李登高 林 睿 穆青慧 周 娜 張焱如 白 薇

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018）

NPR1（non-expressor of pathogenesis-related genes 1）又稱為NIM1或SAI1，最早被發(fā)現(xiàn)在植物的抗病防衛(wèi)系統(tǒng)獲得抗性（systemic acquired resistance，SAR）和誘導(dǎo)獲得抗性（induced systemic resistance，ISR）中起重要作用，能夠介導(dǎo)水楊酸（salicylic acid，SA）和茉莉酸/乙烯（jasmonic acid/ethylene，JA/ET）反應(yīng)的交叉對(duì)話。NPR1 通常以寡聚體的形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，病原菌的侵染會(huì)使得植物體內(nèi)SA含量升高，引起細(xì)胞內(nèi)氧化還原狀態(tài)發(fā)生改變，導(dǎo)致NPR1 解離成單體進(jìn)入細(xì)胞核中，激活TGA轉(zhuǎn)錄因子，誘導(dǎo)（-）基因大量表達(dá)，啟動(dòng)防御反應(yīng)。近些年的研究發(fā)現(xiàn)NPR1除了在響應(yīng)生物脅迫方面發(fā)揮作用外，還參與了植物對(duì)非生物脅迫的響應(yīng)，目前的研究表明NPR1在抵抗鹽脅迫、氧化脅迫、干旱脅迫和低溫脅迫的過程中也發(fā)揮重要作用。同時(shí)還有研究發(fā)現(xiàn)NPR1參與調(diào)控夜晚的生物鐘基因（timing of CAB2 expression 1，TOC1）和早上的生物鐘基因（late elongated hypocotyl，LHY）的表達(dá)，NPR1 通過調(diào)節(jié)抗病防御反應(yīng)和晝夜節(jié)律中的互作，平衡植物在免疫反應(yīng)和生長(zhǎng)之間的物質(zhì)及能量調(diào)度。

擬南芥（）的NPR1 蛋白家族有6個(gè)成員，根據(jù)系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示可分為3個(gè)分支，第1分支包含AtNPR1和AtNPR2；第2分支包含AtNPR3 和AtNPR4，第1 分支和第2 分支以正/負(fù)調(diào)控的方式在擬南芥抗病過程中發(fā)揮作用；第3 分支成員包括AtNPR5（又名AtBOP1）和AtNPR6（又名AtBOP2），參與控制葉和花生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控。NPR1 家族蛋白具有的典型結(jié)構(gòu)域是2 個(gè)蛋白與蛋白互作結(jié)構(gòu)域，BTB/POZ（Broad Complex，Tramtrack and Bric a brac/Pox virus and Zinc finger，BTB/POZ）結(jié)構(gòu)域和錨蛋白重復(fù)序列（ankyrin repeats，ANK）。目前的研究認(rèn)為AtNPR1 和AtNPR4 作為SA 的受體在植物免疫反應(yīng)中發(fā)揮廣泛作用。在其他植物中也有關(guān)于NPR1家族蛋白的鑒定挖掘和誘導(dǎo)表達(dá)研究。

馬鈴薯（）是我國(guó)重要的主糧作物之一，由致病疫霉（）導(dǎo)致的晚疫病及干旱、高溫、低溫和鹽脅迫等非生物逆境導(dǎo)致的馬鈴薯減產(chǎn)是制約其產(chǎn)量的重要因素。因此，研究挖掘既能抗病又能抵抗非生物脅迫的基因，對(duì)馬鈴薯抗逆育種的研究具有重要的指導(dǎo)意義。本研究通過克隆馬鈴薯NPR1 家族蛋白中的成員之一的啟動(dòng)子和CDS 序列，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，研究其組織表達(dá)特異性，構(gòu)建由其自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙元表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化馬鈴薯獲得轉(zhuǎn)基因馬鈴薯，進(jìn)一步研究其對(duì)SA、致病疫霉和高鹽脅迫的響應(yīng)，明確其在生物脅迫和非生物脅迫中發(fā)揮的功能。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯雙單倍體測(cè)序品種DM1-3516 R44 由美國(guó)農(nóng)業(yè)部農(nóng)業(yè)研究院（Argriculture Research Service of United States Department of Agriculture，USDA）提供，轉(zhuǎn)化馬鈴薯所用品種底西芮由本試驗(yàn)室MS 培養(yǎng)基快繁保存，培養(yǎng)條件為16 h 光照24 ℃/8 h 黑暗20 ℃。馬鈴薯組織特異性研究所用品種為費(fèi)烏瑞它，盆栽培養(yǎng)。致病疫霉HQK8-3由內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)劉惠榮教授提供。

1.2 方法

根據(jù)馬鈴薯數(shù)據(jù)庫(kù)在線資源（http：//solanaceae.plantbiology.msu.edu）下載馬鈴薯cDNA序列及基因組序列（Sequence ID：XM006366563）。在http：//smart.embl-heidelberg.de 預(yù) 測(cè) 分 析StNPR4 蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)及保守域。利用在線軟件https：//scansite4.mit.edu/4.0/#home 分析StNPR4 蛋白分子質(zhì)量及其等電點(diǎn)信息。在MEGA 7.0 中使用NJ（Neighbor-Joining）方法進(jìn)行Bootstrap，比對(duì)后的序列在http：//www.phylogeny.fr 在線工具中獲取保守序列，1 000 次重復(fù)檢驗(yàn)，生成系統(tǒng)進(jìn)化樹。

在馬鈴薯盆栽苗開花期分別對(duì)根、莖、葉、花組織取樣，液氮速凍，用Trizol 法提取RNA，用DNase（RNase free）去除DNA 并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，反轉(zhuǎn)錄方法按照Tian 等的方法進(jìn)行。以馬鈴薯的cDNA 設(shè)計(jì)上下游引物StNPR4q-F/R（ACTTCTTGAACACTGCATCC/CTAATGACTCCT -GTTCAGT），以基因?yàn)閮?nèi)參（ef1α-3ATTGGAAACGGATATGCTCCA/ef1α-4TCCTTACCTGAACGCCTGTCA），用qRT-PCR 方法分析馬鈴薯基因在不同組織的轉(zhuǎn)錄水平。組織特異性及所有的基因表達(dá)分析qRT-PCR 試驗(yàn)均在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（LightCycler480，美國(guó)）進(jìn)行。

將培養(yǎng)28 d的馬鈴薯DM試管苗用0.67 mmol·LBTH 處理8 h，提取RNA 反轉(zhuǎn)錄成cDNA。以cDNA 為模板PCR 克隆基因。PCR 反應(yīng)條件：98 ℃5 min；94 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃2 min，30 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%質(zhì)量濃度的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，UVP 凝膠成像系統(tǒng)拍照。膠回收純化目的條帶，與pMD19-T載體用T4 DNA 連接酶在16 ℃下連接過夜，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細(xì)胞。經(jīng)PCR 鑒定后篩選陽(yáng)性克隆進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證。

在馬鈴薯數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//solanaceae.plantbiology.msu.edu）中BLAST 得到基因組序列，在起始密碼子上游1 kB 處設(shè)計(jì)上游引物StproNPR4-F （TTCCGCGGACGCATATACTGTTTGGATGCACA）和下游引物StproNPR4-R（TTGGATCCTGGTGCAGGTGCATGTATCA），以基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增基因的啟動(dòng)子序列，PCR 反應(yīng)體系條件及檢測(cè)方法同上，利用酶切克隆的方式構(gòu)建StproNPR4-NPR4-pOREO4 雙元表達(dá)載體（見圖1）。

圖1 StNPR4雙元表達(dá)載體構(gòu)建示意圖Fig.1 Schematic diagram of construction for StNPR4 binary expression vector

將StproNPR4-NPR4-pOREO4 雙元表達(dá)載體電擊轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌（）EHA105感受態(tài)細(xì)胞，將PCR陽(yáng)性菌株擴(kuò)培后與馬鈴薯節(jié)間莖共培養(yǎng)，利用卡那抗性壓力篩選轉(zhuǎn)基因幼苗，待形成的愈傷組織長(zhǎng)出小芽后轉(zhuǎn)移至MS抗性培養(yǎng)基上繼續(xù)培養(yǎng)至生根，快繁擴(kuò)大培養(yǎng)。分別取愈傷長(zhǎng)出的馬鈴薯及野生型對(duì)照提取DNA，利用NF-1（CTGAATGAACTGCAGGACGA）& NF-2（CCAGATCATCCTGATCGACA）為引物擴(kuò)增新霉素轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行轉(zhuǎn)基因馬鈴薯鑒定，延伸時(shí)間為30 s，其余PCR條件同上。

提取轉(zhuǎn)基因馬鈴薯總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以StNPR4q-F/R 為 引 物，以基 因 為 內(nèi) 參（ef1α-3/ef1α-4），進(jìn)行qRT-PCR 擴(kuò)增，分析轉(zhuǎn)基因和野生型對(duì)照的基因轉(zhuǎn)錄水平。qRTPCR 采用TaKaRa TB GreenPremix Ex Taq?Ⅱ試劑盒。反應(yīng)體系為：cDNA 1.0 μL，正向引物0.4 μL，反向引物0.4 μL，TB Green Premix Ex Taq Ⅱ5.0 μL，ddHO；95 ℃10 min；95 ℃10 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，40個(gè)循環(huán)。

用0.67 mmol·L植物激素水楊酸類似物BTH誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和野生型對(duì)照，以上述qRT-PCR方法檢測(cè)BTH 誘導(dǎo)后轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和野生型對(duì)照的基因轉(zhuǎn)錄水平。在150 mmol·L的NaCl MS培養(yǎng)基上分別快繁100棵轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和野生型，檢測(cè)在高鹽脅迫中馬鈴薯的快繁生根率。

將致病疫霉菌餅接種在新鮮的黑麥培養(yǎng)基上，18 ℃，暗培養(yǎng)7～10 d（使疫霉菌擴(kuò)散到整個(gè)培養(yǎng)基）收集游動(dòng)孢子并調(diào)整至10cfu·mL。無菌轉(zhuǎn)基因馬鈴薯試管苗和野生型對(duì)照均在玻璃組培瓶中快繁生長(zhǎng)28 d，植株高約10 cm，分別用360 μL 孢子液均勻噴霧至整個(gè)植株，進(jìn)行病原菌脅迫，2 d 后提取馬鈴薯與致病疫霉的混合DNA，分別以致病疫霉特異性引物PiO8-3-3F &PiO8-3-3R（CAATTCGCCACCTTCTTCGA & GCCTTCCTGCCCTCAAGAAC）（PiO8：=-3.325+17.30）和 植 物 特 異 性 引 物EF1αF & EF-1αR（TGAGGCAAACTGTTGCTGTC & TGGAAACACCAGCATCACAC）（EF1α：=-3.264+30.10）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測(cè)，從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算致病疫霉相對(duì)馬鈴薯生物積累量，對(duì)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯和野生型進(jìn)行抗病能力鑒定。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS Statistics 26 及Microsoft Excel 2016 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Prism 8 進(jìn)行圖表繪制，采用檢驗(yàn)等差分析方法進(jìn)行試驗(yàn)組與對(duì)照組的顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯StNPR4 cDNA 序列的克隆及生物信息學(xué)分析

以馬鈴薯cDNA 為模板，擴(kuò)增的cDNA序列，獲得了預(yù)期大小的片段（見圖2：A），將目的片段克隆到pMD19-T 載體，質(zhì)粒酶切和測(cè)序鑒定結(jié)果顯示獲得了正確的目的片段（見圖2：B）。的CDS 序列為1 728 bp，通過與馬鈴薯數(shù)據(jù)庫(kù)里的基因組序列比較，基因含有4 個(gè)外顯子和3 個(gè)內(nèi)含子（見圖2：C），編碼575 個(gè)氨基酸，蛋白質(zhì)分子式為CHNOS，分子質(zhì)量64.6 kDa，等電點(diǎn)為5.66。它的水溶液在280 nm處的消光系數(shù)約為27 235，蛋白的不穩(wěn)定系數(shù)為44.6，為不穩(wěn)定蛋白；脂肪系數(shù)是92.42，平均親水系數(shù)為-0.345，具有親水性。StNPR4 蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析結(jié)果顯示螺旋占50.26%，延伸鏈占2.26%，無規(guī)則卷曲占47.3%。通過預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)StNPR4蛋白不存在信號(hào)肽，不含跨膜結(jié)構(gòu)域。StNPR4蛋白序列具有NPR1 典型的保守結(jié)構(gòu)域，N 端具有參與蛋白間互作的BTB/POZ 結(jié)構(gòu)（55～176 aa）；C端具有2個(gè)與TGA 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的ANK 錨蛋白重復(fù)序列（282～313 aa及317～346 aa）（見圖2：D）。

圖2 StNPR4基因CDS的PCR擴(kuò)增、酶切鑒定和結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)A.StNPR4 CDS PCR 擴(kuò)增結(jié)果（M.DNA Marker；泳道1.擴(kuò)增的StNPR4 CDS 片段）；B.StNPR4 克隆載體的酶切鑒定（M.DNA marker；泳道1.StNPR4-pMD19-T載體雙酶切鑒定；泳道2.StNPR4-pMD19-T質(zhì)粒DNA（未酶切））；C.StNPR4基因結(jié)構(gòu)；D.StNPR4蛋白結(jié)構(gòu)域Fig.2 PCR amplification，enzyme digestion and structure prediction of StNPR4A.PCR amplification of StNPR4 CDS（M.DNA Marker；1.StNPR4 CDS fragments）；B.Enzyme digestion of StNPR4 cloning vector（M.DNA Marker；1.Double digestion of StNPR4-pMD19-T vector；2.StNPR4-pMD19-T vector）；C.StNPR4 gene structure；D.StNPR4 protein structural domains

2.2 StNPR4蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

將馬鈴薯StNPR4 與擬南芥、甘藍(lán)型油菜（）、辣椒（）、番茄（）和煙草（）中的NPR1 家族蛋白進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，如圖3 所示，在擬南芥NPR1 家族的6 個(gè)成員中，StNPR4 與AtNPR3 和AtNPR4 聚類到一個(gè)大支上，StNPR4 與同是茄科的番茄中預(yù)測(cè)的SlNIM1-2 同源性最高，說明與它們的親緣關(guān)系最近。

圖3 StNPR4系統(tǒng)進(jìn)化分析與馬鈴薯（Solanum tuberosum）StNPR4 蛋白比對(duì)的蛋白家族來自擬南芥（Arabidopsis thaliana）、甘藍(lán)型油菜（Brassica napus）、辣椒（Capsicum annuum）、番茄（Solanum lycopersicum）以及煙草（Nicotiana tabacum）Fig.3 Phylogenetic analysis of StNPR4Protein families aligned with potato（Solanum taberosum）StNPR4 proteins include Arabidopsis thaliana，Brasica napus，Capsicum annuun，Solanumn iyeopersicum and Nicotiana tabacum

2.3 StNPR4基因組織特異性表達(dá)分析

利用qRT-PCR 發(fā)現(xiàn)在馬鈴薯的根、莖、葉和花中均能檢測(cè)到表達(dá)，如圖4所示，在葉中的表達(dá)量顯著高于其他3種組織，其表達(dá)量是根中的近5 倍，其次是在根中的表達(dá)量高于莖和花中的。

圖4 馬鈴薯不同組織中StNPR4的相對(duì)表達(dá)量Fig.4 Expression pattern of StNPR4 in different tissues from S.tuberosum**P＜0.01

2.4 StNPR4 的啟動(dòng)子序列的克隆及生物信息學(xué)分析

以馬鈴薯DM 1-3 516 R44 基因組DNA 為模板，PCR 擴(kuò)增的啟動(dòng)子序列，獲得了預(yù)期1 246 bp 的條帶（見圖5：A），將PCR 產(chǎn)物連接到pENTR-L16 載體，酶切和測(cè)序結(jié)果均顯示獲得了正確的啟動(dòng)子目的片段（圖5B）。通過調(diào)取馬鈴薯數(shù)據(jù)庫(kù)中基因上游-2000 bp的啟動(dòng)子區(qū)序列進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)具有MYB、WRKY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)及響應(yīng)水楊酸、乙烯和脫落酸等參與生物脅迫和非生物脅迫的順式作用元件。

圖5 StNPR4啟動(dòng)子的PCR擴(kuò)增及酶切鑒定A.StNPR4 啟動(dòng)子的PCR 擴(kuò)增（M.DNA Marker；泳道1.StPRONPR4片段，1 246 bp）；B.StNPR4啟動(dòng)子克隆載體的酶切鑒定（M.DNA Marker；泳道1.StPRONPR4-pENTR L16 雙酶切鑒定；泳道2.StPRONPR4-pENTR L16載體）Fig.5 PCR amplification of StNPR4 promoter and enzyme digestion of the vectorA.PCR amplification of the StNPR4 promoter（M.DNA Marker；1.StPRONPR4 fragments at 1 246 bp；B.Enzyme digestion identification of StNPR4 cloning vector（M.DNA Marker；1.StPRONPR4 fragments at 1 246 bp；2.StproNPR4-pENTR L16 vector）

2.5 自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的StNPR4 雙元表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化馬鈴薯

將克隆到的的1 246 bp的啟動(dòng)子序列與CDS 首先連接到pENTR L16載體上，用Ⅱ和Ⅰ進(jìn)行雙酶切鑒定獲得了正確大小的條帶（見圖6：A）；再用Ⅱ和Ⅰ將目的片段切出連接到雙元表達(dá)載體pORE O4 上，構(gòu)建自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體，酶切鑒定正確（見圖6：B）。利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)化馬鈴薯，得到5個(gè)轉(zhuǎn)化株系，分別命名為3-2、5-2、7-2、9-2 和17-1（見圖6：C）。

圖6 載體酶切鑒定及轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定A.StPRONPR4-StNPR4 pENTR L16 載體酶切鑒定（M.DNA Marker；泳道1.StPRONPR4-StNPR4 片段，30 21 bp）；B.StPRONPR4-StNPR4 pORE O4 載體酶切鑒定（M.DNA Marker；泳道1.3 021 bp 的StPRONPR4-StNPR4片段）；C.轉(zhuǎn)基因馬鈴薯植株P(guān)CR 鑒定（M.DNA Marker；泳道1～5.StNPR4轉(zhuǎn)基因株系PCR鑒定）Fig.6 Enzyme digestion identification of vectors and PCR identification of transgenic plantsA.Identification of StPRONPR4-StNPR4 pENTR L16 cloning vector by enzymatic digestion；M.DNA Marker；1.StPRONPR4-StNPR4 fragments at 3 021 bp；B.Identification of StPRONPR4-StNPR4 pORE O4 binary expression vector by enzymatic digestion；M.DNA Marker；1.StPRONPR4-StNPR4 fragments at 3 021 bp；C.PCR identification of different StNPR4 transgenic lines；M.DNA Marker；1-5.Different StNPR4 transgenic lines

2.6 StNPR4在馬鈴薯逆境脅迫中的功能研究

利用qRT-PCR 檢測(cè)5 個(gè)轉(zhuǎn)化株系在沒有任何處理的情況下的表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn) 基 因 馬 鈴 薯 品 系3-2、5-2、7-2 和9-2 中的表達(dá)量與對(duì)照野生型相比并無顯著性差異，只有17-1 的表達(dá)量顯著低于野生型和其余4 個(gè)轉(zhuǎn)化株系（見圖7：A）。用水楊酸的類似物BTH 處理后，發(fā)現(xiàn)野生型及5 個(gè)轉(zhuǎn)化品系中的表達(dá)量均出現(xiàn)先升高后降低的模式，17-1 在各個(gè)檢測(cè)的時(shí)間點(diǎn)內(nèi)表達(dá)量都相對(duì)較低（見圖8），這與圖7A 的結(jié)果有一致性，因此后續(xù)的試驗(yàn)不再檢測(cè)此品系。其余4 個(gè)轉(zhuǎn)化品系在BTH 處理后的不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量基本上都高于野生型，尤其5-2 在處理8 h 的表達(dá)量最高，說明轉(zhuǎn)基因株系對(duì)BTH 的誘導(dǎo)更敏感。

圖8 BTH誘導(dǎo)后StNPR4的表達(dá)量分析Fig.8 StNPR4 expression level after BTH treatment

用馬鈴薯晚疫病致病菌致病疫霉孢子處理后檢測(cè)致病疫霉的相對(duì)生物量，發(fā)現(xiàn)在4個(gè)轉(zhuǎn)基因品系中致病疫霉的相對(duì)生物量均極顯著低于野生型，說明轉(zhuǎn)基因株系明顯增強(qiáng)了對(duì)致病疫霉的抗性（見圖7：B）。

在加入150 mmol·LNaCl 的高鹽培養(yǎng)基中快繁轉(zhuǎn)基因株系，發(fā)現(xiàn)其生根率明顯增加，與野生型相比有極顯著差異，說明轉(zhuǎn)基因株系對(duì)高鹽脅迫有更好的適應(yīng)性（見圖7：C）。

圖7 StNPR4轉(zhuǎn)基因馬鈴薯的功能分析A.轉(zhuǎn)基因馬鈴薯StNPR4 基因的表達(dá)量分析；B.轉(zhuǎn)基因植株接種致病疫霉后病原菌相對(duì)生物量分析；C.150 mmol·L-1 NaCl 處理對(duì)轉(zhuǎn)基因馬鈴薯快繁生根率的影響；*P＜0.05，**P＜0.01，對(duì)各試驗(yàn)組與對(duì)照組同一時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量采用等方差t檢驗(yàn)分析，下同F(xiàn)ig.7 Functional analysis of StNPR4 transgenic plantsA.StNPR4 expression level in transgenic lines；B.Relative biomass of pathogens after inoculation of transgenic lines with phytophthora infestans；C.Rooting rates of transgenic lines after treatment with 150 mmol·L-1 NaCl；* represents P＜0.05，** represents P＜0.01，and equal variance t-test was used to analyze each experimental group and the control group at the same time point，the same as below

3 討論

植物的整個(gè)生命周期都面臨著來自各種生物和非生物因素的環(huán)境選擇壓力，植物也因此發(fā)展出復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)以應(yīng)對(duì)各種脅迫。在植物對(duì)病原菌的抗性調(diào)節(jié)中，免疫調(diào)節(jié)因子的表達(dá)在時(shí)間和空間上與侵染壓力相匹配，過量表達(dá)免疫因子對(duì)植物自身有潛在的危害，如生長(zhǎng)減緩、植株變矮小、產(chǎn)量降低甚至死亡。在水稻中用組成型啟動(dòng)子過量表達(dá)的旁系同源物顯著降低了轉(zhuǎn)化植株的存活率，少數(shù)存活的轉(zhuǎn)基因植株也沒有表現(xiàn)出抗病性的增強(qiáng)；而用自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化植株后可以產(chǎn)生明顯的抗病性。

本研究通過利用自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的雙元表達(dá)載體轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植物，發(fā)現(xiàn)在沒有病原菌誘導(dǎo)時(shí)，其表達(dá)量與野生型并無明顯差異，但當(dāng)用SA 的類似物BTH 誘導(dǎo)后，其表達(dá)量顯著升高，并且表現(xiàn)出對(duì)致病疫霉的抗性。Zavaliev 等發(fā)現(xiàn)NPR1 啟動(dòng)防御反應(yīng)之后，細(xì)胞質(zhì)中的NPR1會(huì)形成SINCs 凝聚體（salicylic acid-induced NPR1 condensates，SINCs），靶向調(diào)控逆境相關(guān)蛋白的泛素化和降解，從而在植物的免疫反應(yīng)中促進(jìn)細(xì)胞的存活，這表明NPR1可以在抗病和生長(zhǎng)發(fā)育之間進(jìn)行平衡。

研究結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因馬鈴薯在鹽脅迫壓力下的生根率顯著高于對(duì)照，StNPR4 很可能在馬鈴薯的鹽耐受性中起正調(diào)控作用，這暗示了基因家族在非生物脅迫中發(fā)揮作用。這一發(fā)現(xiàn)在其他物種中也得到了佐證。越來越多的研究表明NPR1 也參與了非生物脅迫。在低溫誘導(dǎo)下，細(xì)胞質(zhì)中的NPR1寡聚體釋放出單體NPR1，進(jìn)入細(xì)胞核中與熱激轉(zhuǎn)錄因子HSFA1互作參與冷馴化的調(diào)控。Seo等發(fā)現(xiàn)在高鹽脅迫下NPR1會(huì)快速轉(zhuǎn)運(yùn)至葉綠體中，作為分子伴侶和抗氧化劑直接起作用，可以減弱逆境導(dǎo)致的光合能力的下降；Jayakannan 等的 研 究 顯 示 擬 南 芥 中 依 賴NPR1 的SA 路徑對(duì)增強(qiáng)鹽和氧化脅迫的耐受性是必需的；Divi 等的研究表明NPR1 是油菜素內(nèi)酯介導(dǎo)的耐熱和耐鹽中的關(guān)鍵組分。

NPR1 介導(dǎo)獲得的抗性是廣譜的，可賦予植物對(duì)細(xì)菌、病毒和真菌的多重抗性，故而成為在植物抗病育種應(yīng)用中一個(gè)受到廣泛關(guān)注的基因。目前已有研究在水稻（）、小麥（）、番茄（）、大豆（）、煙草（）、棉花（）、胡蘿卜（）、油菜（）、柑橘（）、蘋果（）和香蕉（）中過量表達(dá)NPR1，均表現(xiàn)為抗病性增強(qiáng)，有些物種甚至表現(xiàn)出對(duì)食草昆蟲斜紋夜蛾（）的抗性。本研究通過由自身啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因植物，發(fā)現(xiàn)增強(qiáng)了馬鈴薯對(duì)致病疫霉的抗性，并且提高了在高鹽脅迫下的生根率，這樣的轉(zhuǎn)基因表達(dá)策略既可以確保植物抗病性又可以保證植物的正常生長(zhǎng)，對(duì)后續(xù)抗病基因的應(yīng)用也是一個(gè)很好的啟示。

盡管目前對(duì)基因家族在非生物脅迫的研究中有了一定進(jìn)展，然而對(duì)其具體的作用機(jī)制和確切功能依然未知。有研究表明AtNPR1 在轉(zhuǎn)基因水稻中對(duì)鹽脅迫和干旱脅迫起負(fù)調(diào)控作用，并 且Hao 等的 研 究 發(fā) 現(xiàn)NPR1 突 變 體npr1-1 表現(xiàn)出對(duì)鹽脅迫更高的耐受性，在擬南芥中異位表達(dá)來自桑樹（）的和增加了對(duì)干旱和鹽脅迫的敏感性。這些發(fā)現(xiàn)都表明了在非生物脅迫過程中基因家族在不同物種中發(fā)揮不同的功能，其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。