或氮氣的等離子體處理改性，能夠有效促進礦物質(zhì)的沉積[30]；浸入金屬離子溶液中制得均勻的涂層，可為礦化提供成核位點，同時提高支架的機械強度[31]。通過改性的溶液靜電紡絲性能得到很大的提升，但仍然難以滿足細胞生長的各方面需求。向溶液中摻雜對細胞有促進作用的生長因子和各種無機鹽不失為一個很好的解決方案。

2.2 摻雜靜電紡絲

對細胞有促進作用的生長因子種類有很多，在電紡纖維膜過程中進行適當添加有助于支架與生物體的適配。Abazari MF等[32]人設(shè)計并制備了堿性成纖維細胞生長因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)與聚己內(nèi)酯/聚偏氟乙烯(polyvinylidene difluoride, PVDF)功能性納米纖維支架。并通過誘導(dǎo)性多能干細胞培養(yǎng)，通過對照實驗，證明在bFGF支架上的誘導(dǎo)性多能干細胞能更多地存活，分化和礦化程度也更高。基因和蛋白質(zhì)表達的實驗結(jié)果也證明了含bFGF的支架具備更好的成骨促進作用。此外，還有機械生長因子(mechano-growth factor，MGF)[33]、表面重組人生長因子(DOPA-IGF1)[34]、地塞米松(DEX)[35-36]、固定化表皮生長因子(EGF)[37]等生長因子以及多種生長因子的復(fù)合體也可以負載在電紡纖維膜上作為骨組織工程生物支架。

在靜電紡絲摻雜中應(yīng)用最廣泛的金屬無機鹽之一是鈣鹽。骨骼的生長依賴于鈣離子的含量，人體攝入的鈣99%都用于骨骼和牙齒的生長、發(fā)育和修復(fù)。靜電紡絲摻雜加入鈣類無機鹽有利于促進成骨細胞的增殖分化。過去的研究便有在支架中加入納米羥基磷灰石顆粒(nanohydroxyapatite, NHA)的先例，不僅大幅提高彈性模量，而且可以提高細胞的粘附和代謝活力[38]，以及以明膠羥基磷灰石(HA)通過交聯(lián)、靜電紡絲制備的纖維支架為材料研究成骨細胞的組織工程化[39]、乳酸鈣/醋酸纖維素的電紡支架[40]等。Arslan Aysu等[41]人將非晶態(tài)羥基磷灰石(HAp)和摻硼羥基磷灰石(B-HAp)納米顆粒以5%的比例包覆在三維聚己二酸丁二醇酯(polybutylene adipate, PBAT)纖維支架中，增加了支架的成骨活性。另外，Shafiei Shervin等[42]人發(fā)現(xiàn)/在聚己內(nèi)酯/聚乙烯醇納米復(fù)合材料中單獨添加1%的碳點(CDs)和蛋殼型磷酸鈣(TCP3)可顯著提高堿性磷酸酶活性和細胞增殖率。

在骨修復(fù)的過程中，除鈣以外，許多其它金屬元素對成骨分化也起著非常重要的作用，例如摻鍶和銅[43]的電紡生物活性玻璃纖維可顯著提高成骨細胞的表型，同時抑制破骨細胞的活性[44]；多壁碳納米管(f-MWCNTs)和氧化鋅(ZnO)納米粒子靜電紡支架具有抗菌活性和細胞相容性[45]；電紡制備以伊蘭依蘭(YY)和硝酸鋅[Zn(NO3)2]為添加劑的聚氨酯(PU)納米纖維，可顯著改善PU的抗凝血性和生物相容性[46]；使用氧化鎳納米顆粒與花生油復(fù)合，制備靜電紡聚氨酯(polyurethane, PU)支架，對纖維形態(tài)、潤濕性、熱行為、表面粗糙度和礦物沉積有顯著的影響，顯示了其對骨再生的多功能性[47]。

其它非金屬元素的無機鹽摻雜對成骨的促進作用也有相關(guān)研究。例如，納米生物活性玻璃(nBGs)涂層聚乳酸(PLLA)支架納米纖維[48]、聚-β-羥丁酸(PHB)/殼聚糖/納米生物玻璃(nBG)復(fù)合支架[49]以及氧化石墨烯(CA)摻雜醋酸纖維素的納米纖維支架[50]等在骨組織工程領(lǐng)域皆有相關(guān)研究。Moonesi Rad R等[51]人還研制了新型7%硼改性生物活性玻璃(7B-BG)，溶劑澆鑄法得到醋酸纖維素(CA)層，電紡制備CA/明膠/BG納米顆粒功能梯度層，對細胞鈣沉積有促進作用，且較為顯著。

2.3 同軸靜電紡絲

同軸靜電紡絲是在傳統(tǒng)的靜電紡絲的基礎(chǔ)上進行了升級的技術(shù)。傳統(tǒng)靜電紡絲的單一噴絲頭被替換成兩個共軸的毛細管，兩個毛細管分別輸出不同的溶液，可以得到具有核鞘結(jié)構(gòu)的纖維。由于兩個共軸的毛細管輸出的溶液不同，可以將多種不同或相同功能的材料進行組合，從而得到更多不同功能的核鞘結(jié)構(gòu)纖維，且它們都具有內(nèi)外不同的理化性質(zhì)，相較于均一電紡纖維在多個方面更具有優(yōu)勢，如功能更好、機械性能更強、性質(zhì)更穩(wěn)定等，從而具有更廣泛的應(yīng)用范圍。同軸電紡還可以改進難紡聚合物的可紡程度，比如黏度大的、可紡性好的聚合物作外殼包裹可紡性差的聚合物。難以電紡的鞘層聚合物溶液被殼層聚合物溶液帶動，比單獨的難紡聚合物更加容易延伸成絲[52]。同軸電紡最初在2002年首次提出并被用于制備具備核鞘結(jié)構(gòu)的納米纖維[53]。核鞘結(jié)構(gòu)具有更好的藥物封裝能力和緩釋能力[54]，因此在骨組織工程中也有著廣泛的應(yīng)用，并取得顯著的成效。

研究表明，SF和聚乳酸-ε-己內(nèi)酯(poly(lactide-co-ε-caprolactone), PLCL)均不易引起排異且降解能力較強。相比較而言，兩種材料也有一定的差異，SF的細胞親和力優(yōu)于PLCL，而PLCL的斷裂強度和伸長率優(yōu)于SF。Liu等[55]人將PLCL溶于六氟異丙醇(hexafluoroisopropanol,HFIP)和甲酸(CH2O2)、HFIP和HFIP-二氯甲烷中，將其作為核溶液，SF溶解在HFIP中，將其作為鞘溶液，再同軸電紡制備核鞘結(jié)構(gòu)的纖維。進行透射電鏡圖像發(fā)現(xiàn)纖維存在核鞘結(jié)構(gòu)；進行拉伸試驗則發(fā)現(xiàn)該纖維具有更好的拉伸性能，其強度和伸長率明顯高于純SF纖維。且進一步研究表明該纖維允許細胞粘附、增殖和擴散，且細胞在其上生長方式與純SF纖維相似。以PLCL為核，SF為鞘的同軸電紡纖維能在不影響SF的生物活性的情況下填補了SF力學(xué)性質(zhì)的不足，且具有明顯促進血管組織生長與修復(fù)的能力，進而輔助骨組織修復(fù)，是極佳的組織工程支架；Hu等[56]同軸電紡制備核鞘型聚乳酸(polylactic acid, PLA)/PCL-BMP2(PP-B)纖維支架，集成了有骨傳導(dǎo)性的無機相與可誘導(dǎo)骨生長的生長因子，對骨修復(fù)具有協(xié)同作用。而將羥基磷灰石與明膠-殼聚糖共混制備的核鞘結(jié)構(gòu)的纖維膜能夠模擬細胞外基質(zhì)的有機成分，相較于純羥基磷灰石礦化效率更高，從而進一步促進骨組織生長與修復(fù)[57]。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，靜電紡絲近10年正值蓬勃發(fā)展時期，涌現(xiàn)出了許多先進的技術(shù)和新穎的想法用于制備電紡納米纖維，并將其運用到骨組織工程中。用于骨組織工程的靜電紡絲技術(shù)不再局限于單一組分和扁平結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，而是向多組分、復(fù)雜結(jié)構(gòu)的方向發(fā)展，雖然材料使用的范圍非常廣，但始終圍繞著理想支架的條件展開，致力于避免生物毒性以及產(chǎn)生排異，提高孔隙率、降解能力，構(gòu)建適宜的機械強度，以便最大程度適應(yīng)骨組織修復(fù)需要，但就目前的研究情況來看，很少能有同時滿足多個條件的材料及制備方法，未來仍然會有許多相關(guān)研究。相信隨著對電紡復(fù)合纖維的不斷探索，能夠發(fā)現(xiàn)更好的材料及制備方法，能夠同時滿足多個條件，從多個方面協(xié)同促進骨修復(fù)過程，電紡制備納米纖維與骨組織工程相結(jié)合這一研究方向才會有質(zhì)的飛躍。