艾青華 江久 程衛(wèi)國 張妍

肺癌位居我國惡性腫瘤發(fā)病首位，研究報告顯示，2015年我國新發(fā)肺癌病例約為78.7萬例，發(fā)病率為57.26/10萬,中標(biāo)率為35.96/10萬[1]，已成為對國民健康造成嚴(yán)重威脅的疾病之一。手術(shù)、放化療、免疫療法及中醫(yī)藥治療是目前非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)的主要治療手段，盡管近年來微創(chuàng)手術(shù)、精準(zhǔn)放療、靶向治療、射頻消融治療等取得了長足的發(fā)展，但其總體5年生存率仍不高，約10%～20%。腫瘤微環(huán)境是腫瘤細(xì)胞賴以生存和發(fā)展的場所，調(diào)控腫瘤微環(huán)境成為了腫瘤治療的重要新策略。陽和湯出自《外科證治全生集》，具有溫陽散寒、活血化痰和通絡(luò)散結(jié)的功效，臨床常用于治療骨結(jié)核、腫瘤、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、無菌性肌肉深部膿腫、慢性婦女乳腺小葉增生、痛經(jīng)等證屬陽虛寒凝者。近年來廣泛應(yīng)用于腫瘤的臨床治療，臨床研究表明陽和湯聯(lián)合放化療治療腫瘤效果優(yōu)于單純使用放化療方案，陽和湯觀察組可顯著提高患者生存、生命質(zhì)量，減輕患者痛苦[2]。然而，其化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和抗NSCLC的作用機(jī)理尚不明確。為進(jìn)一步探明陽和湯(本研究結(jié)合臨床實際應(yīng)用，在原方基礎(chǔ)上加淫羊藿、枸杞，減鹿角膠)的化學(xué)物質(zhì)基礎(chǔ)和抗NSCLC的作用機(jī)理，通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實驗文獻(xiàn)聚類分析探討陽和湯在體內(nèi)“多成分—多靶點—多通路”的整體藥理作用機(jī)制，從分子水平來解析中藥復(fù)方及配伍的科學(xué)基礎(chǔ)，為中醫(yī)治療肺癌提供新思路和用藥參考。

1 材料和方法

1.1 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

1.1.1 陽和湯成分靶點和NSCLC靶點篩選 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫[3](https://tcmspw.com/tcmsp.php)檢索白芥子、甘草、干姜、枸杞、麻黃、肉桂、熟地黃以及淫羊藿的化合物成分，本研究中，口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%和類藥性(class of drugs，DL)≥0.12的化合物被選擇用于后續(xù)研究，將納入的化合物成分通過TCMSP數(shù)據(jù)庫進(jìn)行成分的靶點獲取，經(jīng)匯總刪重后，白芥子獲得6個化合物成分，74個靶點；甘草獲得98個化合物成分，230個靶點；干姜獲得11個化合物成分，102個靶點；枸杞獲得55個化合物成分，200個靶點；麻黃獲得39個化合物成分，255個靶點；肉桂獲得4個化合物成分，63個靶點；熟地黃獲得9個化合物成分，36個靶點；淫羊藿獲得25個化合物成分，218個靶點。以“non-small cell lung cancer”為關(guān)鍵詞，在GeneCards[4]數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、 NCBI基因數(shù)據(jù)庫[5](https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)進(jìn)行人類基因檢索，其中GeneCards的數(shù)據(jù)將Relevance score進(jìn)行中位值的篩選以獲得更相關(guān)的靶點。經(jīng)檢索，在GeneCards數(shù)據(jù)庫檢索到2453條相關(guān)基因，NCBI數(shù)據(jù)庫獲得1939個基因。將這2個數(shù)據(jù)庫的基因合并刪重之后，得到3132個NSCLC相關(guān)基因，隨后將篩選出的陽和湯成分靶點和NSCLC靶點輸入韋恩圖制作軟件Venny 2.1，得到190個交集靶點，作為陽和湯作用于NSCLC的預(yù)測靶點，進(jìn)行后續(xù)的蛋白—蛋白互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)構(gòu)建、基因本體論(Gene ontology，GO)分析和京都基因與基因組百科全書(Kyoto encyclopedia of genes and Genomes，KEGG)通路富集分析。

1.1.2 陽和湯治療NSCLC靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和關(guān)鍵成分篩選 為了更好地理解陽和湯治療NSCLC 作用機(jī)制中相應(yīng)靶點之間的復(fù)雜關(guān)系，本研究將納入的成分、NSCLC以及作用靶點為基礎(chǔ)，構(gòu)建了成分—疾病—靶點網(wǎng)絡(luò)圖，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0[6]中進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)圖的繪制并進(jìn)行拓?fù)浞治觯瑢⒊煞诌M(jìn)行degree的排序，將大于2倍平均度值的成分篩選出來作為關(guān)鍵成分。

1.1.3 交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建和拓?fù)浞治?為闡明靶點蛋白在生物網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)水平的作用，將獲取的交集靶點輸入String數(shù)據(jù)庫[7](https://string-db.org/cgi/input.pl)進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，將生物種類設(shè)定為“人類(Homo sapiens)”，可信度設(shè)置為>0.9，構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)。本研究將獲取的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cystoscape 3.8.0中，通過Network Analyzer工具進(jìn)行拓?fù)浞治?，以自由?degree)、介數(shù)(betweenness centrality)、 平均最短路徑長度(average shortest path length) 和接近中心性(closeness centrality)這四個參數(shù)為參考標(biāo)準(zhǔn)，通過degree排序，選取分值大于平均分的基因作為關(guān)鍵靶點，并篩選出前20個關(guān)鍵靶點。

1.1.4 MCODE聚類分析 通過MCODE分析[8]進(jìn)行關(guān)鍵基因的篩選，將已經(jīng)構(gòu)建好的PPI網(wǎng)絡(luò)導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0中，打開MCODE模塊進(jìn)行基因簇的分析以及核心靶點的篩選。

1.1.5 GO富集分析和KEGG通路富集 為進(jìn)一步說明藥物與疾病交集靶點在基因功能和信號通路中的作用，本研究將藥物疾病交集靶點進(jìn)行GO 的生物過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)、細(xì)胞組分(cell component，CC)富集，引用String 數(shù)據(jù)庫，將校正P值≤0.05的項目進(jìn)行篩選，使用R 3.6.3 軟件，安裝并引用clusterProfiler、enrichplot、ggplot2包，進(jìn)行柱狀圖和氣泡圖繪制。

1.1.6 陽和湯治療NSCLC的通路和靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 將陽和湯—成分—NSCLC—通路—靶點網(wǎng)絡(luò)文件導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0進(jìn)行通路網(wǎng)絡(luò)圖的繪制，更直觀地展示陽和湯活性成分在治療NSCLC過程中可能的作用通路和靶點。

1.2 實驗文獻(xiàn)聚類分析

基于對陽和湯及關(guān)鍵成分槲皮素、木犀草素、山奈酚作用于NSCLC的實驗文獻(xiàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，進(jìn)一步佐證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測結(jié)果。

1.2.1 文獻(xiàn)來源及檢索方式 2021年6月計算機(jī)檢索PubMed、EMBASE、Science Direct、中國知網(wǎng)(CNKI)、萬方知識服務(wù)平臺、維普網(wǎng)(VIP)和中國生物醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(CBM)等數(shù)據(jù)庫，檢索均從建庫截至2021年6月。中文檢索詞：陽和湯、槲皮素、木犀草素、山奈酚、大鼠、小鼠、細(xì)胞、通路、實驗；非小細(xì)胞肺癌、肺癌、肺腫瘤、NSCLC；英文檢索詞：Yanghe decoction、Quercetin、luteolin、Kaempherol、cell、non-small cell lung cancer、lung cancer、lung carcinoma、NSCLC。

1.2.2 文獻(xiàn)納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)陽和湯及關(guān)鍵成分槲皮素、木犀草素、山奈酚對NSCLC作用機(jī)制的實驗研究；(2)陽和湯為中藥復(fù)方制劑，實驗用直接煎煮或成分萃取均可，槲皮素、木犀草素、山奈酚實驗成分包括天然萃取與化學(xué)合成；(3)研究類型包括體內(nèi)實驗(in vivo)和體外實驗(in vitro)；(4)文獻(xiàn)報道數(shù)據(jù)必須有但不限于作用靶點；(5)語言包括中文或英文。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)作者與內(nèi)容、數(shù)據(jù)重復(fù)文獻(xiàn)，包括期刊論文與學(xué)位論文內(nèi)容/數(shù)據(jù)相同文獻(xiàn)，中、英文研究者與研究內(nèi)容、數(shù)據(jù)相同文獻(xiàn)，均只選用最新發(fā)表文獻(xiàn)1篇，其余視為重復(fù)文獻(xiàn)排除；(2)綜述類文獻(xiàn)；(3)藥理研究、實驗、方藥機(jī)制類文獻(xiàn)無作用靶點數(shù)據(jù)或者實驗結(jié)果不確定的文獻(xiàn)；(4)關(guān)于槲皮素、木犀草素、山奈酚經(jīng)修飾后的衍生物實驗研究的文獻(xiàn)。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)處理 使用Noteexpress進(jìn)行文獻(xiàn)管理和初篩，然后逐篇閱讀文獻(xiàn)全文，將符合納入標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)收入，利用Microsoft Excel 2016建立數(shù)據(jù)庫，錄入文獻(xiàn)的外部特征，如：題目、作者、文獻(xiàn)發(fā)表時間、發(fā)表形式等；文獻(xiàn)內(nèi)部信息，如：實驗類型、實驗藥物、實驗動物/細(xì)胞、檢測靶點、靶點信號的上調(diào)/下調(diào)、可能的信號通路等。對于檢測靶點、靶點信號的上調(diào)/下調(diào)數(shù)據(jù)信息進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化，以文獻(xiàn)中檢測出的靶點頻次為數(shù)據(jù)的度值，然后形成矩陣數(shù)據(jù)，導(dǎo)入Heatmap illustrator軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果以矩陣熱圖表示，對于其他類信息采用描述性統(tǒng)計方法。

2 結(jié)果

2.1 基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析陽和湯治療NSCLC的作用機(jī)制

2.1.1 藥物疾病交集靶點的PPI網(wǎng)絡(luò)分析和拓?fù)浞治?通過前期數(shù)據(jù)挖掘和靶點篩選，課題組將190個交集靶點導(dǎo)入Cytoscape軟件繪制PPI網(wǎng)絡(luò)圖，如圖1所示，該網(wǎng)絡(luò)中有190個節(jié)點，832條邊，平均度值為8.76。圖中的節(jié)點顏色和大小根據(jù)度值調(diào)整，度值越大顏色越深，度值越大線越粗，從粗到細(xì)表示邊介數(shù)從大到小。拓?fù)浞治鐾ㄟ^degree排序，總共篩選出個68關(guān)鍵靶點，將前20個靶點使用R 3.6.3進(jìn)行圖片繪制，橫坐標(biāo)為每個靶點的度值，見圖2。其中度值最高的為MAPK1，其他依次為MAPK3、STAT3、Akt1、JUN等，所有的關(guān)鍵基因都在NSCLC中的發(fā)生發(fā)展過程中扮演重要角色。

圖1 關(guān)鍵靶點網(wǎng)絡(luò)互作圖

圖2 拓?fù)浞治鼋Y(jié)果(前20個關(guān)鍵靶點)

2.1.2 核心基因與關(guān)鍵成分 通過MCODE分析進(jìn)行關(guān)鍵基因的篩選，總共得到7個基因簇和6個核心基因，核心基因為CYP3A4、INSR、RXRB、PLG、PGR、SCD。將成分—疾病—靶點網(wǎng)絡(luò)圖，導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 中進(jìn)行拓?fù)浞治?。將成分進(jìn)行degree的排序，將大于2倍平均度值的成分篩選出來作為關(guān)鍵成分，總共有11個關(guān)鍵成分(度中心性值越高成分越重要)，詳見表1。

表1 陽和湯關(guān)鍵成分信息表

根據(jù)關(guān)鍵成分的排序賦值成分在關(guān)聯(lián)藥物中的分值，槲皮素為11，其他10種成分依次為10至1，然后統(tǒng)計關(guān)聯(lián)藥物的分值，關(guān)聯(lián)藥物及分值詳見圖3。除熟地黃之外，陽和湯其余藥物均與關(guān)鍵成分關(guān)聯(lián)，其中麻黃、甘草、淫羊藿分值居前三，并顯著高于其他的關(guān)聯(lián)藥物。

圖3 陽和湯關(guān)鍵成分與關(guān)聯(lián)藥物分值圖

2.1.3 藥物疾病交集靶點的GO富集與KEGG通路富集 通過GO富集分析到2405條生物過程，165項分子功能相關(guān)，68項細(xì)胞組分相關(guān)。將藥物疾病交集靶點進(jìn)行KEGG通路富集分析，總共富集到168條信號通路，并篩選出最顯著的前20條通路繪制氣泡圖，詳見圖4。

圖4 KEGG通路富集氣泡圖

2.1.4 陽和湯治療NSCLC的多成分、多靶點、多通路網(wǎng)絡(luò)圖 運用Cytoscape 3.8.0進(jìn)行中藥—成分—疾病—通路—靶點網(wǎng)絡(luò)圖的繪制，見圖5。如圖所示，紫色為中藥，藍(lán)色為化合物，黃色為中藥作用于疾病的靶點，綠色為最顯著的前20條通路，紅色為NSCLC，直觀地展示了陽和湯活性成分在治療NSCLC過程中的多成分—多通路—多靶點的作用特點。

圖5 陽和湯治療NSCLC的中藥—成分—疾病—通路—靶點網(wǎng)絡(luò)圖

2.2 基于實驗研究文獻(xiàn)聚類分析陽和湯治療NSCLC的作用機(jī)制

2.2.1 納入文獻(xiàn)及實驗情況 本次納入研究的文獻(xiàn)共44篇，其中中文35篇、英文9篇，發(fā)表年份與篇數(shù)分別為(2005/3，2007/3，2009/1，2010/1，2012/6，2013/1，2014/3，2015/3，2016/2，2017/5，2018/5，2019/4，2020/5，2021/2)。44篇文獻(xiàn)中納入實驗50個，其中體內(nèi)實驗14個，體外實驗36個，實驗動物包括大鼠(2)和小鼠(12)，實驗用細(xì)胞系/株與實驗次數(shù)分別為(A549/26，H460/5，H1975/3，H1299/1，HCC827/1，BEAS-2B/1)。

2.2.2 陽和湯及關(guān)鍵成分作用于NSCLC的靶點聚類分析 研究將標(biāo)準(zhǔn)化處理后的檢測靶點、靶點信號的上調(diào)/下調(diào)數(shù)據(jù)導(dǎo)入Heatmap illustrator軟件進(jìn)行聚類分析，結(jié)果以矩陣熱圖表示，其中圖6左側(cè)為體內(nèi)實驗檢測槲皮素(Que)、木犀草素(Lut)、陽和湯(YHD)治療NSCLC的作用靶點與靶點信號的表達(dá)，圖6右側(cè)為體外實驗檢測槲皮素(Que)、木犀草素(Lut)、山奈酚(Kae)治療NSCLC的作用靶點與靶點信號的表達(dá)，紅色顯示上調(diào)，藍(lán)色顯示下調(diào)，顏色的深淺顯示度值。

圖6 陽和湯治療NSCLC的靶點信號熱圖

圖6顯示促腫瘤細(xì)胞凋亡信號的上調(diào)，如Bax/Bcl-2、p53、PTEN等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長/抑制腫瘤細(xì)胞凋亡信號的下調(diào)，如VEGF、EGFR、Akt、Vimentin、Src等，其可能的通路幾乎覆蓋了NSCLC的主要的通路，如Src/Fn14/NF-κB、PTEN-PI3K-Akt/mTOR、EGFR/ALK、RAS-MAPK、JAK-STAT、HER3，陽和湯的關(guān)鍵成分作用點有相同也有不同，具有靶點信號調(diào)節(jié)的互補和疊加效應(yīng)，充分地顯示了中藥復(fù)方多成分—多靶點—多通路治療腫瘤的作用機(jī)制。

3 討論

《素問·陰陽應(yīng)象大論篇》云：“陽化氣，陰成形?！敝嗅t(yī)將肺癌稱為“肺積”，陽虛陰結(jié)、氣血虧虛、痰瘀互結(jié)是肺癌的主要病機(jī)。陽和湯溫陽補血，散寒通滯，可起“益火之源，以消陰翳”之功，以溫消積，多聯(lián)合放化療或者靶向治療脾腎陽虛型中晚期NSCLC。本研究發(fā)現(xiàn)陽和湯含有多個具有一定的抗腫瘤作用的關(guān)鍵成分，如槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、異甘草素等，顯著關(guān)聯(lián)藥物為麻黃、甘草、淫羊藿，提示開通腠理逐寒凝、溫通氣血養(yǎng)肺金是陽和湯治療陽虛型肺癌的主要機(jī)制。近期研究認(rèn)為槲皮素和木犀草素均能調(diào)控NF-κB信號通路，均可聯(lián)合吉非替尼起到協(xié)同抗NSCLC作用，其中槲皮素下調(diào)p-Akt蛋白的表達(dá)水平，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[9]，通過抑制Src/Fn14/NF-κB信號通路，抑制NSCLC細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，槲皮素的低細(xì)胞毒性和高豐度代表了其在NSCLC臨床治療中的應(yīng)用前景[10]。有研究認(rèn)為，槲皮素通過調(diào)控SIRT1/AMPK[11]、AMPK/mTOR[12]信號通路可誘導(dǎo)自噬促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡。木犀草素可降低TBK1的表達(dá)，部分恢復(fù)對吉非替尼的敏感性[13]。另有研究認(rèn)為，下調(diào)AIM2可能是木犀草素對NSCLC的抗腫瘤作用關(guān)鍵途徑[14]，木犀草素可有效抑制H460細(xì)胞的增殖和遷移，這可能與其對E-cadherin和N-cadherin等上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)標(biāo)志蛋白的調(diào)控有關(guān)[15]。山奈酚能通過調(diào)控miRNA21/PTEN/Akt信號通路抑制NSCLC A549細(xì)胞增殖[16]，通過抑制ERRα降低NSCLC A549細(xì)胞侵襲和遷移能力，并抑制其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[17]。另外，成分—靶點網(wǎng)絡(luò)中的關(guān)鍵靶點主要有MAPK、STAT3、Akt1、IL-6、EGFR等，這些蛋白參與細(xì)胞增殖、分化、癌變、轉(zhuǎn)移、凋亡等，調(diào)控靶點蛋白的表達(dá)是抑制NSCLC的過程中起到重要作用。結(jié)合GO及KEGG通路富集分析，陽和湯可能通過調(diào)控MAPK/NF-κB/STAT/Akt1/TNF等多級交叉的信號通路抑制腫瘤血管生成，抑制腫瘤細(xì)胞增殖與遷移，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析充分體現(xiàn)了陽和湯治療NSCLC多通路、多靶點的網(wǎng)絡(luò)模式，中藥復(fù)方的多成分可以通過多種途徑作用于疾病的多個方面，并且產(chǎn)生相互協(xié)同效應(yīng)。研究的第二部分通過對實驗研究文獻(xiàn)的聚類分析，進(jìn)一步清晰地展示了陽和湯及其關(guān)鍵成分作用于NSCLC的生物靶點分布及靶點信號的調(diào)節(jié)，不僅佐證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的分析結(jié)果，并且更加豐富和具體，明確到成分對應(yīng)靶點信號的調(diào)節(jié)方式，成分之間靶點互補以及共同靶點的作用關(guān)系。在過去的20年中，NSCLC治療已經(jīng)從以細(xì)胞毒性治療為中心發(fā)展到以肺腺癌和肺鱗癌中特定分子亞型為靶點的有效且耐受性更好的治療方案[18]，近年有多項臨床研究認(rèn)為靶向藥聯(lián)合中藥復(fù)方治療NSCLC更能獲益，中藥復(fù)方可起到增敏增效、提高免疫力、提高患者生活質(zhì)量、減少不良反應(yīng)的作用[19]。本研究納入分析的文獻(xiàn)也為此提供了實驗研究依據(jù)，體內(nèi)實驗研究顯示陽和湯有較好的免疫調(diào)節(jié)作用，例如增加NK細(xì)胞活性[20]，提高CD3+、CD4+/CD8+比率，提高荷瘤小鼠體質(zhì)量、脾指數(shù)和胸腺指數(shù)及血清Th1、細(xì)胞因子IL-2 含量，從而使荷瘤機(jī)體內(nèi)Th1/Th2平衡漂移向Th1 占主導(dǎo)的地位轉(zhuǎn)換，起到抑制腫瘤的效果[21]，為陽和湯在臨床應(yīng)用中減輕放化療不良反應(yīng)，改善臨床癥狀提供了體內(nèi)實驗依據(jù)。體外實驗研究中部分實驗采用TKI靶向藥耐藥株H1975[22]、PC9/GR10來檢測陽和湯關(guān)鍵成分的抗耐藥效果，結(jié)果顯示對于重啟腫瘤細(xì)胞凋亡信號通路具有積極作用，從而驗證了陽和湯在臨床應(yīng)用中對TKI靶向藥的增敏效果。目前一線靶向治療NSCLC藥物吉非替尼、奧希替尼、厄洛替尼等治療的靶點為EGFR，有研究結(jié)果顯示肺癌患者中肺陰虧虛型、氣虛虧虛型、痰濕蘊肺型、腎陽虛衰型、肺脾氣虛型EGFR表達(dá)依次增高[23]，提示扶陽類中藥改善肺癌患者的陽虛體質(zhì)可增強EGFR-TKI藥效。陽和湯篩選出的關(guān)鍵靶點中也有EGFR，文獻(xiàn)聚類分析顯示EGFR下調(diào)頻次最高，為陽和湯聯(lián)合靶向藥治療陽虛型肺癌提供了理論依據(jù)和用藥參考。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和實驗文獻(xiàn)聚類分析以闡明陽和湯及關(guān)鍵成分的作用靶點及網(wǎng)絡(luò)作用機(jī)制，對于臨床治療NSCLC不同亞型化藥耐藥、TKI抑制劑靶向藥耐藥的患者，在聯(lián)合用藥的藥方配伍上具有一定的指導(dǎo)意義，為研制更為有效的抗腫瘤藥物提供了一定的理論依據(jù)。本研究首次嘗試采用實驗文獻(xiàn)數(shù)據(jù)挖掘、熱圖聚類分析來佐證網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究結(jié)果，實驗文獻(xiàn)由于是全網(wǎng)檢索，實時采集，數(shù)據(jù)更新更全，可彌補網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫更新滯后的不足，增加了研究深度與廣度，熱圖分析更能清晰地呈現(xiàn)研究結(jié)果，適合在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究中推廣。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)在藥物發(fā)現(xiàn)的過程中發(fā)揮了越來越重要的作用，但在這個領(lǐng)域仍存在一定的局限性，目前采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)針對疾病篩選出的活性成分并非是中藥材現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中的主要質(zhì)控成分或藥材中含量較高的成分，篩選出某些活性成分相似度較高，如槲皮素、山柰酚和谷甾醇等具有廣泛的活性，在不同藥物或處方的篩選中，篩選出來的結(jié)果有較大程度的相似性，顯然這一現(xiàn)象有待進(jìn)一步探討[24]。桂皮醛作為肉桂標(biāo)準(zhǔn)活性成分，能有效抑制細(xì)胞凋亡，通過抑制Wnt/β-catenin信號通路，逆轉(zhuǎn)NSCLC細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化[25]，但在本研究未篩選出來，提示數(shù)據(jù)庫尚有待完善，篩選成分的標(biāo)準(zhǔn)尚有待優(yōu)化。另中藥復(fù)方君臣佐使的配伍不僅針對疾病，也以證型為主，例如，中藥治療NSCLC有多個方劑，不同的方劑治療不同證型，中藥標(biāo)準(zhǔn)活性成分并不一定具有抗腫瘤作用，更側(cè)重于改善主要癥狀，從整體上改善內(nèi)環(huán)境，激發(fā)人體自愈機(jī)制，癥狀的改善對患者產(chǎn)生積極心理作用，心理作用并非藥理機(jī)制，這種復(fù)雜的、間接的抗腫瘤機(jī)制無法在網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)中體現(xiàn)出來。本研究陽和湯中的熟地黃，用量最大，檢索2020版《中華人民共和國藥典(一部)》[26]，熟地黃標(biāo)準(zhǔn)活性成分為地黃苷D，并不具有抗腫瘤作用，地黃中的抗腫瘤作用成分為地黃多糖，地黃多糖在炮制過程發(fā)生了水解反應(yīng)，其含量明顯降低，抗腫瘤作用也隨之減弱，僅從藥物成分來看，生地黃抗腫瘤作用更佳[27]，但針對陽虛型腫瘤患者，生地黃藥性偏寒，不可多用，重用藥性甘溫的熟地黃則能生精益髓，補陽祛邪，其藥理作用主要為抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、促進(jìn)造血、抗疲勞[28]，起到整體調(diào)節(jié)和體質(zhì)改善作用，利于其他藥物中的抗腫瘤活性成分藥理機(jī)制的發(fā)揮。中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)還需要經(jīng)過不斷地完善和改進(jìn)，不僅將其與藥理學(xué)、藥動學(xué)、毒理學(xué)和藥效學(xué)等學(xué)科有效結(jié)合，更要堅持以中醫(yī)藥整體觀念和辨證論治思維進(jìn)行課題研究的科學(xué)設(shè)計，使篩選得到的活性成分和作用機(jī)制更有說服力。

注：本文出現(xiàn)的英文簡寫之中文全稱對應(yīng)如下：

槲皮素(quercetin，Que)

木犀草素(luteolin，Lut)

山奈酚(kaempferol，Kae)

腺嘌呤核糖核苷酸活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase，AMPK)

黑素瘤缺乏因子2(absent in melanoma 2，AIM2)

絲/蘇氨酸激酶(serine/threonine kinase，AKT)

間變性淋巴瘤激酶(anaplastic lymphoma kinase, ALK)

激活蛋白-1(activator protein-1，AP-1)

淀粉樣β前體蛋白(amyloid beta precursor protein，APP)

自噬相關(guān)5、7、12同源物(autophagy related 5、7、12 homolog，Atg5、7、12)

B淋巴細(xì)胞瘤-2基因中X蛋白比值(BCL2-associated X/B-cell lymphoma-2，bax/bcl-2)

過氧化氫酶(catalase，CAT)

周期蛋白D1(cyclin D1，CCND1)

細(xì)胞分裂周期2(cell division cycle 2，CDC2)

髓細(xì)胞組織增生病毒癌基因同源物(myelocytomatosis viral oncogene homolog，c-Myc)

細(xì)胞色素c氧化酶亞基2，(cytochrome c oxidase subunit 2，COX-2)

趨化因子(C-X-C基元)配體8[chemokine (C-X-C motif) ligand 8，CXCL8]

細(xì)胞色素P4503A4酶(cytochrome enzyme code P4503A4，CYP3A4)

肝癌缺失1(deleted in liver cancer 1，DLC-1)

雙特異性磷酸酶6(dual specificity phosphatase 6，DUSP6)

表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)

上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transitions, EMT)

雌激素受體相關(guān)受體α(recombinant estrogen related receptor alpha，ERRα)

雌激素受體1(estrogen receptor 1)

局部粘著斑激酶(focal adhesion kinase，F(xiàn)AK)

成纖維細(xì)胞生長因子誘導(dǎo)分子-14(fibroblast growth factor-inducible 14，F(xiàn)n14)

v-fos FBJ鼠科骨肉瘤病毒癌基因同源物(v-fos FBJ murine osteosarcoma viral oncogene homolog，F(xiàn)OS)

谷胱甘肽(glutathiore, GSH)

人類表皮生長因子受體-2,3(human epidermal growth factor receptor 2,3, HER2,3)

缺氧可誘導(dǎo)因子1(hypoxia inducible factor，HIF-1)

白細(xì)胞介素(interleukin，IL)

導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)

胰島素受體(insulin receptor，INSR)

兩面神激酶(janus kinase，JAK)

v-jun肉瘤病毒17(v-jun sarcoma virus 17，JUN)

亮氨酸氨肽酶3(leucine aminopeptidase 3，LAP3)

微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(microtubule-associated protein 1 light chain3，LC3)

絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)

鼠類轉(zhuǎn)化3T3細(xì)胞雙分2,4(murine double minute 2，Mdm2,4)

微小核糖核酸34a-5p(micro RNA-34a-5p，miR-34a-5p)

絲裂素活化蛋白激酶磷酸酶-1(mitogen activated protein kinase phosphatase 1，MKP-1)

基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases, MMPs)

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mechanistic target of rapamycin，mTOR)

銜接因子蛋白1(adaptor protein 1，NCK1)

核因子-κB(nuclear factor-κB，NF-κB)

自然殺傷細(xì)胞(nature killer cell，NK-C)

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(nadph oxidase，NOX)

核受體亞家族3組C成員1(nuclear receptor subfamily 3 group C member 1，NR3C1)

腫瘤蛋白21,53,62(tumor protein 21,53,62，p21,53,62)

聚腺苷二磷酸核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)

增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)

丙酮酸脫氫酶激酶同工酶1(pyruvate dehydrogenase kinase isozyme 1，PDK1)

孕酮受體(progesterone receptor，PGR)

磷酸化組蛋白H3(phosphorylated histone H3，PHH3)

磷脂酰肌醇 -3- 激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)

血纖維蛋白溶酶原(plasminogen，PLG)

脯氨酸豐富蛋白BstNI亞家族( proline-rich protein BstNI subfamily，PRB)

蛋白S6激酶(protein S6 kinase，p-S6K)

第10染色體缺失與張力蛋白同源的磷酸酶基因(gene of phosphate and tension homology deleted on chromosome ten，PTEN)

鼠科白血病病毒癌基因同源物(rat eukemia viral oncogene homolog，RAF)

鼠肉瘤病毒相關(guān)基因(rat sarcoma virus related genes，RAS)

成視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤1(retinoblastoma 1，RB1)

網(wǎng)狀內(nèi)皮細(xì)胞過多癥病毒癌基因同源物A(reticuloendotheliosis virus oncogene homolog a，RELA)

類視黃醇X 受體(β retinoid X receptor，RXRB)

硬脂?；o酶A脫氫酶(stearoyl-CoA desaturase，SCD)

沉默信息調(diào)節(jié)因子1(sirtuin 1，SIRT1)

錳超氧化物歧化酶2(manganese superoxide dismutase superoxide dismutase 2，SOD2)

信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal transducer and activator of transcription3，STAT3)

轉(zhuǎn)化生長因子β引導(dǎo)(transforming growth factor beta-induced，TGFBI)

胰激肽釋放酶抑制劑(trypsin kallikrein inhibitor，TKI)

腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)

血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)

血管內(nèi)皮生長因子A(vascular endothelial growth factor A，VEGFA)

無翅基因β-連環(huán)蛋白(wingless/β-catenin，Wnt/β-catenin)