聶文娟 石文卉 劉佩英 楊揚(yáng) 王雋 王慶楓 初乃惠

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌感染引起的慢性疾病，目前仍然是世界許多地區(qū)負(fù)擔(dān)最重的傳染病之一[1]。為監(jiān)測(cè)結(jié)核病活動(dòng)程度，臨床上已將血紅細(xì)胞沉降率和C反應(yīng)蛋白等炎性標(biāo)志物與胸部影像學(xué)檢查、細(xì)菌負(fù)荷試驗(yàn)等聯(lián)合使用[2]，但這些生物標(biāo)記物特異性較差，且易受患者炎癥水平和健康狀況的雙重影響。

既往研究發(fā)現(xiàn)，宿主T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在結(jié)核病發(fā)病機(jī)制中起著重要作用，同時(shí)也對(duì)分枝桿菌提供免疫保護(hù)，分枝桿菌抗原激活免疫系統(tǒng)與細(xì)胞因子水平升高密切相關(guān)。在這些研究中，部分細(xì)胞因子包括腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細(xì)胞介素4(IL-4)、可溶性白細(xì)胞介素受體(sIL-2R)和γ-干擾素(IFN-γ)等已被認(rèn)為可能與患者體內(nèi)免疫激活狀態(tài)相關(guān)，且這些研究均為評(píng)價(jià)血清細(xì)胞因子水平，而并非經(jīng)體外抗原刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞的方法，操作過(guò)程更簡(jiǎn)便，可能成為疾病診斷和治療過(guò)程中的生物標(biāo)志物[3-4]，但許多評(píng)估此類(lèi)方法的研究并未能證明其在臨床環(huán)境中的使用是否合理[5-6]，因此，這些方法的價(jià)值仍存在爭(zhēng)議?；诖?，筆者希望通過(guò)監(jiān)測(cè)活動(dòng)性肺結(jié)核患者血清中細(xì)胞因子水平，并將其與臨床病程進(jìn)行相關(guān)性分析，以探索其監(jiān)測(cè)結(jié)核病活動(dòng)程度和抗結(jié)核治療效果的意義。

對(duì)象和方法

一、研究對(duì)象

采用前瞻性隊(duì)列研究方法，參照入組標(biāo)準(zhǔn)從2017年12月至2019年6月首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院收治的75例新診斷活動(dòng)性肺結(jié)核患者中納入67例患者作為研究對(duì)象。其中，男性43例(64.2%)，女性24例(35.8%)；<50歲18例(26.9%)，≥50歲49例(73.1%)；無(wú)空洞37例(55.2%)，有空洞30例(44.8%)；有呼吸道癥狀(如發(fā)熱、咳嗽、咳痰或胸痛等)者31例(46.3%)；痰抗酸染色涂片細(xì)菌負(fù)荷分級(jí)為陰性、+、++、+++、++++者分別為4例(6.0%)、26例(38.8%)、23例(34.3%)、10例(14.9%)、4例(6.0%)，所有痰涂片陽(yáng)性患者痰培養(yǎng)均陽(yáng)性。本研究經(jīng)首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京胸科醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(2016年臨審第02-01號(hào))。

納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)痰液或支氣管肺泡灌洗液分枝桿菌培養(yǎng)陽(yáng)性及分子或表型藥物敏感性試驗(yàn)確診為肺結(jié)核的患者；(2)年齡范圍為18～65歲；(3)胸部CT顯示伴有肺部病變，可有或無(wú)空洞；(4)糖化血紅蛋白低于6.0%；(5)均自愿參與本研究并簽署知情同意書(shū)。

排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)既往抗結(jié)核治療>30 d者；(2)目前正在接受包括糖皮質(zhì)激素等影響免疫功能藥物治療者；(3)合并免疫性疾病或免疫系統(tǒng)異常人群，或出現(xiàn)其他影響免疫狀態(tài)的合并癥，如肝功能損傷、類(lèi)赫氏反應(yīng)等；(4)合并糖尿病者；(5)耐藥結(jié)核病患者。

二、研究方法

1.相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)：在抗結(jié)核治療前、治療過(guò)程中每1～2個(gè)月和治療結(jié)束時(shí)(即治療第6個(gè)月左右)采集血樣。使用2 ml離心管收集血液樣本，800×g離心10 min后分離血清，處理后于-70 ℃下儲(chǔ)存，直至使用，避免重復(fù)凍融循環(huán)。采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒檢測(cè)細(xì)胞因子TNF-α、IL-4、sIL-2R和IFN-γ水平，重復(fù)2次。將黏附的細(xì)胞上清液或標(biāo)準(zhǔn)物添加到抗細(xì)胞因子單克隆抗體涂層微量滴定板中，再添加針對(duì)細(xì)胞因子分子第2表位的酶結(jié)合抗細(xì)胞因子單克隆抗體進(jìn)行培養(yǎng)和洗滌，去除未結(jié)合的抗體后添加底物，讀取490 nm處吸光度值。標(biāo)準(zhǔn)曲線由使用細(xì)胞因子標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行的ELISA繪制，用于量化實(shí)驗(yàn)樣本中的細(xì)胞因子水平。實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

2.治療隨訪：在治療開(kāi)始前和治療后的6個(gè)月期間進(jìn)行患者的診斷、治療、不良反應(yīng)處理等隨訪。使用抗結(jié)核藥物包括異煙肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺?；颊呷朐?周后開(kāi)始抗結(jié)核治療，以確保治療依從性，并要求出院后至少每月能夠返回醫(yī)院1次。治療開(kāi)始時(shí)收集痰液以進(jìn)行涂片和培養(yǎng)，治療過(guò)程中到治療結(jié)束時(shí)每月行痰培養(yǎng)，每3個(gè)月進(jìn)行1次胸部CT檢查。出現(xiàn)不良反應(yīng)的患者被要求每周或每15 d復(fù)查，或根據(jù)病情嚴(yán)重程度判定是否入院治療。治療的第一個(gè)月有58例(86.6%)患者痰培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)，第二個(gè)月所有患者痰培養(yǎng)均陰轉(zhuǎn)，且治療結(jié)束后均治愈。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

使用SPSS 24.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。非正態(tài)分布的計(jì)量資料以“中位數(shù)(四分位數(shù))[M(Q1，Q3)]”描述。治療過(guò)程中細(xì)胞因子水平變化與治療時(shí)間的關(guān)系采用線性趨勢(shì)檢驗(yàn)，用于評(píng)估血清中各細(xì)胞因子水平在監(jiān)測(cè)結(jié)核病治療進(jìn)展中的價(jià)值，同時(shí)對(duì)各細(xì)胞因子治療前的基線血清水平值、治療1～2個(gè)月和6個(gè)月時(shí)的水平值進(jìn)行受試者工作特征曲線(ROC)分析，以確定最佳臨界值，再以最佳臨界值為參照標(biāo)準(zhǔn)，將高于最佳臨界值者視為陽(yáng)性者，以預(yù)測(cè)各指標(biāo)水平的診斷效能。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、治療過(guò)程中血清細(xì)胞因子水平(表1)

1.治療過(guò)程中血清TNF-α水平：治療前血清TNF-α水平與治療后6個(gè)月水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=33.421，P=0.002)，但與治療1～2個(gè)月后的水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=21.375，P=0.327)。

2.治療過(guò)程中血清IL-4水平：治療前血清IL-4水平與治療1～2個(gè)月和治療6個(gè)月水平的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=32.136，P=0.232；χ2=39.158，P=0.529)，且治療1～2個(gè)月與治療6個(gè)月的水平差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=35.831，P=0.525)。

3.治療過(guò)程中血清sIL-2R水平：治療前血清sIL-2R水平與治療1～2個(gè)月水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=15.276，P=0.036)，與治療6個(gè)月水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.613，P=0.982)，且治療1～2個(gè)月水平與治療6個(gè)月水平的差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=11.914，P=0.085)。

4.治療過(guò)程中血清IFN-γ水平：治療前血清IFN-γ水平與治療1～2個(gè)月水平的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.111，P=0.000)，與治療6個(gè)月水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.212,P=0.073)，且治療1～2個(gè)月水平與治療6個(gè)月水平差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=29.903，P=0.642)。

二、各細(xì)胞因子的ROC曲線分析

對(duì)有差異的血清TNF-α、IFN-γ和sIL-2R三種細(xì)胞因子進(jìn)行ROC曲線分析。結(jié)果顯示：當(dāng)血清TNF-α水平為845.2 pg/ml時(shí)，其檢測(cè)敏感度為51.2%、特異度為60.0%，曲線下最大面積(AUC)為0.594(P=0.013)(圖1)，即845.2 pg/ml為其最佳臨界值。當(dāng)血清sIL-2R水平為15.0 pg/ml時(shí)，其檢測(cè)敏感度為61.5%、特異度為55.2%，AUC為0.597(P=0.054)(圖2)，即15.0 pg/ml為其最佳臨界值。當(dāng)血清IFN-γ水平為393.3 pg/ml時(shí)，其檢測(cè)敏感度為60.0%、特異度為64.2%，AUC為0.651(P=0.017)(圖3)，即393.3 pg/ml為其最佳臨界值。

表1 治療前后血清TNF-α、IL-4、sIL-2R和INF-γ水平

圖1～3 分別為治療前、治療1～2個(gè)月和治療后6個(gè)月血清TNF-α、sIL-2R和IFN-γ水平的ROC曲線分析

表2 67例患者以不同細(xì)胞因子最佳臨界值為參照標(biāo)準(zhǔn)在不同時(shí)間的陽(yáng)性率情況

三、各細(xì)胞因子在結(jié)核病治療中的預(yù)測(cè)作用

以最佳臨界值為參照標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)67例受試者中，治療前血清IFN-γ和TNF-α水平高于其最佳臨界值者(陽(yáng)性者)分別有43例(64.2%)和34例(50.7%)；治療1～2個(gè)月后，血清IFN-γ水平陽(yáng)性者為14例(20.9%)，較治療前明顯降低(χ2=34.634，P=0.000)；治療6個(gè)月后，血清TNF-α水平陽(yáng)性者為19例(28.4%)，也較治療前明顯降低(χ2=53.181，P=0.013)，見(jiàn)表2。

討 論

結(jié)核分枝桿菌感染人體后的進(jìn)展主要取決于結(jié)核分枝桿菌與宿主防御系統(tǒng)的對(duì)峙，此時(shí)宿主細(xì)胞免疫因子充當(dāng)信使，在對(duì)抗病原體入侵過(guò)程中幫助整合免疫系統(tǒng)，其中細(xì)胞因子在結(jié)核病發(fā)病過(guò)程中受到宿主不同狀態(tài)的影響，因此需要了解結(jié)核病患者治療期間的免疫功能變化，以便為免疫學(xué)診斷、治療和監(jiān)測(cè)提供理論基礎(chǔ)。本研究比較了血清細(xì)胞因子在宿主不同治療階段下的動(dòng)態(tài)水平，并根據(jù)治療時(shí)間進(jìn)行分層分析。

Ⅰ型細(xì)胞因子是指由細(xì)胞產(chǎn)生的具有生物活性的蛋白類(lèi)物質(zhì)細(xì)胞因子的統(tǒng)稱，尤其是TNF-α，在結(jié)核分枝桿菌感染過(guò)程中至關(guān)重要，也是疾病進(jìn)展的主要參與者[7]，高水平的TNF-α可能促進(jìn)肉芽腫發(fā)展、感染和病灶進(jìn)展[8]。既往研究發(fā)現(xiàn)，治療后TNF-α水平的降低程度與結(jié)核病的良好預(yù)后密切相關(guān)[9]，故檢測(cè)其治療前后水平的下降情況可以監(jiān)測(cè)抗結(jié)核治療的療效[10-12]，若顯著降低則可能成為預(yù)測(cè)治療效果的潛在生物標(biāo)志物。進(jìn)一步通過(guò)ROC曲線分析獲得最佳臨界值可作為生物標(biāo)志物用于結(jié)核病治療的評(píng)估手段[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，本組患者治療6個(gè)月后血清TNF-α水平顯著降低(P=0.002)，且AUC為0.594(P=0.013)，提示血清TNF-α可能作為預(yù)測(cè)結(jié)核病治療效果的標(biāo)志物。

IL-4為調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子，通過(guò)調(diào)節(jié)TNF-α活性等參與調(diào)控感染免疫反應(yīng)。IL-4在結(jié)核病進(jìn)展中的作用存在爭(zhēng)議，部分研究認(rèn)為結(jié)核分枝桿菌感染后產(chǎn)生的IL-4可能下調(diào)免疫反應(yīng)，這種細(xì)胞因子的過(guò)度產(chǎn)生可能導(dǎo)致感染控制下調(diào)[13]；且有部分研究發(fā)現(xiàn)伴有空洞患者的IL-4水平更高[14]。同時(shí)在其他研究中發(fā)現(xiàn)，IL-4可能促進(jìn)結(jié)核病進(jìn)展，或作為疾病活動(dòng)的標(biāo)志物發(fā)揮其被動(dòng)作用[15]。但在對(duì)肺結(jié)核患者治療前后的IL-4水平評(píng)估后，部分研究認(rèn)為其水平變化無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而部分研究認(rèn)為治療前后IL-4水平升高[16-17]。本研究雖然觀察到治療后血清IL-4水平有所降低，但比較不同治療時(shí)間和進(jìn)行ROC曲線分析后均未發(fā)現(xiàn)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故本研究結(jié)果不支持血清IL-4水平作為監(jiān)測(cè)治療效果的生物標(biāo)志物。

細(xì)胞因子sIL-2R可在絲裂原或抗原激活T淋巴細(xì)胞培養(yǎng)上清中檢測(cè)到，結(jié)核病患者sIL-2R水平升高表明T淋巴細(xì)胞活化程度較高，與疾病進(jìn)程可能相關(guān)[18]。既往研究發(fā)現(xiàn)，血清sIL-2R水平變化可能與抗結(jié)核療效相關(guān)，治療后其水平顯著降低[1,18]。本研究也觀察到血清IL-2R水平治療前與治療后1～2個(gè)月的顯著變化，但通過(guò)ROC曲線分析后，發(fā)現(xiàn)變化結(jié)果并不顯著，故仍需更多臨床研究以證明sIL-2R是否可作為監(jiān)測(cè)結(jié)核分枝桿菌感染狀態(tài)和治療效果的生物標(biāo)志物。

IFN-γ由活化的CD4+T淋巴細(xì)胞釋放，是保護(hù)性抗結(jié)核免疫反應(yīng)的關(guān)鍵成分。既往研究認(rèn)為IFN-γ可用于監(jiān)測(cè)抗結(jié)核治療的效果，即有效的抗結(jié)核治療后血清IFN-γ的水平是降低的[19-21]，但也有部分研究認(rèn)為成功治療后的IFN-γ水平無(wú)顯著變化，或者只有輕微變化[22-24]。本研究發(fā)現(xiàn)，對(duì)于最終獲得治療成功的患者，治療1～2個(gè)月后血清IFN-γ較治療前顯著降低，據(jù)此推測(cè)血清IFN-γ水平可能可以作為監(jiān)測(cè)抗結(jié)核治療效果的生物標(biāo)志物。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證獲得的最佳臨界值是否可以作為用藥前后治療效果的評(píng)價(jià)指標(biāo)，本研究分別以獲得的最佳臨界值為參照標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)了部分具有陽(yáng)性意義結(jié)果的截點(diǎn)，如治療1～2個(gè)月的血清IFN-γ和治療6個(gè)月的血清TNF-α高于界值的陽(yáng)性者均較治療前有明顯降低，說(shuō)明最佳臨界值可以作為用藥前后治療效果的評(píng)價(jià)界值。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)了血清TNF-α和IFN-γ水平在治療過(guò)程中的動(dòng)態(tài)變化差異，二者作為監(jiān)測(cè)抗結(jié)核治療的生物標(biāo)志物可能具有一定意義，如從治療前到整個(gè)治療結(jié)束，TNF-α和IFN-γ水平在抗結(jié)核治療初期下降后，在治療后期均有不同程度的升高，這些不同的動(dòng)態(tài)變化在其他研究中亦有觀察到[25-27]，這可能與患者處于不同的感染和治療狀態(tài)、檢測(cè)細(xì)胞因子技術(shù)方法不同相關(guān)。同時(shí)，這些結(jié)果表明在治療后期，包括IFN-γ在內(nèi)的一些免疫因子和免疫功能可能會(huì)以某種方式恢復(fù)。但本研究也有其局限性：首先，本研究?jī)H入組了67例患者，樣本量較小，可能導(dǎo)致有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異的因素未被發(fā)現(xiàn)；其次，因確診肺結(jié)核患者無(wú)法設(shè)立不使用抗結(jié)核方案的對(duì)照組，故無(wú)法對(duì)抗結(jié)核方案干預(yù)與細(xì)胞因子水平進(jìn)行因果關(guān)系分析，僅對(duì)血清TNF-α和IFN-γ水平動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行相關(guān)性分析，以及對(duì)抗結(jié)核治療效果進(jìn)行可能的推測(cè)作用，未來(lái)還需要有更多的臨床研究來(lái)驗(yàn)證其監(jiān)測(cè)治療過(guò)程的臨床意義。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)聶文娟和石文卉：負(fù)責(zé)醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，分析解釋數(shù)據(jù)，起草文章，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，統(tǒng)計(jì)分析和獲取研究經(jīng)費(fèi)；劉佩英、楊揚(yáng)、王雋、王慶楓：負(fù)責(zé)實(shí)施研究，采集數(shù)據(jù)，分析解釋數(shù)據(jù)和起草文章；初乃惠：負(fù)責(zé)醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，對(duì)文章的知識(shí)性內(nèi)容作批評(píng)性審閱，行政、技術(shù)或材料支持，指導(dǎo)和支持性貢獻(xiàn)