魏偉，歐政林，竇曉淋，張帥，唐翎

（中南大學(xué)湘雅醫(yī)院 1.普通外科 2.藥學(xué)部 3.國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，湖南 長沙 410008）

胰腺癌是一種惡性程度很高的腫瘤，在全世界的發(fā)病率和病死率都很高，全球范圍內(nèi)呈快速上升趨勢，我國發(fā)病率逐年上升并呈年輕化的趨勢，嚴(yán)重危害著人類的健康[1-5]。80%的胰腺癌是胰腺導(dǎo)管腺癌，以高侵襲性和早期轉(zhuǎn)移為特點(diǎn)，臨床癥狀出現(xiàn)晚，發(fā)現(xiàn)時已為晚期，雖然放療和化療對延長患者生存期起到了一定的作用，但是患者中位生存期仍小于2年[6-8]。

研究[9-13]表明，胰腺癌病變組織和正常組織之間存在差異表達(dá)基因（different expression genes，DEGs），這些DEGs很可能會導(dǎo)致胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展。高通量基因芯片和測序技術(shù)作為基因表達(dá)分析的工具，已被廣泛應(yīng)用于識別腫瘤發(fā)生過程中遺傳信息的改變[14-15]。隨著基因芯片技術(shù)的發(fā)展，已經(jīng)產(chǎn)生了大量核酸數(shù)據(jù)，這些數(shù)據(jù)需要經(jīng)過挖掘加工才能夠被有效應(yīng)用。芯片數(shù)據(jù)挖掘涉及很多方面，如圖像處理、數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化、DEGs篩選等。GEO（Gene Expression Omnibus）數(shù)據(jù)庫中有豐富的腫瘤相關(guān)基因組及基因表達(dá)譜，為研究細(xì)胞癌基因表達(dá)情況和發(fā)現(xiàn)關(guān)鍵基因的變化規(guī)律提供基礎(chǔ)[16]?；谙嚓P(guān)性的特征選擇（correlationbased feature selection，CFS）變量篩選方法計(jì)算特征變量對于目標(biāo)的整體貢獻(xiàn)來判斷特征變量集的分類能力大小，將與目標(biāo)的相關(guān)性很低的變量，以及變量之間高度相關(guān)的冗余變量去掉，這種變量篩選方法在生命科學(xué)，藥物設(shè)計(jì)等領(lǐng)域被廣泛用于高維數(shù)據(jù)及特征篩選[17]。

本研究基于GEO數(shù)據(jù)庫中獲得的基因芯片數(shù)據(jù)，通過特征篩選獲得差異表達(dá)基因，建立相應(yīng)的胰腺癌判別模型，結(jié)合GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)以及生存分析來研究部分導(dǎo)致胰腺癌的關(guān)鍵基因，初步探索胰腺癌潛在的治療靶點(diǎn)，為研究胰腺癌的分子機(jī)制提供基礎(chǔ)，為胰腺癌的治療診斷提供參考依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)收集

數(shù)據(jù)庫資料下載本研究中，從GEO數(shù)據(jù)庫下載了GSE16515 mRNA表達(dá)譜，該表達(dá)譜采用GPL570 [HG-U133_Plus_2] Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Array平臺，包含胰腺組織樣本52例，其中36例胰腺癌樣本，16例正常組織樣本。使用線性回歸模型軟件包Limma對不同組的芯片進(jìn)行差異性計(jì)算，歸一化。

1.2 篩選DEGs

利用R語言以|log2FC|＞2，P＜0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出DEGs[18]。

1.3 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

GO功能富集分析一般包括生物過程（biological process，BP）、分子功能（molecular function，MF）和細(xì)胞成分（cellular component，CC）[19]。將這些DEGs導(dǎo)入到在線工具DAVID數(shù)據(jù)庫中，分別進(jìn)行GO和KEGG富集分析[20-21]，并利用得到的數(shù)據(jù)繪制氣泡圖。

1.4 蛋白質(zhì)交互作用網(wǎng)絡(luò)分析

利用在線數(shù)據(jù)庫STRING構(gòu)建DEGs之間的蛋白-蛋白交互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)圖，分析蛋白質(zhì)功能之間的相互作用。隨后應(yīng)用Cytoscape軟件（3.8.0）在線工具使PPI的網(wǎng)絡(luò)模塊可視化[22]。

1.5 生存分析

利用PPI網(wǎng)絡(luò)分析篩選出其中的靶基因之后，應(yīng)用在線工具GEPIA數(shù)據(jù)庫對TCGA數(shù)據(jù)庫中有詳細(xì)臨床資料的胰腺癌患者，采用Kaplan-Meier生存分析研究靶基因表達(dá)水平與胰腺癌患者總生存期（overall survival，OS）之間的關(guān)系[23]，驗(yàn)證其在胰腺癌發(fā)生過程中的參與情況。

2 結(jié) 果

2.1 DEGs初步篩選

“差異”在生物學(xué)數(shù)據(jù)分析時有兩層含義，一是統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異，另一個則是生物學(xué)上的差異，所以DEGs的選取通常設(shè)置至少兩個閾值：統(tǒng)計(jì)顯著性量度P值和基因表達(dá)變化量（fold change，F(xiàn)C）。在本研究中，通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)，胰腺癌與對照的基因表達(dá)差異比較，滿足P＜0.05及|log2FC|＞2的有1 121個基因（圖1），其中上調(diào)基因834個，下調(diào)基因287個?？梢钥闯觯休^多基因的差異倍數(shù)較高，推測胰腺腫瘤亦可能是從良性腫瘤向惡性腫瘤轉(zhuǎn)變的過程，所以才存在很大的差異性。

圖1 DEGs火山圖（藍(lán)色點(diǎn)表示滿足閾值的下調(diào)DEGs，紅色點(diǎn)表示滿足閾值的上調(diào)DEGs，灰色點(diǎn)表示不滿足閾值的DEGs）Figure 1 Volcano plots of DEGs (Blue dots indicating the down-regulated DEGs that meet the threshold, red dots indicating the up-regulated DEGs that meet the threshold, and gray dots indicating DEGs that do not meet the threshold)

2.2 基于CFS特征過濾方法的DEGs篩選

使用CFS算法對2.1部分中篩選出的DEGs進(jìn)行進(jìn)一步篩選，通過胰腺癌樣本與正常樣本比較，共篩選出18個DEGs，其中包括了16個上調(diào)基因（BUB1B、 CCNA2、 CCNB1、 CDC20、 CDC6、CDK1、 CKS1B、 CKS2、 EPHA4、 MAD1L1、MAD2L1、MCM2、NDC80、RACGAP1、TTK、ZWINT）和2個下調(diào)基因（ADHFE1、PSMD6）。以該18個DEGs為變量，使用Adaboost算法和Bagging算法，并用4種弱分類器作為基本分類器，分別構(gòu)建胰腺癌判別預(yù)測模型（表1）。結(jié)果顯示，兩種算法，使用不同分類器時，預(yù)測準(zhǔn)確率都高于80%，說明我們篩選得到的18個DEGs，能夠很好地識別腫瘤患者。其中，以RandomForest為弱分類器，采用Adaboost方法所得到的判別模型的預(yù)報(bào)準(zhǔn)確率最高，可以達(dá)到92.3%。從表中可以看出，8種算法建立的預(yù)測模型中，篩選的18個DEGs，無論選擇何種算法，都能夠較好地區(qū)分胰腺癌與正常樣本。

表1 不同弱分類器對胰腺癌的預(yù)測結(jié)果Table 1 Prediction result of different weak classifiers for pancreatic cancer

2.3 DEGs的生物學(xué)功能分析

GO功能富集分析結(jié)果顯示，在BP方面中RNA聚合酶Ⅱ啟動子的正/負(fù)性轉(zhuǎn)錄調(diào)控（positive/negative regulation of transcription from RNA polymeraseⅡ promoter）和DNA模板的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控（positive regulation of transcription，DNA-templated）富集的基因數(shù)量較多；在CC方面，DEGs主要與胞質(zhì)（cytosol）、細(xì)胞核 （nucleus）和核質(zhì)體（nucleoplasm）富集的基因數(shù)量較多；而DEGs的MF主要集中在蛋白結(jié)合（protein binding）和同樣蛋白結(jié)合（identical protein binding）（圖2）。KEGG通路富集分析表明，它們主要參與癌癥通路（pathways in cancer），Wnt信號通路（Wnt signaling pathway），HIF-1信號通路（HIF-1 signaling pathway）和甲狀腺激素信號通路（thyroid hormone signaling pathway）等途徑（圖3）。

圖2 差異表達(dá)基因的GO功能富集分析Figure 2 Functional enrichment analysis of GO for differentially expressed genes

圖3 DEGs的KEGG功能富集分析Figure 3 KEGG functional enrichment analysis of DEGs

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析

使用在線數(shù)據(jù)庫STRING構(gòu)建DEGs之間PPI網(wǎng)絡(luò)。由圖4可知，細(xì)胞分裂周期蛋白20（CDC20）結(jié)構(gòu)度最高，和較多其他節(jié)點(diǎn)有互作。其次是細(xì)胞周期蛋白A2（CCNA2）、細(xì)胞周期蛋白B1（CCNB1）和周期蛋白依賴性激酶1（CDK1）。這些基因可能在胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展中起到核心作用。

圖4 DEGs蛋白交互作用網(wǎng)絡(luò)圖Figure 4 Protein interaction network of DEGs

2.5 生存分析

為了進(jìn)一步驗(yàn)證靶基因與OS的關(guān)系，在利用PPI篩選出靶基因后，使用在線分析工具GEPIA數(shù)據(jù)對TCGA數(shù)據(jù)庫中有詳細(xì)資料的胰腺癌患者進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析，研究靶基因表達(dá)量與胰腺患者OS之間的關(guān)系。選取基因表達(dá)量的中位數(shù)為基線，將其劃分為高表達(dá)組和低表達(dá)組。其中CDK1（P=0.000 8）、CCNB1（P=0.012）、CSK2（P=0.023）、CKS1B（P=0.001 3）的表達(dá)量與患者OS具有相關(guān)性，這些基因表達(dá)量越高，患者OS越短（圖5）。

圖5 關(guān)鍵基因表達(dá)與胰腺癌患者生存的關(guān)系Figure 5 Relations of the expressions of the hub genes with the survival of pancreatic cancer patients

3 討 論

本研究一共篩選出18個DEGs，GO功能富集分析表明這些DEGs在RNA聚合酶Ⅱ啟動子的正/負(fù)性轉(zhuǎn)錄調(diào)控、DNA模板的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控富集、CC方面，DEGs主要與胞質(zhì)、細(xì)胞核，蛋白結(jié)合和同樣蛋白結(jié)合中起到作用。KEGG通路富集分析表明它們主要參與癌癥通路、Wnt信號通路、HIF-1信號通路和甲狀腺激素信號通路等途徑中起作用。

CCNA2和CCNB1編碼的蛋白都屬于細(xì)胞周期蛋白家族，其成員的特點(diǎn)是在細(xì)胞周期中蛋白豐度具有周期性[24]。細(xì)胞周期蛋白作為CDK激酶的調(diào)節(jié)器發(fā)揮作用。不同的細(xì)胞周期蛋白表現(xiàn)出不同的表達(dá)和降解模式，有助于每個有絲分裂事件的時間協(xié)調(diào)。目前已有有關(guān)CCNA2和CCNB1基因在癌組織中的表達(dá)、信號通路和預(yù)后關(guān)系相關(guān)的研究[25-27]。

腫瘤細(xì)胞以持續(xù)分裂、增殖不受控制為特點(diǎn)，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶CDK對腫瘤細(xì)胞的生存具有重要意義。CDK1能通過BRCA1的磷酸化促進(jìn)DNA雙鏈斷裂的同源重組修復(fù)過程和細(xì)胞周期檢查點(diǎn)激活。因此，CDK1是許多生物學(xué)過程中調(diào)控的核心，包括細(xì)胞周期調(diào)控、DNA復(fù)制、DNA損傷修復(fù)等，并將這些生物學(xué)過程與細(xì)胞周期進(jìn)程緊密聯(lián)系起來[28-29]。鑒于CDK1對細(xì)胞周期的調(diào)控、檢查點(diǎn)的激活、DNA損傷修復(fù)發(fā)揮著關(guān)鍵性的作用，CDK1成為信號通路的重要位點(diǎn)，相關(guān)的抑制劑開發(fā)受到了廣泛的關(guān)注，尤其是其臨床研究更多指向胰腺癌[30-33]。

在本研究中，采用CFS算法對胰腺癌的DEGs進(jìn)行篩選，獲得18個DEGs，在此基礎(chǔ)了使用機(jī)器學(xué)習(xí)方法構(gòu)建了胰腺癌判別模型。通過GO和KEGG生物功能分析，PPI網(wǎng)絡(luò)分析和生存率分析，發(fā)現(xiàn)CDK1、CCNA2和CCNB1的可能與胰腺癌的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。