聶文娟 石文卉 劉佩英 楊揚 王雋 王慶楓 初乃惠

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性疾病，目前仍然是世界許多地區(qū)負擔最重的傳染病之一[1]。為監(jiān)測結(jié)核病活動程度，臨床上已將血紅細胞沉降率和C反應(yīng)蛋白等炎性標志物與胸部影像學檢查、細菌負荷試驗等聯(lián)合使用[2]，但這些生物標記物特異性較差，且易受患者炎癥水平和健康狀況的雙重影響。

既往研究發(fā)現(xiàn)，宿主T細胞介導的免疫應(yīng)答在結(jié)核病發(fā)病機制中起著重要作用，同時也對分枝桿菌提供免疫保護，分枝桿菌抗原激活免疫系統(tǒng)與細胞因子水平升高密切相關(guān)。在這些研究中，部分細胞因子包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素4(IL-4)、可溶性白細胞介素受體(sIL-2R)和γ-干擾素(IFN-γ)等已被認為可能與患者體內(nèi)免疫激活狀態(tài)相關(guān)，且這些研究均為評價血清細胞因子水平，而并非經(jīng)體外抗原刺激外周血單個核細胞的方法，操作過程更簡便，可能成為疾病診斷和治療過程中的生物標志物[3-4]，但許多評估此類方法的研究并未能證明其在臨床環(huán)境中的使用是否合理[5-6]，因此，這些方法的價值仍存在爭議。基于此，筆者希望通過監(jiān)測活動性肺結(jié)核患者血清中細胞因子水平，并將其與臨床病程進行相關(guān)性分析，以探索其監(jiān)測結(jié)核病活動程度和抗結(jié)核治療效果的意義。

對象和方法

一、研究對象

采用前瞻性隊列研究方法，參照入組標準從2017年12月至2019年6月首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院收治的75例新診斷活動性肺結(jié)核患者中納入67例患者作為研究對象。其中，男性43例(64.2%)，女性24例(35.8%)；<50歲18例(26.9%)，≥50歲49例(73.1%)；無空洞37例(55.2%)，有空洞30例(44.8%)；有呼吸道癥狀(如發(fā)熱、咳嗽、咳痰或胸痛等)者31例(46.3%)；痰抗酸染色涂片細菌負荷分級為陰性、+、++、+++、++++者分別為4例(6.0%)、26例(38.8%)、23例(34.3%)、10例(14.9%)、4例(6.0%)，所有痰涂片陽性患者痰培養(yǎng)均陽性。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會批準(2016年臨審第02-01號)。

納入標準：(1)經(jīng)痰液或支氣管肺泡灌洗液分枝桿菌培養(yǎng)陽性及分子或表型藥物敏感性試驗確診為肺結(jié)核的患者；(2)年齡范圍為18～65歲；(3)胸部CT顯示伴有肺部病變，可有或無空洞；(4)糖化血紅蛋白低于6.0%；(5)均自愿參與本研究并簽署知情同意書。

排除標準：(1)既往抗結(jié)核治療>30 d者；(2)目前正在接受包括糖皮質(zhì)激素等影響免疫功能藥物治療者；(3)合并免疫性疾病或免疫系統(tǒng)異常人群，或出現(xiàn)其他影響免疫狀態(tài)的合并癥，如肝功能損傷、類赫氏反應(yīng)等；(4)合并糖尿病者；(5)耐藥結(jié)核病患者。

二、研究方法

1.相關(guān)細胞因子檢測：在抗結(jié)核治療前、治療過程中每1～2個月和治療結(jié)束時(即治療第6個月左右)采集血樣。使用2 ml離心管收集血液樣本，800×g離心10 min后分離血清，處理后于-70 ℃下儲存，直至使用，避免重復(fù)凍融循環(huán)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒檢測細胞因子TNF-α、IL-4、sIL-2R和IFN-γ水平，重復(fù)2次。將黏附的細胞上清液或標準物添加到抗細胞因子單克隆抗體涂層微量滴定板中，再添加針對細胞因子分子第2表位的酶結(jié)合抗細胞因子單克隆抗體進行培養(yǎng)和洗滌，去除未結(jié)合的抗體后添加底物，讀取490 nm處吸光度值。標準曲線由使用細胞因子標準進行的ELISA繪制，用于量化實驗樣本中的細胞因子水平。實驗操作過程設(shè)立陽性對照和陰性對照。

2.治療隨訪：在治療開始前和治療后的6個月期間進行患者的診斷、治療、不良反應(yīng)處理等隨訪。使用抗結(jié)核藥物包括異煙肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺?；颊呷朐?周后開始抗結(jié)核治療，以確保治療依從性，并要求出院后至少每月能夠返回醫(yī)院1次。治療開始時收集痰液以進行涂片和培養(yǎng)，治療過程中到治療結(jié)束時每月行痰培養(yǎng)，每3個月進行1次胸部CT檢查。出現(xiàn)不良反應(yīng)的患者被要求每周或每15 d復(fù)查，或根據(jù)病情嚴重程度判定是否入院治療。治療的第一個月有58例(86.6%)患者痰培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)，第二個月所有患者痰培養(yǎng)均陰轉(zhuǎn)，且治療結(jié)束后均治愈。

三、統(tǒng)計學處理

使用SPSS 24.0 軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。非正態(tài)分布的計量資料以“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1，Q3)]”描述。治療過程中細胞因子水平變化與治療時間的關(guān)系采用線性趨勢檢驗，用于評估血清中各細胞因子水平在監(jiān)測結(jié)核病治療進展中的價值，同時對各細胞因子治療前的基線血清水平值、治療1～2個月和6個月時的水平值進行受試者工作特征曲線(ROC)分析，以確定最佳臨界值，再以最佳臨界值為參照標準，將高于最佳臨界值者視為陽性者，以預(yù)測各指標水平的診斷效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

一、治療過程中血清細胞因子水平(表1)

1.治療過程中血清TNF-α水平：治療前血清TNF-α水平與治療后6個月水平的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=33.421，P=0.002)，但與治療1～2個月后的水平差異無統(tǒng)計學意義(χ2=21.375，P=0.327)。

2.治療過程中血清IL-4水平：治療前血清IL-4水平與治療1～2個月和治療6個月水平的差異均無統(tǒng)計學意義(χ2=32.136，P=0.232；χ2=39.158，P=0.529)，且治療1～2個月與治療6個月的水平差異也無統(tǒng)計學意義(χ2=35.831，P=0.525)。

3.治療過程中血清sIL-2R水平：治療前血清sIL-2R水平與治療1～2個月水平差異有統(tǒng)計學意義(χ2=15.276，P=0.036)，與治療6個月水平差異無統(tǒng)計學意義(χ2=12.613，P=0.982)，且治療1～2個月水平與治療6個月水平的差異也無統(tǒng)計學意義(χ2=11.914，P=0.085)。

4.治療過程中血清IFN-γ水平：治療前血清IFN-γ水平與治療1～2個月水平的差異有統(tǒng)計學意義(χ2=31.111，P=0.000)，與治療6個月水平的差異無統(tǒng)計學意義(χ2=3.212,P=0.073)，且治療1～2個月水平與治療6個月水平差異也無統(tǒng)計學意義(χ2=29.903，P=0.642)。

二、各細胞因子的ROC曲線分析

對有差異的血清TNF-α、IFN-γ和sIL-2R三種細胞因子進行ROC曲線分析。結(jié)果顯示：當血清TNF-α水平為845.2 pg/ml時，其檢測敏感度為51.2%、特異度為60.0%，曲線下最大面積(AUC)為0.594(P=0.013)(圖1)，即845.2 pg/ml為其最佳臨界值。當血清sIL-2R水平為15.0 pg/ml時，其檢測敏感度為61.5%、特異度為55.2%，AUC為0.597(P=0.054)(圖2)，即15.0 pg/ml為其最佳臨界值。當血清IFN-γ水平為393.3 pg/ml時，其檢測敏感度為60.0%、特異度為64.2%，AUC為0.651(P=0.017)(圖3)，即393.3 pg/ml為其最佳臨界值。

表1 治療前后血清TNF-α、IL-4、sIL-2R和INF-γ水平

圖1～3 分別為治療前、治療1～2個月和治療后6個月血清TNF-α、sIL-2R和IFN-γ水平的ROC曲線分析

表2 67例患者以不同細胞因子最佳臨界值為參照標準在不同時間的陽性率情況

三、各細胞因子在結(jié)核病治療中的預(yù)測作用

以最佳臨界值為參照標準，發(fā)現(xiàn)67例受試者中，治療前血清IFN-γ和TNF-α水平高于其最佳臨界值者(陽性者)分別有43例(64.2%)和34例(50.7%)；治療1～2個月后，血清IFN-γ水平陽性者為14例(20.9%)，較治療前明顯降低(χ2=34.634，P=0.000)；治療6個月后，血清TNF-α水平陽性者為19例(28.4%)，也較治療前明顯降低(χ2=53.181，P=0.013)，見表2。

討 論

結(jié)核分枝桿菌感染人體后的進展主要取決于結(jié)核分枝桿菌與宿主防御系統(tǒng)的對峙，此時宿主細胞免疫因子充當信使，在對抗病原體入侵過程中幫助整合免疫系統(tǒng)，其中細胞因子在結(jié)核病發(fā)病過程中受到宿主不同狀態(tài)的影響，因此需要了解結(jié)核病患者治療期間的免疫功能變化，以便為免疫學診斷、治療和監(jiān)測提供理論基礎(chǔ)。本研究比較了血清細胞因子在宿主不同治療階段下的動態(tài)水平，并根據(jù)治療時間進行分層分析。

Ⅰ型細胞因子是指由細胞產(chǎn)生的具有生物活性的蛋白類物質(zhì)細胞因子的統(tǒng)稱，尤其是TNF-α，在結(jié)核分枝桿菌感染過程中至關(guān)重要，也是疾病進展的主要參與者[7]，高水平的TNF-α可能促進肉芽腫發(fā)展、感染和病灶進展[8]。既往研究發(fā)現(xiàn)，治療后TNF-α水平的降低程度與結(jié)核病的良好預(yù)后密切相關(guān)[9]，故檢測其治療前后水平的下降情況可以監(jiān)測抗結(jié)核治療的療效[10-12]，若顯著降低則可能成為預(yù)測治療效果的潛在生物標志物。進一步通過ROC曲線分析獲得最佳臨界值可作為生物標志物用于結(jié)核病治療的評估手段[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，本組患者治療6個月后血清TNF-α水平顯著降低(P=0.002)，且AUC為0.594(P=0.013)，提示血清TNF-α可能作為預(yù)測結(jié)核病治療效果的標志物。

IL-4為調(diào)節(jié)性細胞因子，通過調(diào)節(jié)TNF-α活性等參與調(diào)控感染免疫反應(yīng)。IL-4在結(jié)核病進展中的作用存在爭議，部分研究認為結(jié)核分枝桿菌感染后產(chǎn)生的IL-4可能下調(diào)免疫反應(yīng)，這種細胞因子的過度產(chǎn)生可能導致感染控制下調(diào)[13]；且有部分研究發(fā)現(xiàn)伴有空洞患者的IL-4水平更高[14]。同時在其他研究中發(fā)現(xiàn)，IL-4可能促進結(jié)核病進展，或作為疾病活動的標志物發(fā)揮其被動作用[15]。但在對肺結(jié)核患者治療前后的IL-4水平評估后，部分研究認為其水平變化無統(tǒng)計學意義，而部分研究認為治療前后IL-4水平升高[16-17]。本研究雖然觀察到治療后血清IL-4水平有所降低，但比較不同治療時間和進行ROC曲線分析后均未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計學意義，故本研究結(jié)果不支持血清IL-4水平作為監(jiān)測治療效果的生物標志物。

細胞因子sIL-2R可在絲裂原或抗原激活T淋巴細胞培養(yǎng)上清中檢測到，結(jié)核病患者sIL-2R水平升高表明T淋巴細胞活化程度較高，與疾病進程可能相關(guān)[18]。既往研究發(fā)現(xiàn)，血清sIL-2R水平變化可能與抗結(jié)核療效相關(guān)，治療后其水平顯著降低[1,18]。本研究也觀察到血清IL-2R水平治療前與治療后1～2個月的顯著變化，但通過ROC曲線分析后，發(fā)現(xiàn)變化結(jié)果并不顯著，故仍需更多臨床研究以證明sIL-2R是否可作為監(jiān)測結(jié)核分枝桿菌感染狀態(tài)和治療效果的生物標志物。

IFN-γ由活化的CD4+T淋巴細胞釋放，是保護性抗結(jié)核免疫反應(yīng)的關(guān)鍵成分。既往研究認為IFN-γ可用于監(jiān)測抗結(jié)核治療的效果，即有效的抗結(jié)核治療后血清IFN-γ的水平是降低的[19-21]，但也有部分研究認為成功治療后的IFN-γ水平無顯著變化，或者只有輕微變化[22-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，對于最終獲得治療成功的患者，治療1～2個月后血清IFN-γ較治療前顯著降低，據(jù)此推測血清IFN-γ水平可能可以作為監(jiān)測抗結(jié)核治療效果的生物標志物。

為了進一步驗證獲得的最佳臨界值是否可以作為用藥前后治療效果的評價指標，本研究分別以獲得的最佳臨界值為參照標準，發(fā)現(xiàn)了部分具有陽性意義結(jié)果的截點，如治療1～2個月的血清IFN-γ和治療6個月的血清TNF-α高于界值的陽性者均較治療前有明顯降低，說明最佳臨界值可以作為用藥前后治療效果的評價界值。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)了血清TNF-α和IFN-γ水平在治療過程中的動態(tài)變化差異，二者作為監(jiān)測抗結(jié)核治療的生物標志物可能具有一定意義，如從治療前到整個治療結(jié)束，TNF-α和IFN-γ水平在抗結(jié)核治療初期下降后，在治療后期均有不同程度的升高，這些不同的動態(tài)變化在其他研究中亦有觀察到[25-27]，這可能與患者處于不同的感染和治療狀態(tài)、檢測細胞因子技術(shù)方法不同相關(guān)。同時，這些結(jié)果表明在治療后期，包括IFN-γ在內(nèi)的一些免疫因子和免疫功能可能會以某種方式恢復(fù)。但本研究也有其局限性：首先，本研究僅入組了67例患者，樣本量較小，可能導致有統(tǒng)計學差異的因素未被發(fā)現(xiàn)；其次，因確診肺結(jié)核患者無法設(shè)立不使用抗結(jié)核方案的對照組，故無法對抗結(jié)核方案干預(yù)與細胞因子水平進行因果關(guān)系分析，僅對血清TNF-α和IFN-γ水平動態(tài)變化進行相關(guān)性分析，以及對抗結(jié)核治療效果進行可能的推測作用，未來還需要有更多的臨床研究來驗證其監(jiān)測治療過程的臨床意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻聶文娟和石文卉：負責醞釀和設(shè)計實驗，實施研究，采集數(shù)據(jù)，分析解釋數(shù)據(jù)，起草文章，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，統(tǒng)計分析和獲取研究經(jīng)費；劉佩英、楊揚、王雋、王慶楓：負責實施研究，采集數(shù)據(jù)，分析解釋數(shù)據(jù)和起草文章；初乃惠：負責醞釀和設(shè)計實驗，對文章的知識性內(nèi)容作批評性審閱，行政、技術(shù)或材料支持，指導和支持性貢獻