王紅波，連澤特，曹 強，范賽華，劉曉麗，馬 挺

（1.中國石油新疆油田分公司實驗檢測研究院，新疆克拉瑪依 834000；2.中國石油新疆油田分公司陸梁油田作業(yè)區(qū)，新疆克拉瑪依 834000；3.南開大學生命科學學院，天津 300071）

新疆陸梁油田位于準噶爾盆地腹部古爾班通古特沙漠北部。其中，陸9 井區(qū)某油藏為具有基本統(tǒng)一油水界面的薄層、低幅度、高滲透和邊底水砂巖油藏。隨著采出體積的增大，注水量增幅較小，注采比不斷下降。根據(jù)該油藏特征與儲層物性，結(jié)合油水井動態(tài)數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)儲層非均質(zhì)性嚴重，導致油藏平、剖面矛盾突出，同時受油藏邊底水和CaCl2水型的限制，有效提高采收率的方法比較單一，增產(chǎn)措施少。這樣的砂巖油藏在新疆油田具有一定的代表性，目前從整體上還缺少抑制含水上升的有效技術(shù)手段。然而油藏剩余儲量豐富，因此尋找新的技術(shù)手段就成了該區(qū)塊提高油藏采收率和穩(wěn)油控水的主要途徑。

微生物采油技術(shù)是生物工程技術(shù)在油田開發(fā)領(lǐng)域的應用，具有低成本、適應性強、作業(yè)簡單、無環(huán)境問題等優(yōu)勢［1］。微生物驅(qū)油技術(shù)即通過注入采油功能菌及其營養(yǎng)激活劑，使其在油藏中產(chǎn)生代謝作用和代謝產(chǎn)物，并與原油/巖石/水相互作用，從而提高水驅(qū)效率，達到提高油藏最終采收率的目的，具有油藏適應好、作用途徑多、協(xié)同作用強、工藝簡單、成本低等優(yōu)勢［2］。激活劑是決定微生物驅(qū)油效果的重要因素之一。因此，本文以工業(yè)發(fā)酵副產(chǎn)品和農(nóng)業(yè)廢棄物為激活劑的主要原料，篩選評價了適合于陸9 井區(qū)油藏的激活體系配方，定向激活油藏中的主要采油功能菌，發(fā)揮微生物驅(qū)的優(yōu)勢，實現(xiàn)陸9井區(qū)油藏的穩(wěn)油控水和經(jīng)濟有效開發(fā)。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

豆餅粉、C1（農(nóng)副產(chǎn)品加工廢料，有機氮質(zhì)量分數(shù)7.31%）、C2（農(nóng)副產(chǎn)品加工廢料，有機碳質(zhì)量分數(shù)20.21%）、豆粕、顆粒狀肥料等，工業(yè)級，天津市利發(fā)隆化工科技有限公司；乙酸鈉、紅糖、蔗糖、甘油、N1（含氮無機鹽，含氮量26.16%）、N2（含氮無機鹽，含氮量16.47%）、尿素、磷酸氫二胺、磷酸二氫銨、正十二烷，分析純，國藥集團化學試劑有限公司；熒光定量PCR 分析試劑組成：溶菌酶、十二烷基硫酸鈉（SDS）、Tris 飽和酚、氯仿、乙醇、Roche 熒光定量試劑盒，北京鼎國生物技術(shù)有限責任公司；超純水；PCR 引物，北京奧科生物技術(shù)有限責任公司；環(huán)氧樹脂膠結(jié)驅(qū)油用巖心，取自中國石油新疆油田分公司巖心庫；油水樣采集自新疆某砂巖油藏油田陸9井區(qū)某一層位油藏，地層水礦化度10298.89 mg/L，主要由Na+、Cl-、HCO3-等離子組成。

ZQZY-70 BS 搖床，上海知楚儀器有限公司；Yamato SQ 510 C 滅菌鍋，日本大和科學株式會社；JJ-4 A 水浴鍋，金壇市城東新瑞儀器廠；Vortex 2 振蕩器，美國Scientific Industries公司；BCD-195冰箱，河南新飛電器集團有限公司；物模驅(qū)油裝置、HKY-1型巖石超聲波綜合測試儀，海安石油科研儀器公司；氮氣瓶；不銹鋼耐壓容器1、2 L各1個；油水分離計量器，天津市泰源工業(yè)氣體有限公司；MyuQTM2 Opitics Module 實時熒光定量PCR 儀、Bio-Rad iQ 5 PCR，美國伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品（上海）有限公司；JIN26 高速冷凍離心機，美國貝克曼庫爾特（Beckman Coulter）有限公司；Universal 320 R臺式高速冷凍離心機，德國Hettich科學儀器有限公司。

1.2 實驗方法

微生物提高原油采收率主要通過微生物本身及其代謝產(chǎn)物兩方面作用［3］。為了便于室內(nèi)激活體系配方的優(yōu)化，依據(jù)激活劑激活效果評價方法，本著簡單易行、有效合理的原則，確立了以激活前后水樣總菌數(shù)變化、硫酸鹽還原菌（SRB）數(shù)量變化和對原油的乳化作用效果作為評價激活效果的主要指標。

（1）乳化評級方法

激活劑乳化評級方法參照代學成等［4］描述的油水乳化效果評分標準，主要觀察微生物激活培養(yǎng)后分散乳化原油的能力。該方法簡單易行，用肉眼根據(jù)經(jīng)驗判定營養(yǎng)配方的乳化效果，判定結(jié)果存在人為因素的誤差［5］。

（2）排油圈法

排油圈法是公認的簡便準確的評估樣品乳化效果的實驗方法［6］。具體步驟為：在培養(yǎng)皿（直徑=90 mm）中加入60 mL的熱水，再加入10 mL經(jīng)蘇丹Ⅲ染色的正十二烷（需過濾除菌）；待正十二烷鋪滿整個平板后，在其表面加入1 mL 待測樣品，用刻度尺測量排油圈直徑大小，若排油圈直徑大于3 cm，即認為培養(yǎng)液中存在表面活性劑。

（3）熒光定量PCR方法

熒光定量PCR 是通過熒光信號不斷累積而實現(xiàn)實時監(jiān)測PCR全程，然后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法［7］。對于油藏環(huán)境而言，烴氧化菌、硝酸鹽還原菌及表面活性劑產(chǎn)生菌這幾類功能微生物與微生物采油技術(shù)密切相關(guān)，因此定量分析這些功能基因有助于更加清晰地認識和判斷油藏環(huán)境中的微生物群落。選擇與原油乳化分散效果密切相關(guān)的編碼鼠李糖脂的鼠李糖基轉(zhuǎn)移酶rhlAB基因、脂肽類表面活性劑合成酶srfA基因、與烷烴降解相關(guān)的烷烴加氧酶alkB基因進行群落相關(guān)功能菌的定量PCR分析。引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR引物

因編碼烷烴加氧酶的alkB基因包含細胞色素P450氧化酶和細菌顆粒狀烷烴羥化酶兩大類，因此在設(shè)計alkB基因的PCR引物時，需設(shè)計多對特異性引物及接頭引物。用實驗室構(gòu)建的CPY153標準質(zhì)粒繪制標準曲線，以設(shè)置優(yōu)化出最佳的多對特異性引物添加量以及接頭引物的添加量，具體設(shè)計方法和15 對引物序列見參考文獻［8］，擴增運行程序見表2。其中，16S rRNA、srfA、rhlAB基因的體系組成為：10 μL SYBRGreen Mastermix、9 μL超純水、引物1 和引物2 各0.05 μL、1 μL DNA 模板；alkB 基因的體系組成為：10 μL SYBRGreen Mastermix、9 μL 超純水、0.05 μL 引物、1 μL DNA 模板。其中，alkB基因體系配制的第1步按表2進行；第2步在每個體系中加入0.8 μL 的接頭引物（JP），用臺式高速冷凍離心機混勻后使用熒光定量PCR儀進行定量分析。

表2 4類功能基因PCR擴增運行程序

（4）Plackett-Burman實驗

參照參考文獻［9］進行Plackett-Burman（簡稱P-B）實驗。P-B實驗設(shè)計建立在平衡的非完全區(qū)組基礎(chǔ)上，通過N個實驗（N為4的倍數(shù)）來分析N-1個變量的兩水平實驗設(shè)計方法。和傳統(tǒng)的單因素實驗相比，可以利用最少的實驗次數(shù)快速有效地在眾多考察因素中列出重要性排名，找出主要影響因素。

在初步優(yōu)化營養(yǎng)劑配方的基礎(chǔ)上，利用Minitab軟件（美國賓夕法尼亞州州立大學）進行P-B實驗設(shè)計［10］。選 擇 Stat＞Factorial＞Analysis Factorial Design，生成的實驗設(shè)計如表3 所示。依照Minitab設(shè)計的12水平配方進行顯著性分析實驗，每個水平設(shè)置3 個平行，在37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)7 d。實驗結(jié)束后，取2 mL 激活后的油水樣提取基因組，采用熒光定量PCR技術(shù)對基因組中的rhlAB和srfA進行定量分析。

表3 Plackett-Burman實驗設(shè)計表

（5）物模驅(qū)油實驗

參照常規(guī)的物模驅(qū)油實驗［11］，向巖心中注入地層水，直至出口含水率為98%為止，記錄出水量、出油量以及相對應的時間與壓力。第1次水驅(qū)結(jié)束后注入0.5 PV 菌株發(fā)酵液，注入速度為1 mL/min，密封巖心夾持器后培養(yǎng)7 d，再將地層水注入巖心，直至出口含水率為98%為止，計算提高采收率值。

2 結(jié)果與討論

2.1 廉價營養(yǎng)體系的初篩及單因素實驗

根據(jù)油藏水質(zhì)分析結(jié)果、微生物群落組成和生長的營養(yǎng)需求，結(jié)合當前國內(nèi)外已報道的激活體系組成，以及現(xiàn)場配方的組成分析（0.275% C2、0.125% C1、0.6% N2、0.25% N1），確定基礎(chǔ)配方為0.25%C2、0.2%豆餅粉、0.25%N1、0.6% N2。綜合考慮激活體系篩選原則和激活對象的實際情況，以碳源、氮源、磷源、生長因子和SRB 抑制因子為出發(fā)點，進行單因素實驗初步確定基礎(chǔ)激活配方。用250 mL三角瓶進行好氧培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度37 ℃，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)時間7 d。培養(yǎng)結(jié)束后進行乳化性能評價和功能菌的檢測。可以根據(jù)激活體系激活后的原油乳化效果及功能菌激活的總菌數(shù)評價激活體系的好壞［4］。

碳源的篩選。在現(xiàn)場激活配方基礎(chǔ)上，以乙酸鈉、紅糖、C2、蔗糖、甘油、原油（唯一碳源）為碳源進行水樣激活實驗，控制其他營養(yǎng)成分和組成不變。結(jié)果表明，乙酸鈉和C2的激活效果最好，激活后油水樣微生物16S rRNA 基因拷貝數(shù)達到了1012copies/mL以上，乳化評級也達到+++（+的數(shù)量對應于參考文獻［4］中乳化評級方法的0～5 分）；蔗糖、紅糖的激活效果稍差，乳化評級為++；甘油和原油的激活效果最差，乳化評級為+。

氮源的篩選。在現(xiàn)場激活配方基礎(chǔ)上，以N1、N2、豆餅粉、C1、尿素、豆粕為氮源進行水樣激活實驗，控制其他營養(yǎng)成分和組成不變。結(jié)果表明，N1、N2、豆餅粉、C14 組氮源的微生物16S rRNA 基因拷貝數(shù)均達到了1012copies/mL 以上，乳化評級達到+++（C1為++++）。尿素、豆粕的激活效果較差，乳化評級為+。

磷源的篩選。在現(xiàn)場激活配方基礎(chǔ)上，以顆粒狀肥料、磷酸氫二銨、磷酸二氫銨、C1為磷源進行水樣激活實驗，控制其他營養(yǎng)成分和組成不變。結(jié)果表明，磷酸氫二胺、磷酸二氫銨等無機磷源（添加量為0.2%）與陸9井區(qū)氯化鈣型地層水形成不溶性沉淀，會造成地層堵塞，無法應用于該區(qū)塊的激活。C1、顆粒狀肥料2種磷源都達到了出色的乳化效果，微生物16S rRNA 基因拷貝數(shù)大于1012copies/mL，乳化評級為++++。

綜合單因素實驗結(jié)果和激活配方篩選原則，確定初步配方為：0.10%C1、0.25%C2、0.15%顆粒狀肥料、0.6%N2、0.3%N1。

2.2 Plackett-Burman實驗

依據(jù)表3 設(shè)計開展營養(yǎng)劑激活實驗，培養(yǎng)結(jié)束后提取基因組，對rhlAB和srfA進行定量分析，將上述功能基因拷貝數(shù)輸入軟件獲得乳化效果綜合得分擬合方程：

在Minitab軟件菜單中選擇Stat＞Facterial＞Facterial Plots，生成各因素對輸出變量（Y值）的影響圖。通過分析主要影響圖可知各因素的顯著性［10］，結(jié)果見表4。

由表4 可見，C1、顆粒狀肥料的效應為正，加量增大對乳化效果為正響應，即適當增大加量可提高乳化評級分數(shù)；C2、N2、N1的效應為負，加量減少對乳化效果為正響應，即適當減少加量可提高乳化評級分數(shù)。但5 個營養(yǎng)因子的P值不具有統(tǒng)計學意義（P＞0.05），因此無法通過Plackett-Burman實驗得出各營養(yǎng)因子對乳化效果的顯著性結(jié)果。

表4 響應值（乳化評分）的估計效應和系數(shù)

在顆粒狀肥料加量為0.1%時能有效激活陸9井區(qū)地層水中的功能微生物，激活后的油水樣品能達到良好的乳化效果。顆粒狀肥料來源為工業(yè)肥料回收再利用，雖然價格低廉，激活效果良好，但顆粒為直徑3～5 mm的實心球狀體，溶解較為困難，而碾碎溶解后，有較多不溶性片狀雜質(zhì)（長度約為5 mm），在地層中易造成非選擇性封堵。因此，在后續(xù)實驗中，不再使用顆粒狀肥料進行實驗。而C1含磷量為2.4%，在單因素結(jié)果中，C1作為磷源表現(xiàn)了良好的乳化效果，因此在后續(xù)實驗中使用C1作為磷源。

2.3 去因子實驗

2.3.1 營養(yǎng)配方設(shè)計

由于不同水平的營養(yǎng)因子添加量下，激活后樣品總菌數(shù)和功能基因的數(shù)量級無顯著性差異（P＜0.05），無法準確判斷各因素的最佳水平。另外，考慮工業(yè)成本的可行性，由單因素實驗得到的初步配方出發(fā)，在Plackett-Burman 實驗的基礎(chǔ)上進行更為直觀的去因子實驗，在保證激活效果的同時節(jié)約成本，實現(xiàn)最優(yōu)的資源利用。設(shè)計的7 組配方見表5。在37 ℃、180 r/min 條件下培養(yǎng)7 d。培養(yǎng)結(jié)束后進行乳化評級、功能基因定量PCR分析。

表5 去因子實驗營養(yǎng)配方組成

2.3.2 營養(yǎng)配方優(yōu)化結(jié)果

用乳化評級和排油圈法共同測定不同營養(yǎng)配方的乳化效果，結(jié)果見表6。配方C 的乳化效果最好，排油圈直徑4.0 cm。

表6 7組營養(yǎng)配方去因子實驗結(jié)果

用實時熒光定量PCR 技術(shù)分別測定7 組營養(yǎng)配方的16S rRNA 基因、alkB基因、srfA基因、rhlAB基因，分別測定解烴基因、脂肽基因、鼠李糖脂基因的拷貝數(shù)，結(jié)果見表7。

表7 實時熒光定量檢測功能基因拷貝數(shù)

綜上，7組去因子實驗激活結(jié)果表明，配方C和配方G 的激活效果顯著，無沉淀與不溶性雜質(zhì)出現(xiàn)，配方與水樣的配伍性良好，乳化評級均為5 分。功能基因定量結(jié)果顯示解烴菌alkB基因均達到了107copies/mL，脂肽產(chǎn)生菌srfA基因均達到了105copies/mL，鼠李糖脂產(chǎn)生菌rhlAB基因均達到了104copies/mL。

2.4 響應面分析結(jié)果

響應面法是通過近似構(gòu)造一個具有明確表達形式的多項式來表達因式功能的函數(shù)［12］。借助Minitab 5.0 軟件，采用二次回歸的旋轉(zhuǎn)中心組合設(shè)計，進行實驗設(shè)計和激活體系配方優(yōu)化。對實驗數(shù)據(jù)進行回歸擬合，對擬合方程作顯著性檢驗和方差分析［13］。選擇 配方C，并 以0.15% C1、0.6% N2、0.25% N1作為0 水平進行3 因素20 水平響應面分析。分析結(jié)果（表8）表明，C1和N1為負響應因素，可適當減少添加量；而N2為正響應因素，可適當增加添加量。

為了更為準確地評估不同水平的添加量響應結(jié)果，進行了20 水平的熒光定量PCR 分析（圖1）。實驗結(jié)果表明，20水平的配方加入量對功能基因數(shù)量級的響應在1個數(shù)量級之內(nèi)，表明3個因素的3個水平任意組合均不會對激活效果造成較大波動。N2不僅作為優(yōu)良氮源，同時還可以促進硝酸鹽還原菌的生長代謝。由于硝酸鹽還原菌的生態(tài)位在硫酸鹽還原菌之上，且硝酸鹽還原菌的適當富集可以有效抑制硫酸鹽還原菌的生長，因此不降低N2的添加量。C1作為輔助氮源之外，更重要的作用是提供微生物生長代謝所必須的磷源（C1中的無機磷含量為0.7%），因此不降低C1的添加量。與0 水平的N1（0.25%）相比，低水平N1（0.2%）的激活效果及功能基因的數(shù)量級并無明顯差異，因此可以適當降低N1的加量。當N1的加量為0.25%時，配方成本為27.43元/方，已較現(xiàn)場配方降低了20.25%。為了更好地確保激活效果，N1的加量不再降低。最終激活體系配方為：0.15%C1、0.6%N2、0.25%N1。與徐兵等［13］對陸9 井區(qū)內(nèi)源微生物優(yōu)化后的激活配方相比，成本已大大降低。

圖1 熒光定量PCR 16S rRNA、srfA、rhlAB、alkB基因每毫升拷貝數(shù)

2.5 物模驅(qū)油結(jié)果

模擬陸9 井區(qū)油藏條件開展物理模擬驅(qū)油實驗，結(jié)果見表9。當優(yōu)化配方注入量為0.1～0.6 PV時，驅(qū)油效率提高2.65 百分點～5.92 百分點。在注入0.6 PV 的實驗過程中，注入量達到0.55 PV 時出現(xiàn)激活體系突破。從物理模擬提高采收率效果來看，0.6 PV提高驅(qū)油效率5.92百分點，僅比0.4 PV多0.55 百分點。表明在驅(qū)替突破后，后續(xù)激活劑的注入并沒有進一步提升地層微生物乳化原油的能力，而突破后的激活體系則造成浪費，因此選擇0.4 PV作為最佳注入量。在相同條件（0.4 PV，優(yōu)化配方）下，進行注氣量的優(yōu)化實驗。優(yōu)化配方不注氣的條件下提高驅(qū)油效率5.37百分點。優(yōu)化配方注氣（氣液體積比8∶1）的條件下提高驅(qū)油效率11.65 百分點，高于代學成等［4］制定的激活配方篩選評價指標（6百分點～9百分點）。

表9 物模驅(qū)油實驗結(jié)果

2.6 現(xiàn)場應用

陸9 油藏微生物驅(qū)先導試驗于2017 年11 月開始現(xiàn)場實施，應用的營養(yǎng)體系為本文所篩選的激活體系。試驗區(qū)4 口注入井，設(shè)計注入營養(yǎng)體系21.75×104m3（折算孔隙體積0.1 PV），預計增油4.98萬噸，提高采收率3.5%。截至2020 年10 月25 日，試驗區(qū)注劑15.13×104m3。完成總方案的69%。目前現(xiàn)場試驗效果處于高峰期，陸9 微生物驅(qū)礦場試驗累積核實增產(chǎn)1.8×104t，階段提高采收率1.3%，平均單井日產(chǎn)油3.1 t，微生物驅(qū)效果明顯。

3 結(jié)論

針對陸9井區(qū)砂巖油藏主要采油功能菌的營養(yǎng)需求，篩選出一套高效而廉價的營養(yǎng)體系。該體系乳化原油效果較好，激活主要采油功能基因烴氧化基因達到107copies/mL，脂肽產(chǎn)生菌srfA基因均達到了105copies/mL，鼠李糖脂產(chǎn)生菌rhlAB基因均達到了104copies/mL；物模驅(qū)油實驗提高采收率11.65百分點。

體系選取工業(yè)發(fā)酵副產(chǎn)品和農(nóng)業(yè)廢棄物為激活劑的主要原料，與現(xiàn)場在用配方相比，注入藥劑成本顯著降低20.25%。配方成分廉價易得、便于運輸和儲存，適合油田低成本開發(fā)的需要，具有良好的應用價值。

通過單因素試驗、Plackett-Burman實驗、去因子實驗、響應面實驗等，并結(jié)合微生物激活評價方法，形成一套微生物激活劑篩選評價方法流程，為今后開展微生物驅(qū)激活劑篩選評價提供借鑒。