郭夢(mèng)橋 陳軒宇 洪森榮 李 嬌 樊 潔 程薪宇

（上饒師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，上饒 334001）

三葉青（Diels &Gilg），又名蛇附子、石老鼠、石猴子、金線吊葫蘆等，為葡萄科（Vitaceae）崖爬藤屬（），多年生草質(zhì)藤本植物，全草或塊根入藥，具有抗腫瘤、消炎、調(diào)節(jié)免疫等功效。由于三葉青的抗癌作用與其黃酮類(lèi)成分有關(guān)，因而目前對(duì)三葉青的研究主要側(cè)重于其黃酮類(lèi)化合物的分離鑒定及藥理作用等方面的研究，總黃酮含量亦成為衡量三葉青種質(zhì)資源（簡(jiǎn)稱(chēng)“資源”）品質(zhì)優(yōu)劣的重要指標(biāo)之一。而對(duì)于三葉青種質(zhì)資源多樣性及品質(zhì)比較的研究，則主要研究?jī)?nèi)容涉及分子標(biāo)記、同工酶、色譜分析及農(nóng)藝性狀的比較分析等方面，例如朱波等發(fā)現(xiàn)不同三葉青資源的葉與根系農(nóng)藝性狀均存在顯著差異，可作為三葉青種源地初步鑒定的判斷依據(jù)。在此基礎(chǔ)上，部分研究人員還發(fā)現(xiàn)三葉青種源地地理位置、生境與總黃酮含量存在一定相關(guān)性，如吉慶勇等發(fā)現(xiàn)麗水市不同海拔三葉青總黃酮含量隨海拔升高呈先增高后降低的趨勢(shì)。但此類(lèi)研究涉及區(qū)域多相對(duì)較小，或僅以根部或葉長(zhǎng)、葉寬等少量葉形性狀為依據(jù)對(duì)少數(shù)幾個(gè)資源進(jìn)行比較和鑒別，而僅憑這些性狀卻不能滿(mǎn)足對(duì)大量資源同時(shí)進(jìn)行比較和鑒別的需要，且以根部性狀為鑒別依據(jù)，會(huì)對(duì)植株造成嚴(yán)重?fù)p傷，不利于資源的保存，甚至可能影響育種速度?，F(xiàn)有研究結(jié)果顯示，同一作物不同資源間，葉形常存在較大差異，可作為資源鑒別依據(jù)，而不同資源間的葉形差異有時(shí)亦可在一定程度上反應(yīng)資源間總黃酮含量上的差異。而對(duì)于三葉青資源間豐富多樣的葉形變化而言，何種葉形性狀更適于作為資源間鑒別依據(jù)，以及葉形性狀對(duì)三葉青地上部分總黃酮含量是否具有指示作用，目前均無(wú)相關(guān)報(bào)道出現(xiàn)。鑒于此，本研究以引自我國(guó)12 個(gè)?。ㄖ陛犑校┑?9份三葉青資源為材料，對(duì)各資源葉表型性狀進(jìn)行統(tǒng)計(jì)比較，并與各資源地上部分總黃酮含量進(jìn)行相關(guān)性分析，意在揭示三葉青葉表型性狀間的聯(lián)系，確定葉表型性狀在三葉青種質(zhì)資源鑒別中的價(jià)值，以及其與種源地位置和總黃酮含量間的關(guān)系，為快速培育高黃酮含量的優(yōu)質(zhì)三葉青品種提供更為直觀的形態(tài)學(xué)判斷依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

為確保三葉青各資源葉形特征為其自身固有性狀，而非受不同生長(zhǎng)環(huán)境短期影響所致，本研究以2020 年10 月29 日采集于上饒市紅日農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司懷玉山三葉青引種園的49份三葉青種質(zhì)資源地上部分為研究材料（所有資源均已于采集地栽種3年以上），各資源種源地信息見(jiàn)表1。

表1 三葉青種源地信息Table 1 The provenance information of T.hemsleyanum

1.2 研究方法

選擇各資源長(zhǎng)勢(shì)旺盛植株，每株取5片遠(yuǎn)離莖末端的完全伸展葉，測(cè)量葉柄長(zhǎng)、中葉長(zhǎng)等12個(gè)葉表型長(zhǎng)度性狀（簡(jiǎn)稱(chēng)“長(zhǎng)度性狀”），并在此基礎(chǔ)上，換算得到葉柄比等7 個(gè)葉表型比例性狀（簡(jiǎn)稱(chēng)“比例性狀”），取平均值，各資源設(shè)置6次重復(fù)，測(cè)量結(jié)果如表2所示。

取各資源地上部分鮮樣（含莖、葉），50 ℃烘干至恒重（約72 h 以上），再將烘干所得干樣粉碎后過(guò)100 目篩，作為總黃酮檢測(cè)樣品?？傸S酮含量（total flavonoids content，TFC）檢測(cè)方法參考馬祥等，各資源重復(fù)測(cè)定3次。

利用SPSS 20.0 對(duì)三葉青葉長(zhǎng)度性狀、比例性狀和種源地位置進(jìn)行相關(guān)性分析，并提取葉長(zhǎng)度性狀公因子，利用公因子得分進(jìn)行聚類(lèi)分析以及三葉青葉表型性狀和地上部分總黃酮含量的相關(guān)性分析。

2 研究結(jié)果

2.1 三葉青葉形差異

各資源葉長(zhǎng)度性狀統(tǒng)計(jì)分析顯示，各資源葉形存在一定差異（見(jiàn)表2）。其中，中葉柄長(zhǎng)變異系數(shù)最大（23.43%），中葉柄長(zhǎng)最短的為ZJ-LSH，僅5.37 mm，最長(zhǎng)的為HN-JSH，13.23 mm，為前者的2.5 倍以上；側(cè)葉柄長(zhǎng)變異系數(shù)僅次于中葉柄長(zhǎng)（21.64%），其中最短的僅2.70 mm（JX-FCH），最長(zhǎng)的6.70 mm（HN-JSH）；側(cè)生葉葉片長(zhǎng)度性狀變異系數(shù)整體大于中生葉葉片，例如側(cè)葉寬變異系數(shù)（16.33%）大于中葉寬變異系數(shù)（14.66%），側(cè)葉長(zhǎng)變異系數(shù)（13.66%）大于中葉長(zhǎng)的變異系數(shù)（13.17%）；其余葉形長(zhǎng)度性狀變異系數(shù)由15.02～19.38%。

表2 三葉青葉長(zhǎng)度性狀及總黃酮含量（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）Table 2 Characters of leaf length and content of total flavonoids of T.hemsleyanum（means±SD）

2.2 三葉青葉長(zhǎng)度性狀與比例性狀相關(guān)性

三葉青部分葉長(zhǎng)度性狀與比例性狀相關(guān)性分析結(jié)果顯示（見(jiàn)表3），葉柄長(zhǎng)與中葉長(zhǎng)寬比（相關(guān)系數(shù)-0.376）和側(cè)葉長(zhǎng)寬比（相關(guān)系數(shù)-0.390）呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），即葉柄長(zhǎng)的資源，其葉片可能更為寬闊；中葉柄長(zhǎng)和側(cè)葉柄長(zhǎng)與比例性狀均無(wú)顯著相關(guān)性；中葉長(zhǎng)和中葉寬與中葉長(zhǎng)寬比分別呈顯著正相關(guān)（＜0.05，相關(guān)系數(shù)0.312）和極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01，相關(guān)系數(shù)-0.500），即隨著中葉葉片增大，其葉形逐漸朝狹長(zhǎng)或短闊形發(fā)展；中葉寬與側(cè)葉長(zhǎng)寬比和側(cè)葉下寬比分別呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01，相關(guān)系數(shù)-0.432）和顯著正相關(guān)（＜0.05，相關(guān)系數(shù)0.318），中葉長(zhǎng)寬比與側(cè)葉寬、側(cè)葉上部寬和側(cè)葉下部寬呈顯著（＜0.05）或極顯著（＜0.01）負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為-0.380、-0.343和-0.390，表明中生葉和側(cè)生葉葉形存在相關(guān)性，中生葉增寬，側(cè)生葉亦朝寬闊方向發(fā)展，反之亦然；側(cè)葉長(zhǎng)與葉比例性狀無(wú)顯著相關(guān)性。側(cè)葉寬、側(cè)葉上部寬和側(cè)葉下部寬與側(cè)葉長(zhǎng)寬比呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），相關(guān)系數(shù)依次為-0.482、-0.475和-0.467，表明隨著側(cè)生葉寬度的增加，側(cè)生葉葉形整體朝更寬闊方向過(guò)渡。

表3 三葉青葉長(zhǎng)度性狀與比例性狀相關(guān)性Table 3 Correlation analysis of characters of leaf length with proportion of T.hemsleyanum

續(xù)表2 Continued table 2

2.3 三葉青種源地理位置與葉表觀性狀相關(guān)性

各資源種源地緯度、經(jīng)度以及海拔與三葉青葉長(zhǎng)度性狀相關(guān)性分析結(jié)果顯示（見(jiàn)表4），種源地緯度與葉柄長(zhǎng)呈顯著正相關(guān)（＜0.05，相關(guān)系數(shù)0.353），即隨著種源地緯度升高，葉柄長(zhǎng)整體呈增長(zhǎng)趨勢(shì)，而種源地緯度與中葉長(zhǎng)、中葉寬距、側(cè)葉上寬距呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），相關(guān)系數(shù)依次為-0.318、-0.329、-0.287，具體表現(xiàn)為小葉由披針形或卵披針形向更為寬闊的長(zhǎng)橢圓披針形過(guò)渡；種源地經(jīng)度與三葉青葉長(zhǎng)度性狀無(wú)顯著相關(guān)性；種源地海拔與側(cè)葉柄長(zhǎng)呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），相關(guān)系數(shù)-0.302，即隨著種源地海拔升高，三葉青側(cè)葉小柄長(zhǎng)度呈縮短趨勢(shì)，葉片距離總?cè)~柄更近。

表4 三葉青種源地與葉長(zhǎng)度性狀相關(guān)性Table 4 Correlation analysis of provenance with characters of leaf length of T.hemsleyanum

由各資源種源地緯度、經(jīng)度以及海拔與葉比例性狀相關(guān)性分析結(jié)果可知（見(jiàn)表5），種源地緯度與葉柄比呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01，相關(guān)系數(shù)-0.451），與中葉長(zhǎng)寬比（相關(guān)系數(shù)-0.301）、側(cè)葉上寬比（相關(guān)系數(shù)-0.320）和側(cè)葉下寬比（相關(guān)系數(shù)-0.293）均為顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05），具體表現(xiàn)為種源地緯度升高，三葉青葉柄逐漸增長(zhǎng)，中生小葉變的更寬闊，側(cè)生小葉葉片朝卵狀橢圓形方向發(fā)展；種源地經(jīng)度與側(cè)葉上寬比（相關(guān)系數(shù)-0.285，）和側(cè)葉上下寬比（相關(guān)系數(shù)-0.423）分別呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）和極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），即表明伴隨種源地向東推移，三葉青側(cè)生葉不對(duì)稱(chēng)性更為明顯；種源地海拔與葉比例性狀無(wú)顯著相關(guān)性。

表5 三葉青種源地與葉比例性狀相關(guān)性Table 5 Correlation analysis of provenance with characters of leaf proportion of T.hemsleyanum

2.4 三葉青葉長(zhǎng)度性狀因子分析

三葉青部分葉長(zhǎng)度性狀與比例性狀的相關(guān)性分析結(jié)果表明，長(zhǎng)度性狀間可能存在普遍的相關(guān)性，因此對(duì)部分葉長(zhǎng)度性狀進(jìn)行因子分析。結(jié)果顯示，KMO 測(cè)度值0.744，Bartlett 檢驗(yàn)顯著性值0.000，可進(jìn)行因子分析。

因子分析結(jié)果顯示（見(jiàn)表6），共有3個(gè)公因子特征值大于1，經(jīng)過(guò)最大方差法旋轉(zhuǎn)后得到的公因子載荷矩陣顯示，3個(gè)公因子的累積貢獻(xiàn)率達(dá)90.237%，涵蓋了原變量的絕大部分信息。公因子1貢獻(xiàn)率為55.257%，在側(cè)葉寬、側(cè)葉下部寬、側(cè)葉上部寬、側(cè)葉長(zhǎng)、中葉寬和中葉長(zhǎng)上有較大載荷，代表葉片性狀；公因子2貢獻(xiàn)率為21.558%，在側(cè)葉柄長(zhǎng)和中葉柄長(zhǎng)上具有較大載荷，代表小葉柄性狀；公因子3貢獻(xiàn)率13.423%，在葉柄長(zhǎng)上具有較大載荷，反應(yīng)葉柄長(zhǎng)度性狀。各資源公因子得分及綜合得分如表7所示。

表6 葉長(zhǎng)度性狀因子Table 6 Leaf length characters factor analysis

2.5 三葉青葉形聚類(lèi)分析

以3個(gè)葉長(zhǎng)度性狀公因子得分為數(shù)據(jù)源，進(jìn)行層次聚類(lèi)，求得各資源葉形綜合得分，最終將49個(gè)資源葉形劃分為5 個(gè)類(lèi)型（見(jiàn)表7），其中湖南、江西、浙江和湖北省中的8個(gè)資源構(gòu)成一類(lèi)（類(lèi)型-1），該類(lèi)葉形公因子綜合得分平均值在0.55 以上，葉形大小整體處于中等或中等偏上水平，這8個(gè)資源為本研究涉及資源中公因子2得分最高的資源，表明該類(lèi)葉形主要特點(diǎn)為小葉柄較長(zhǎng)。

表7 三葉青葉長(zhǎng)度性狀公因子得分、綜合得分及聚類(lèi)分析結(jié)果Table 7 Common factor scores，comprehensive scores and cluster analysis results of T.hemsleyanum length characters

ANH-HSH等30個(gè)資源葉形歸為一類(lèi)（類(lèi)型-2），種源地涉及了本研究中除云南省外的所有采集省（直轄市），其中以江西、廣西和浙江資源相對(duì)較多，該類(lèi)葉形公因子綜合得分多為負(fù)值，平均得分-0.38，說(shuō)明該類(lèi)群葉形整體偏小，公因子1、公因子2 得分為負(fù)值的絕大部分資源葉形歸入此類(lèi)中，表明該類(lèi)葉形主要特征為葉片較小、小葉柄較短。

JX-LHSH 和HN-JBX 等5 個(gè)資源葉形歸為一類(lèi)（類(lèi)型-3），種源地涉及湖南、江西和浙江，公因子綜合得分平均值為0.89，說(shuō)明該類(lèi)葉形整體偏大，多數(shù)資源公因子1、3 得分較高，表明該類(lèi)葉形主要特征為葉片較大、葉柄較長(zhǎng)，由葉長(zhǎng)度性狀測(cè)量結(jié)果（見(jiàn)表2）可知，此類(lèi)葉形側(cè)生葉較寬，中生葉與側(cè)生葉葉片長(zhǎng)寬比較小，即葉片短闊。

JX-YSH 等5 個(gè)資源葉形歸為一類(lèi)（類(lèi)型-4），種源地涉及廣西和江西兩省，該類(lèi)群的公因子綜合得分平均值0.11，說(shuō)明該類(lèi)葉形大小在本研究涉及資源中整體處于中等水平。本研究所涉資源，公因子3得分最少的5個(gè)資源全為此類(lèi)型葉，表明該類(lèi)葉形主要特征為葉柄較短（平均僅22.76 mm）。

云南的YN-MLP葉形單獨(dú)構(gòu)成一類(lèi)（類(lèi)型-5），公因子綜合得分最高（1.89），表明該類(lèi)葉形為本研究中葉形整體最大的一類(lèi)，其公因子1得分遠(yuǎn)高于其他資源，說(shuō)明該類(lèi)葉形主要特征為葉片較大，其中葉長(zhǎng)、側(cè)葉長(zhǎng)、側(cè)葉寬均大于其他資源，但中葉柄長(zhǎng)和側(cè)葉柄長(zhǎng)在本研究資源中僅處中等水平。

2.6 三葉青地上部分總黃酮含量與種源地位置和葉形公因子的相關(guān)性

49個(gè)資源地上部分總黃酮含量檢測(cè)結(jié)果顯示（見(jiàn)表2），各資源地上部分總黃酮含量差異較大，變異系數(shù)為32.22%，其中YN-MLP 總黃酮含量最低，僅16.66 mg·g，ZJ-WZH 總黃酮含量最高，達(dá)74.64 mg·g。相關(guān)性分析結(jié)果顯示，三葉青地上部分總黃酮含量與種源地地理位置（緯度、經(jīng)度及海拔）無(wú)顯著相關(guān)性?？傸S酮含量與公因子1呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），相關(guān)系數(shù)-0.368，即葉片增大，各資源地上部分總黃酮含量整體呈下降趨勢(shì)?？傸S酮含量與公因子3呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），相關(guān)系數(shù)0.375，即各資源地上部分總黃酮含量隨葉柄長(zhǎng)度增加而呈增長(zhǎng)趨勢(shì)?？傸S酮含量與公因子2 無(wú)顯著相關(guān)性，即其與小葉柄長(zhǎng)度間無(wú)明顯關(guān)系。

3 討論

分析結(jié)果顯示，不同種源三葉青栽培于同一生境，其葉形亦存在一定差異，其中以小葉柄長(zhǎng)度（中葉柄長(zhǎng)、側(cè)葉柄長(zhǎng)）變異系數(shù)最大（21%以上），其次是與側(cè)生小葉片寬度相關(guān)的性狀（側(cè)葉寬、側(cè)葉上部寬、側(cè)葉下部寬、側(cè)葉上寬距和側(cè)葉下寬距），變異系數(shù)亦多大于16%，葉柄長(zhǎng)、側(cè)葉長(zhǎng)和中葉片相關(guān)性狀變異系數(shù)最小，多小于15%或在其左右，表明相較其他性狀而言，小葉柄長(zhǎng)度及側(cè)生葉葉片性狀對(duì)于三葉青種質(zhì)資源鑒別具有更高的參考價(jià)值，且相較于莖和塊根性狀而言，具有直觀，易于獲取、實(shí)用價(jià)值更高等優(yōu)勢(shì)。

相關(guān)性分析結(jié)果顯示，三葉青葉柄長(zhǎng)、中葉長(zhǎng)、中葉寬距、側(cè)葉上寬距、側(cè)葉柄長(zhǎng)、葉柄比、中葉長(zhǎng)寬比、側(cè)葉上寬比、側(cè)葉下寬比與種源地緯度、經(jīng)度或海拔存在顯著（＜0.05）或極顯著（＜0.01）相關(guān)性，表明三葉青各資源葉形差異是長(zhǎng)期適應(yīng)種源地生境而產(chǎn)生的穩(wěn)定形態(tài)學(xué)差異，例如側(cè)葉柄長(zhǎng)與海拔呈顯著負(fù)相關(guān)（＜0.05）可能是由于海拔升高，水分減少，小葉柄朝著短縮方向發(fā)展以便于水分和養(yǎng)分的輸送。

聚類(lèi)分析結(jié)果將三葉青葉形劃分為5種類(lèi)型，其中，江西包含4 種類(lèi)型，江西西側(cè)的湖南和東北側(cè)的浙江2 省包含3 種類(lèi)型，江西西北側(cè)的湖北包含2 種類(lèi)型，其余?。ㄖ陛犑校┚鶅H包含1 種類(lèi)型，各?。ㄖ陛犑校┤~青葉形種類(lèi)數(shù)量整體呈以江西為中心，向周?chē)椛溥f減的趨勢(shì)，表明江西可能是三葉青各類(lèi)種源的過(guò)渡區(qū)，甚至是遺傳多樣性的起源中心，這與尹明華等所得結(jié)論一致。此外，本研究涉及資源中，超過(guò)半數(shù)資源葉形具類(lèi)型-2葉形，表明葉片較小、小葉柄較短的葉形可能更接近三葉青祖征。

本研究分析結(jié)果顯示，49 個(gè)三葉青資源地上部分總黃酮含量存在較大差異，變異系數(shù)達(dá)32.22%，但總黃酮含量與種源地緯度、經(jīng)度和海拔均無(wú)顯著相關(guān)性，這表明導(dǎo)致三葉青各資源總黃酮含量差異形成的原因，可能并不僅限于經(jīng)度、緯度和海拔影響，還可能與種源地光照等更為復(fù)雜多樣的環(huán)境因子長(zhǎng)期作用有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，三葉青地上部分總黃酮含量與葉片性狀公因子（公因子1）呈極顯著負(fù)相關(guān)（＜0.01），與葉柄長(zhǎng)度性狀公因子（公因子3）呈極顯著正相關(guān)（＜0.01），即葉片越大，三葉青地上部分總黃酮含量反而可能更少，而總?cè)~柄增長(zhǎng)，三葉青地上部分總黃酮含量卻可能越高，由此推測(cè)，即便在葉中，黃酮類(lèi)物質(zhì)亦非均勻分布，且可能主要分布于葉柄或葉脈中。