邱成書(shū)，劉松青，劉紅玲，伍 勇，程 馳，宋 斌

（1.成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都 611130；2.特色園藝生物資源開(kāi)發(fā)與利用四川省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611130；3.廣東省微生物研究所，廣東 廣州 510070）

真姬菇（Hypsizygus marmoreus）又名斑玉蕈、玉蕈或蟹味菇等，在分類(lèi)學(xué)上隸屬于擔(dān)子菌門(mén)（Basidiomycota）傘菌綱（Agaricomycetes）傘菌目（Agaricales）離褶傘科（Lyophyllaceae）玉蕈屬（Hypsizygus）[1]。真姬菇主要分布于北美、歐洲、西伯利亞、日本和中國(guó)東北、云南省等北溫帶地區(qū)[2-3]。春秋冬季之際，主要生長(zhǎng)在槭樹(shù)科（Aceraceae）、山毛櫸科（殼斗科）（Fagaceae）等闊葉樹(shù)的枯木、倒木和樹(shù)樁上[4]。真姬菇營(yíng)養(yǎng)豐富，氨基酸、多糖的種類(lèi)較多，具有獨(dú)特的蟹香味，并可抗氧化、提高免疫力和預(yù)防衰老等[5-6]。

簡(jiǎn)單重復(fù)序列多態(tài)性ISSR（inter-simple sequence repeat）是加拿大蒙特利爾大學(xué)的Zietkiewicz等[7]在1994年基于微衛(wèi)星技術(shù)基礎(chǔ)開(kāi)發(fā)的新技術(shù)。即基于生物體基因組中普遍存在的微衛(wèi)星序列而設(shè)計(jì)單一引物，擴(kuò)增兩側(cè)的反向微衛(wèi)星序列，經(jīng)過(guò)電泳、染色，檢測(cè)有無(wú)條帶及其大小，獲取各樣品的ISSR指紋圖譜信息。真核生物的基因組中存在數(shù)量龐大的微衛(wèi)星序列，ISSR能檢測(cè)到樣品的高頻率多態(tài)性。加拿大不列顛哥倫比亞大學(xué)UBC（University of British Columbia）公布了一套ISSR引物（100條），研究人員僅需根據(jù)樣品選擇一條合適的ISSR引物進(jìn)行擴(kuò)增，就能獲取比限制性酶切片段和微衛(wèi)星更加豐富遺傳信息。

相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性SRAP（sequence-related amplified polymorphism）是Li等[8]在2001年研發(fā)出的一種核酸標(biāo)記技術(shù)，基于基因外顯子中（GC）含量豐富，而啟動(dòng)子與內(nèi)含子中（AT）含量較高的特點(diǎn)，針對(duì)可讀框ORFs（open reading frame）設(shè)計(jì)引物進(jìn)行擴(kuò)增。不同生物體的內(nèi)含子、啟動(dòng)子長(zhǎng)度差異巨大，形成豐富多態(tài)性。SRAP是一個(gè)簡(jiǎn)單、高效的遺傳標(biāo)記系統(tǒng)，已廣泛應(yīng)用于植物研究，同樣也應(yīng)用于大型真菌遺傳研究中[9-10]。

真姬菇屬于珍稀食用菌品種，對(duì)其種質(zhì)資源多樣性進(jìn)行必要的研究和保護(hù)，具有十分重要的意義。因此，利用收集到的幾個(gè)國(guó)內(nèi)真姬菇（含白變種）菌株，使用蔗糖馬鈴薯培養(yǎng)基進(jìn)行菌絲復(fù)壯，通過(guò)不同方法提取真姬菇基因組DNA，探索真姬菇基因組最佳提取方法，后進(jìn)行ISSR和SRAP試驗(yàn)，為真姬菇遺傳研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

試驗(yàn)所用的真姬菇菌株（含白變種）相關(guān)信息詳見(jiàn)表1[11]。

表1 供試菌株信息Tab.1 Information of the test strains of Hypsizygus marmoreus

1.2 試驗(yàn)試劑

蔗糖（分析純），天津市化學(xué)試劑三廠(chǎng)；碳酸鈣CaCO3（分析純），天津市化學(xué)試劑三廠(chǎng)；瓊脂（分析純），石獅市環(huán)球瓊膠工業(yè)有限公司；Omega真菌基因組提取試劑盒，美國(guó)奧美嘉生物技術(shù)公司；Taq酶、dNTP、Mg2+、mixture，天根生化科技（北京）有限公司；生工真菌基因組提取試劑盒、β-巰基乙醇（AR）、異丙醇（AR）、三氯甲烷（AR）、ISSR引物（UBC801-UBC900）、SRAP引物（前端ME1-ME13，后端EM1-EM13），生工生物工程（上海）有限公司。

1.3 試驗(yàn)設(shè)備

N8A78型微波爐，蘇州三星電子有限公司；Eppendorf 5810R低溫冷凍高速離心機(jī)，德國(guó)艾本德股份公司；六一DYCZ-20C電泳儀、DYCP-34A電泳槽，北京六一生物科技有限公司；島津紫外UVmini-1240分光光度計(jì)，日本島津制作所；通用Gel Iqrtecl 300凝膠成像儀，美國(guó)通用電氣公司；ABI 7500熒光定量PCR，美國(guó)Applied Biosystems公司；LRH-生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HC-2062高速離心機(jī)，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；721分光光度計(jì)，上海佑科儀器儀表有限公司；HZQ-X100A迂回振蕩器，上海一恒科技有限公司；YXQ-LS30A數(shù)顯立式高壓滅菌鍋，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司；GHG9070電熱鼓風(fēng)干燥箱上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；DL-I-15臺(tái)式封閉電爐，天津市泰斯特儀器有限公司；JA3003電子天平，上海衡平儀器儀表有限公司；HWS-28電熱恒溫水浴鍋上海一恒科技有限公司；SKY-100C恒溫震蕩搖床，上海蘇坤實(shí)業(yè)有限公司；SW-CG-2D雙人單面垂直超凈工作臺(tái)，蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；PHS-3C酸度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司；HHSJ磁力攪拌器，常州金壇精達(dá)儀器制造有限公司。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 母種擴(kuò)繁

采用馬鈴薯蔗糖瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行母種的擴(kuò)繁，配方為：馬鈴薯200 g、蔗糖20 g、瓊脂20 g，水1 000 mL。將制好的試管放入高壓鍋中進(jìn)行滅菌，126℃維持30 min，然后取出擺斜面。在超凈工作臺(tái)上進(jìn)行接種，左手平行、并排拿起母種試管和供接種用的斜面試管，2支試管的斜面向上，管口齊平；用接種針將母種縱橫切成許多小方塊，每塊面積約為0.5 cm2；取一塊迅速放入待接種的試管斜面中前部，每支母種可以接種試管30支～40支。接種完成以后，將接種好的試管放入恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，溫度控制在24℃～26℃。一般情況下，培養(yǎng)10 d～15 d就可以長(zhǎng)滿(mǎn)斜面。

1.4.2 基因組提取

選用3個(gè)真姬菇菌株GDGM26168、HN-1和CBS-1提取基因組DNA，分別采用5種方法：SDSCTAB法[12]、SDS法[13]、CTAB法[14]、Omega基因組提取試劑盒和生工生物真菌基因組提取試劑盒。

1.4.3 最佳反應(yīng)體系篩選

為更好地建立適宜真姬菇ISSR分析的PCR反應(yīng)體系，對(duì)Taq酶添加量、Mg2+添加量、DNA模板添加量、dNTP添加量和引物添加量對(duì)反應(yīng)效果的影響進(jìn)行探索。各試劑初始濃度分別為：DNA模板質(zhì)量濃度為20 ng·μL-1、dNTP濃度為2.5 mmol·L-1、Taq酶濃度為2.5 U·μL-1、引物濃度為10 mmol·L-1、Mg2+濃度為25 mmol·L-1。參照參考文獻(xiàn)[11]，選用2個(gè)真姬菇菌株FJNK-1和SM-4的基因組DNA作為模板，設(shè)計(jì)PCR體系為25μL的正交試驗(yàn)L16（45），各因素水平見(jiàn)表2。

表2 因素水平Tab.2 Factors and levels

1.4.4 ISSR引物篩選

引物篩選是ISSR分析能否成功的一個(gè)十分重要的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。參照參考文獻(xiàn)[15-17]，選取50條通用ISSR引物，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。用6個(gè)真姬菇菌株GDGM26168、GDGM 26169、HN-1、FJNK-1、CBS-1、ACCC51536的基因組DNA為模板，進(jìn)行ISSR引物篩選。篩選出的引物需要具有較高的穩(wěn)定性，且對(duì)每個(gè)菌株都能擴(kuò)增出片段大小豐富、清晰、數(shù)目適中的PCR產(chǎn)物。

1.4.5 SRAP引物篩選

以7個(gè)真姬菇菌株GDGM26168、GDGM26169、HN-1、FJNK-1、CBS-1、ACCC51536和SM-4的基因組DNA為模板；參照參考文獻(xiàn)[8]以及參考文獻(xiàn)[18]，選用13條SRAP前端引物（正向，編號(hào)為ME1~ME13）和13條后端引物兩兩配對(duì)進(jìn)行初步篩選；依據(jù)電泳條帶篩選標(biāo)準(zhǔn)，得到前端引物和后端引物進(jìn)行第二輪篩選；最終篩選得到試驗(yàn)引物組合。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 基因組提取

用5種方法提取3個(gè)真姬菇菌株（GDGM26168、HN-1和CBS-1）的基因組DNA，試驗(yàn)設(shè)計(jì)詳見(jiàn)表3。

表3 基因組提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.3 Design of genome DNA extraction experiment

如表3所示，每個(gè)試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)重復(fù)，提取后的DNA利用電泳進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 不同方法提取的3個(gè)真姬菇菌株基因組DNAFig.1 Genomic DNA of three Hypsizygus marmoreus strains extracted by different methods

由圖1可知，5種方法都可以用于真姬菇基因組提取，但提取效果差異明顯。試劑盒的提取效果明顯優(yōu)于SDS-CTAB法、SDS法和CTAB法，這得益于試劑盒已優(yōu)化了影響提取效果的各類(lèi)因素，并進(jìn)行了程序化，減少了試驗(yàn)中的人為干擾和其他影響。就基因組提取效果而言，生工生物的基因組試劑盒效果相對(duì)較好，獲得的DNA量大、完整，可用于后續(xù)研究。因此采用生工生物真菌基因組試劑盒開(kāi)展后續(xù)試驗(yàn)。

2.2 真姬菇PCR反應(yīng)體系優(yōu)化

根據(jù)設(shè)定的因素水平設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，詳見(jiàn)表4。

如表4所示，以2個(gè)菌株（FJNK-1和SM-4）為模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果見(jiàn)圖2。

表4 真姬菇PCR反應(yīng)體系優(yōu)化正交試驗(yàn)Tab.4 Orthogonal experimentof PCR reaction system optimize of Hypsizygus marmoreus

圖2 真姬菇菌株P(guān)CR結(jié)果Fig.2 PCR reaction result of genetic diversity of Hypsizygus marmoreus

由圖2可知，9號(hào)和10號(hào)試驗(yàn)所得結(jié)果中條帶數(shù)量較多且較為清晰。由此篩選得到最佳的PCR反應(yīng)體系（25μL）為：質(zhì)量濃度為20 ng·μL-1的DNA模板2.0μL，濃度為2.5 mmol·L-1的dNTP 1.5μL，濃度為2.5 U·μL-1的Taq聚合酶0.5μL，濃度為10 mmol·L-1的引物各1.0μL，濃度為25 mmol·L-1的Mg2+1.5μL。

2.3 真姬菇ISSR引物篩選

以6個(gè)試驗(yàn)所用的真姬菇菌株（GDGM26168、GDGM26169、HN-1、FJNK-1、CBS-1、ACCC51536）為模板DNA進(jìn)行ISSR擴(kuò)增，每個(gè)模板2個(gè)重復(fù)。經(jīng)預(yù)試驗(yàn)，選擇退火溫度（Tm）相差不大的4條引物（UBC834、UBC842、UBC836和UBC821），以47.5℃作為T(mén)m，結(jié)果見(jiàn)表5。

表5 ISSR引物篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.5 Design of screening experiment of ISSR primers

按表5所示的組合進(jìn)行試驗(yàn)，電泳檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 ISSR引物篩選結(jié)果Fig.3 Results of ISSR primers screening

如圖3所示，利用UBC834和UBC836引物擴(kuò)增的條帶都十分清晰，可分辨程度高。經(jīng)過(guò)3輪篩選，最終篩選得到18條穩(wěn)定性高、多態(tài)性豐富的ISSR引物：UBC807、UBC808、UBC810、UBC811、UBC812、UBC822、UBC823、UBC824、UBC834、UBC835、UBC836、UBC840、UBC841、UBC842、UBC853、UBC854、UBC899、UBC900。

2.4 真姬菇SRAP條件摸索

確定真姬菇最佳PCR反應(yīng)體系后，使用13條SRAP前端引物（ME1～ME13）和13條后端引物（EM1～EM13）兩兩配對(duì)，以7個(gè)菌株（GDGM 26168、GDGM26169、FJNK-1、ACCC50536、HN-1、CBS-1和SM-4）為模板進(jìn)行初篩。以后端引物使用ME7為例，部分組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表6，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

表6 部分SRAP引物第一次篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.6 Design of first screening experiment of part of the SRAP primers

如圖4所示，依據(jù)擴(kuò)增后條帶數(shù)量適中、清晰，容易辨認(rèn)的原則，第一輪最終共篩出前端引物8條、后端引物8條，引物信息見(jiàn)表7。

利用表7所示引物，以7個(gè)菌株（GDGM 26168、GDGM26169、FJNK-1、ACCC50536、HN-1、CBS-1和SM-4）為模板，所篩選出的前端和后端引物一一對(duì)應(yīng)組合開(kāi)展第二輪引物篩選。試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表8，篩選結(jié)果見(jiàn)圖5。

表7 試驗(yàn)篩選得到的SRAP正向引物和反向引物Tab.7 Forward primers and reverse primers used in SRAP test

表8 SRAP引物第二次篩選試驗(yàn)設(shè)計(jì)Tab.8 Design of second screening experiment of the SRAP primers

由圖4、圖5可以看出，引物組合不同，擴(kuò)增結(jié)果差異很大；不同菌株間擴(kuò)增條帶大小、數(shù)量存在明顯差異，及存在多態(tài)性。經(jīng)過(guò)2次篩選，得到適宜用于開(kāi)展真姬菇SRAP遺傳多樣性分析的55對(duì)SRAP引物組合，見(jiàn)表9。

表9 篩選出的引物對(duì)Fig.9 Selected primer pairs

圖4 SRAP引物第一次篩選Fig.4 Firstscreening of SRAP primers

圖5 SRAP引物第二輪篩選Fig.5 The second screening SRAP primers

3 討論與結(jié)論

由于食用菌富含多糖和蛋白質(zhì)，若采用適用于植物基因組DNA的提取方法提取食用菌的基因組DNA，通常效果較差。真姬菇主要含有復(fù)雜真菌多糖和其他成分，用于植物或真菌常用DNA提取方法存在提取DNA量少，且含有雜質(zhì)，導(dǎo)致DNA純度不足，對(duì)后續(xù)試驗(yàn)影響較大[19]。相比之下，商業(yè)開(kāi)發(fā)的植物（真菌）基因組提取試劑盒已優(yōu)化了影響試驗(yàn)的多個(gè)因子，并且已程序化，可以節(jié)省時(shí)間保證品質(zhì)，用于試驗(yàn)?zāi)軌驖M(mǎn)足后期試驗(yàn)要求。因此，試驗(yàn)選用生工生物開(kāi)發(fā)的真菌基因組提取試劑盒。

不僅ISSR反應(yīng)體系對(duì)反應(yīng)效果有影響，引物的退火溫度的影響也十分明顯[20-21]。為了更好了解不同引物的退火溫度，試驗(yàn)用溫度梯度PCR進(jìn)行摸索每一條引物確定其退火溫度。確定每一條引物的退火溫度之后，選用6株菌溫度相近的多個(gè)引物同時(shí)試驗(yàn)，考查不同引物對(duì)不同菌株間遺傳多樣性，以此進(jìn)行2輪、3輪引物篩選，最終篩選得到適宜研究的34株菌種[11]ISSR引物。

SRAP主要是基于真核生物啟動(dòng)子設(shè)計(jì)的引物，由于物種、品種間差異性，為更好地明確研究對(duì)象的遺傳多樣性，引物篩選尤為重要。本試驗(yàn)中選取前端引物13條（ME1～ME13），后端引物13條（EM1～EM13）組合成169個(gè)引物對(duì)，經(jīng)過(guò)兩輪篩選，共獲得可以用于真姬菇遺傳多樣性試驗(yàn)的組合55對(duì)，Li[8]和Du[10]的研究獲得的條件摸索結(jié)果相符。

此次研究中探究了適宜真姬菇基因組提取的方法及遺傳多樣性分析條件，為進(jìn)一步研究真姬菇提供了一定的參考。