孫雯娜 張俊仙 張秀爽 王曉朦 林文 梁艷 王杰 吳雪瓊

早診斷、早治療是預(yù)防和控制耐藥結(jié)核病傳播的重要手段[1]。目前，我國臨床常用的結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)方法主要有兩種：表型藥敏試驗(yàn)和分子藥敏試驗(yàn)。表型藥敏試驗(yàn)作為MTB耐藥性檢測的標(biāo)準(zhǔn)，可檢測多種一、二線抗結(jié)核藥物的敏感性及耐藥程度；而分子藥敏試驗(yàn)可快速檢測MTB耐藥相關(guān)基因的突變，目前已在我國上市的主要有反向雜交技術(shù)、基因芯片法(簡稱“芯片法”)[2]、實(shí)時熒光定量PCR法(GeneXpert MTB/RIF)[3]、熒光定量PCR探針熔解曲線法(簡稱“熔解曲線法”)[4]，以及基因測序技術(shù)等[5]。筆者以表型藥敏試驗(yàn)絕對濃度法檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，比較芯片法和熔解曲線法直接檢測臨床標(biāo)本中MTB耐藥性的診斷效能，評價其臨床應(yīng)用價值。

資料和方法

一、研究材料

選取中國人民解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心結(jié)核病醫(yī)學(xué)部結(jié)核科住院且確診為結(jié)核病的44例患者的臨床樣本。其中，痰標(biāo)本29例，支氣管肺泡灌洗液13例，頸部淋巴結(jié)結(jié)核膿液標(biāo)本1例，骨關(guān)節(jié)結(jié)核組織標(biāo)本1例。每例樣本同時分為2份，1份進(jìn)行傳統(tǒng)的分枝桿菌培養(yǎng)、菌種鑒定和表型藥敏試驗(yàn)，另1份提取核酸后進(jìn)行耐藥基因芯片檢測，以及熔解曲線法耐藥性檢測。

二、儀器與試劑

改良羅氏培養(yǎng)基、對硝基苯甲酸(PNB)、噻吩-2羧酸肼(TCH)，以及表型藥敏試驗(yàn)絕對濃度法利福平(RFP)、異煙肼(INH)、左氧氟沙星(Lfx)含藥培養(yǎng)基購自珠海銀科醫(yī)學(xué)工程股份有限公司；核酸提取試劑、晶芯ExtractorTM36 核酸快速提取儀、結(jié)核分枝桿菌耐藥基因芯片檢測試劑盒和晶芯微陣列芯片雜交掃描系統(tǒng)為博奧生物集團(tuán)有限公司產(chǎn)品；MTB的RFP、INH和Lfx藥物熒光定量PCR探針熔解曲線法耐藥性檢測試劑盒、實(shí)時熒光定量PCR儀(SLAN-96S型)及熔解曲線分析軟件為廈門致善生物科技股份有限公司產(chǎn)品。

三、試驗(yàn)方法

1. 分枝桿菌培養(yǎng)、菌種鑒定和表型藥敏試驗(yàn)：對臨床標(biāo)本進(jìn)行處理后，接種于改良羅氏培養(yǎng)基，置37 ℃進(jìn)行分枝桿菌培養(yǎng)。分枝桿菌培養(yǎng)陽性的分離株經(jīng)PNB和TCH含藥培養(yǎng)基進(jìn)行鑒別培養(yǎng)，鑒定為MTB后進(jìn)行表型藥敏試驗(yàn)絕對濃度法。以上實(shí)驗(yàn)步驟按照《結(jié)核病實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[6]進(jìn)行。INH、RFP和Lfx等3種含藥培養(yǎng)基低、高濃度分別為(1，10) μg/ml、(50，250) μg/ml和(1，10) μg/ml，在對照培養(yǎng)基生長良好的前提下，低濃度含藥培養(yǎng)基上菌落數(shù)大于20個即判定為耐藥。

2. DNA制備：臨床標(biāo)本經(jīng)液化和洗滌處理后，采用晶芯ExtractorTM36 核酸快速提取儀和核酸提取試劑，按照說明書進(jìn)行DNA提取，然后置于-20 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

3. 耐藥基因芯片檢測：將提取好的核酸應(yīng)用結(jié)核分枝桿菌耐藥基因芯片檢測試劑盒，按照說明書進(jìn)行RFP和INH耐藥基因檢測，將芯片載入晶芯微陣列芯片掃描儀自動判讀結(jié)果。該芯片檢測MTB的RFPrpoB基因6個位點(diǎn)、13種突變基因型；檢測MTB的INHkatG基因315位2種突變類型和inhA基因啟動子-15位C→T突變基因型。

4. 熔解曲線法耐藥性檢測：將提取好的核酸應(yīng)用熒光定量PCR探針熔解曲線試劑盒，按照說明書進(jìn)行MTB對RFP、INH和Lfx耐藥性檢測，該方法檢測MTB的RFPrpoB507～534核心區(qū)位點(diǎn)的突變情況；檢測MTB的INHkatG315密碼子、inhA94密碼子、inhA啟動子區(qū)(-17～8位點(diǎn))以及ahpC啟動子區(qū)(-44～-30及-15～3位點(diǎn))的突變情況；檢測MTB的LfxgyrA88～94位密碼子突變。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

用SPSS 24.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。以表型藥敏試驗(yàn)絕對濃度法為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算芯片法和熔解曲線法的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度和Kappa值。Kappa值介于0.41～0.60時為兩者之間有較好一致性，介于0.61～0.80時為高度一致；介于0.81～1.00時為完全一致。

結(jié) 果

一、絕對濃度法藥敏試驗(yàn)

表型藥敏試驗(yàn)絕對濃度法結(jié)果顯示，44株MTB臨床分離株中，RFP高水平耐藥14例，低水平耐藥2例，敏感28例；INH高水平耐藥3例，低水平耐藥11例，敏感30例；Lfx高水平耐藥17例，低水平耐藥3例，敏感24例。

二、芯片法耐藥性檢測

應(yīng)用芯片法直接檢測44例臨床標(biāo)本對MTB的耐藥性，結(jié)果顯示，RFP耐藥15例，其中531位密碼子TCG→TTG突變10例，526位密碼子 CAC→TAC突變1例，531位密碼子TCG→TGG突變1例，533位密碼子CTG→CCG突變1例，511位密碼子CTG→CCG突變1例，526位密碼子CAC→CGC突變1例；RFP敏感29例。INH耐藥13例，其中katG315位密碼子AGC→ACC突變9例，inhA-15堿基 C→T 突變3例，katG315位密碼子AGC→ACC 合并inhA-15堿基 C→T聯(lián)合突變 1例；INH敏感31例。

三、探針熔解曲線法耐藥性檢測

應(yīng)用熔解曲線法直接檢測44例臨床標(biāo)本中MTB的耐藥性，結(jié)果顯示，RFP耐藥17例，其中529～533位點(diǎn)突變12例，521～528位點(diǎn)突變1例，513～520位點(diǎn)突變1例，507～512、513～520、521～528多位點(diǎn)突變1例；檢測出耐藥但突變位點(diǎn)不明確2例；敏感27例。INH耐藥17例，katG315位點(diǎn)突變12例，inhA啟動子區(qū)突變3例，ahpC啟動子區(qū)突變1例，ahpC啟動子區(qū)合并inhA啟動子區(qū)突變1例；敏感27例。Lfx耐藥17例，均在gyrA基因88～94位密碼子區(qū)域，敏感27例。

四、三種藥敏試驗(yàn)方法的比較

以絕對濃度法藥敏試驗(yàn)檢測結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，芯片法和熔解曲線法檢測RFP、INH和Lfx耐藥的敏感度、特異度、準(zhǔn)確度和Kappa值見表1和表2，檢測結(jié)果見表3～5。

以芯片法和熔解曲線法檢測RFP的耐藥性，有6例結(jié)果不一致，符合率為86.4%(38/44)，4例為芯片法敏感、熔解曲線法耐藥，2例為芯片法耐藥、熔解曲線法敏感；在檢測INH耐藥性時，有4例結(jié)果不一致，符合率為90.9%(40/44)。

從表3可以看出，RFP耐藥大多數(shù)是高水平耐藥(87.5%，14/16)，而且主要位于531位密碼子(78.6%，11/14)和526位密碼子(7.1%，1/14)。表4顯示，INH耐藥大多數(shù)是低水平耐藥(78.6%，11/14)，主要位于katG315位密碼子(63.6%，7/11)，少數(shù)位于inhA-15位堿基(18.2%，2/11)。

本研究中共檢測出3例INH高水平耐藥，其中katG315位密碼子和inhA-15位堿基雙位點(diǎn)聯(lián)合突變1例，katG315位密碼子突變2例。

表1 以絕對濃度法藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)判斷芯片法對結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測的效能

表2 以絕對濃度法藥敏試驗(yàn)為標(biāo)準(zhǔn)判斷熔解曲線法對結(jié)核分枝桿菌耐藥性檢測的效能

表3 三種藥敏試驗(yàn)方法檢測臨床標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌對利福平的耐藥性 [突變情況(例)]

表4 三種藥敏試驗(yàn)方法檢測臨床標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌對異煙肼的耐藥性 [突變情況(例)]

表5 二種藥敏試驗(yàn)方法檢測臨床標(biāo)本中結(jié)核分枝桿菌對左氧氟沙星的耐藥性 [突變情況(例)]

討 論

我國是耐藥結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一。目前在我國臨床上應(yīng)用的MTB分子藥敏診斷方法主要有GeneXpert MTB/RIF、芯片法和探針熔解曲線法。本研究以傳統(tǒng)的絕對濃度法藥敏試驗(yàn)為對照，比較芯片法和探針熔解曲線法檢測MTB耐藥性的診斷效能。

一、診斷效能研究

本研究應(yīng)用芯片法和探針熔解曲線法直接檢測臨床標(biāo)本中MTB對RFP、INH和Lfx的耐藥性，敏感度均在85%以上，芯片法檢測RFP和INH的耐藥性均具有較高的特異度(96%)，與相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相似[7-8]；而探針熔解曲線法檢測RFP和INH的特異度雖然均超過80%，低于目前大多數(shù)的文獻(xiàn)報(bào)道[7，9]，但是也基本能滿足臨床耐藥結(jié)核病快速診斷的需求。

二、芯片法和熔解曲線法不一致的原因

本研究結(jié)果顯示，芯片法和熔解曲線法檢測RFP的耐藥性，有6例結(jié)果不一致，符合率為86.4%；檢測INH耐藥性，有4例結(jié)果不一致，符合率為90.9%。芯片法和熔解曲線法檢測RFP和INH耐藥性的敏感度相同，但芯片法檢測的特異度和準(zhǔn)確度均高于熔解曲線法。分析其原因可能是：(1)熔解曲線法較芯片法檢測覆蓋的突變位點(diǎn)更廣泛，用來檢測豐度低的異質(zhì)性耐藥樣本時可能占有更多優(yōu)勢，但某些與耐藥無關(guān)的密碼子(如507～509、517、523、532位)突變也能被檢出[10-11]；(2)本研究中兩種分子生物學(xué)方法均是直接檢測臨床樣本中提取的MTB DNA模板，可能受核酸提取方法、提取效率、DNA純度及標(biāo)本中耐藥異質(zhì)性、抑制因子的影響，導(dǎo)致與其他文獻(xiàn)報(bào)道的檢測分離株的分子藥敏試驗(yàn)方法結(jié)果的差異；(3)本研究表型藥敏試驗(yàn)使用的是絕對濃度法，與其他研究中使用的對照方法(如比例法藥敏試驗(yàn)、BACTEC MGIT 960藥敏試驗(yàn))不同，在結(jié)果上可能存在一定的差異；(4)研究所納入的樣本類型不同，本研究的研究對象包括了肺結(jié)核和肺外結(jié)核患者的標(biāo)本，而上述報(bào)道是以肺結(jié)核標(biāo)本為研究材料，結(jié)果可能會存在一定差異；(5)由這些基因其他區(qū)域或其他耐藥相關(guān)基因引起的突變，以及其他耐藥機(jī)制引起的耐藥，應(yīng)用這兩種分子藥敏試驗(yàn)方法不能檢出，也可能是導(dǎo)致分子藥敏試驗(yàn)敏感度低于表型藥敏試驗(yàn)的原因[12]。

三、耐藥基因突變與耐藥水平的關(guān)系

從表2可以看出，RFP耐藥大多數(shù)是高水平耐藥(87.5%)，而且主要位于531位密碼子(78.6%)和526位密碼子(7.1%)，與目前研究結(jié)果一致，提示臨床結(jié)核病患者一旦出現(xiàn)RFP耐藥，大多數(shù)患者治療效果不佳，需停用利福霉素類藥物，更換有效的化療方案。表3顯示，INH耐藥大多數(shù)是低水平耐藥(78.6%)，主要位于katG315位密碼子(63.6%)，少數(shù)位于inhA-15位堿基(18.2%)，且這些低水平耐藥在傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)方法中不易被檢出，通常表現(xiàn)為敏感；少數(shù)患者katG315位密碼子和inhA-15位堿基雙位點(diǎn)聯(lián)合突變會導(dǎo)致高水平耐藥，本研究中共檢測出3例INH高水平耐藥，其中katG315位密碼子和inhA-15位堿基雙位點(diǎn)聯(lián)合突變1例(1/3)，katG315位密碼子突變2例(2/3)，這些結(jié)果與劉銀萍等[13]的研究結(jié)果一致，與Rivière等[14]的結(jié)果不同，分析其原因如下：(1)katG315位密碼子突變只是導(dǎo)致過氧化氫酶和過氧化物酶活性降低，使INH轉(zhuǎn)換為異煙酸的能力降低[15-16]，不同菌株的最低抑菌濃度差異很大，因此，傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)時可能表現(xiàn)為低、中、高水平耐藥或藥物敏感，使得不同研究報(bào)道的結(jié)果存在差異[17]。本研究使用絕對濃度法顯示的低水平耐藥，也有可能與絕對濃度法選取的臨界濃度較高有關(guān)[18]，提示臨床應(yīng)根據(jù)藥物最低抑菌濃度結(jié)果決定調(diào)整INH的劑量或停用INH；(2)結(jié)核分枝桿菌inhA-15位堿基突變也通常導(dǎo)致INH低、中水平耐藥[13, 19]；(3)本研究選取的作為對照的表型藥敏試驗(yàn)方法為絕對濃度法，僅選取2個藥物濃度作為對照，而Rivière等[14]參照的是藥物最低抑菌濃度法，具備多種濃度梯度的檢測結(jié)果，因此在耐藥程度的判斷上可能會有一定差異，造成研究結(jié)果的不一致。Lfx耐藥大多數(shù)是高水平耐藥(94.1%)，均由gyrA88～94位密碼子突變所致(100.0%)；這與文獻(xiàn)報(bào)道一致[20]。本研究中3例樣本Lfx表型藥敏試驗(yàn)顯示耐藥，而分子藥敏試驗(yàn)檢測為敏感，可能的原因是：(1)可能存在異質(zhì)性耐藥，分子生物學(xué)方法通常只能檢測豐度高于20%的耐藥結(jié)核分枝桿菌，從而造成部分低豐度耐藥樣本漏檢；(2)熔解曲線法針對氟喹諾酮類藥物耐藥基因gyrA88～94密碼子的突變狀況進(jìn)行檢測，由其他基因(如gyrB)或gyrA基因其他區(qū)域引起的突變，以及其他氟喹諾酮類藥物耐藥機(jī)制引起的耐藥，本試驗(yàn)不能檢出。

本次研究所選取的作為對比的傳統(tǒng)藥敏試驗(yàn)方法為絕對濃度法，與標(biāo)準(zhǔn)方法——比例法結(jié)果可能存有一定差異。此外，本研究只檢測了44例患者的樣本，樣本量偏少，且未對不一致樣本使用測序方法進(jìn)行驗(yàn)證，因此也存在一定的局限性。

總之，傳統(tǒng)的絕對濃度法藥敏試驗(yàn)可檢出多種藥物不同程度的耐藥情況，但需較長的時間，不能滿足臨床早期診斷的需求；芯片法在檢測RFP和INH時具有較高的特異度和一致性，熔解曲線法在檢測Lfx耐藥性時表現(xiàn)出了較好的效能，且操作更為簡便和快速。兩種分子藥敏試驗(yàn)方法均可早期、快速檢出耐藥MTB，指導(dǎo)臨床合理用藥和開展有效治療。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突

作者貢獻(xiàn)孫雯娜和張俊仙：醞釀和設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，論文撰寫和修改；張秀爽、王曉朦和林文：實(shí)施研究并收集整理數(shù)據(jù)；梁艷：行政、技術(shù)支持；王杰：數(shù)據(jù)錄入；吳雪瓊：獲取研究經(jīng)費(fèi)，技術(shù)和材料支持，文章修改和指導(dǎo)