劉奕志 王鑫 孫潤(rùn)權(quán) 劉思遠(yuǎn) 王帥 李志剛

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性變疾病，其起病隱蔽、呈進(jìn)行性惡化、與年齡相關(guān)，臨床癥狀以近事記憶障礙、學(xué)習(xí)認(rèn)知能力減退等為主要表現(xiàn)，又稱老年性癡呆。AD以其具有一定的家族遺傳性而明顯區(qū)別于其他類型的癡呆。隨著人口老齡化程度的加深，有研究預(yù)測(cè)2050年我國(guó)老年人口(>60歲)將達(dá)4.5億人，AD患者將超過(guò)3000萬(wàn)[1]。AD的治療機(jī)制尚未完全闡明，探索其治療機(jī)制及治療方法仍具重大意義。哺乳動(dòng)物Ⅲ類組蛋白去乙?；讣易逯械某聊畔⒄{(diào)節(jié)因子1(silent information regulator 1，SIRT1)可通過(guò)去乙?；瘷C(jī)體內(nèi)的組蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等，參與生物體內(nèi)神經(jīng)保護(hù)、炎性反應(yīng)、線粒體自噬等過(guò)程的調(diào)節(jié)[2]。有研究指出SIRT1基因敲除小鼠出現(xiàn)認(rèn)知缺陷，而過(guò)表達(dá)SIRT1的小鼠則學(xué)習(xí)記憶能力正常[3]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子O3A(forkhead box transcription factor O3A，F(xiàn)OXO3A)是SIRT1下游的主要靶點(diǎn)，參與調(diào)控氧化應(yīng)激、細(xì)胞自噬等過(guò)程[4-5]，在維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)及神經(jīng)細(xì)胞存活方面具有潛在的保護(hù)作用。本團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)“通督啟神”法電針可明顯降低AD小鼠海馬區(qū)炎性指標(biāo)白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、環(huán)氧化酶-2( cyclooxygenase-2,COX-2)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)，改善AD小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力[6-7]。本實(shí)驗(yàn)在前期研究基礎(chǔ)上以6月齡淀粉樣前體蛋白/早老蛋白1(amyloid precursor protein/presenilin-1，APP/PS1)雙轉(zhuǎn)基因小鼠為AD動(dòng)物模型，通過(guò)定位與定量檢測(cè)SIRT1、FOXO3A蛋白在小鼠海馬中的表達(dá)，探討電針干預(yù)治療AD的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

選取SPF級(jí)雄性，6月齡，APPswe/PS1dE9雙轉(zhuǎn)基因小鼠30只，6月齡同源同性別的C57BL/6野生鼠10只，體質(zhì)量(28±2)g。動(dòng)物均購(gòu)于江蘇金致和生物科技有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)992014-0004。于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京中醫(yī)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)單籠飼養(yǎng)。室溫維持在(24±2)°C，濕度保持在40%～60%。

1.2 主要試劑

SIRT1抗體(兔多克隆抗體，Proteintech，批號(hào)：13161-1-AP)、FOXO3A抗體(兔多克隆抗體，Proteintech，批號(hào)：10849-1-AP)、HRP標(biāo)記的羊抗兔IgG(Solarbio，批號(hào)：SE134)；抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-methyladenine，3-MA)(Sigma，批號(hào)：M9281)；蘇木素伊紅染色試劑盒(碧云天，批號(hào)：C0105S)、核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒(碧云天，批號(hào)：P0028)。

1.3 主要儀器

一次性無(wú)菌針灸針(0.25 mm×13 mm，北京中研太和醫(yī)療器械有限公司)；SDZ-V型華佗牌電針儀(蘇州醫(yī)療用品廠有限公司)；XR-XM101型Morris水迷宮圖像自動(dòng)采集和軟件分析系統(tǒng)(上海欣軟信息科技有限公司)；KF-PRO-120型數(shù)字病理切片掃描儀(寧波江豐生物)；Powerpac HQ型穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(美國(guó)Bio-Rad 公司)；W20M-2型恒溫水浴箱(美國(guó)SHELLAB公司)。

1.4 分組與干預(yù)方法

30只APP/PS1小鼠隨機(jī)分為模型組、電針組和電針+抑制劑組，每組10只。C57BL/6野生鼠10只為空白對(duì)照組?？瞻讓?duì)照組與模型組在電針組接受電針干預(yù)時(shí)被自制鼠套束縛，不做其他處理。電針組選取“百會(huì)穴”“印堂穴”“水溝穴”。主穴“百會(huì)”“印堂”均朝上平刺以防電針短路，水溝穴于電針干預(yù)過(guò)程中點(diǎn)刺，以小鼠眼球濕潤(rùn)為度。進(jìn)針深度為0.5 cm，針柄連接華佗牌電針儀，頻率1 Hz，電壓2 V，電流強(qiáng)度0.2 mA。電針+抑制劑組在電針干預(yù)前半小時(shí)，腹腔注射3-MA溶液(30 mg/kg)，之后同電針組一樣進(jìn)行電針干預(yù)。除電針+抑制劑組外，其余三組均在干預(yù)前30分鐘腹腔注射磷酸鹽緩沖溶液(30 mg/kg)，各組干預(yù)20分鐘/次，每天一次，共15天。

1.5 觀察指標(biāo)與檢測(cè)方法

1.5.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 在連續(xù)15天干預(yù)結(jié)束后，各組小鼠進(jìn)行Morris水迷宮測(cè)試。小鼠站臺(tái)被置于第Ⅰ象限的中央并保持站臺(tái)位置不變。第1天為適應(yīng)性訓(xùn)練，讓小鼠熟悉水迷宮環(huán)境，若小鼠60秒內(nèi)不能自行找到站臺(tái)，則人工引導(dǎo)其找到站臺(tái)，并記錄該鼠逃避潛伏期為60秒。第2天至第5天為隱蔽平臺(tái)實(shí)驗(yàn)，每天Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ象限各訓(xùn)練1次。本實(shí)驗(yàn)選取第Ⅳ象限逃避潛伏期為觀察指標(biāo)。第6天為空間探索實(shí)驗(yàn)，撤除第Ⅰ象限的站臺(tái)，每象限各訓(xùn)練1次。以第四象限為入水點(diǎn)記錄60秒內(nèi)小鼠的站臺(tái)穿越次數(shù)及原站臺(tái)所在象限的運(yùn)動(dòng)距離百分比。

1.5.2 蘇木素—伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色 完成為期6天的Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)后，第7天取材。各組小鼠稱重，行0.3%戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，待動(dòng)物徹底麻醉后，各組隨機(jī)選取4只小鼠行心臟灌流術(shù)，剝離完整大腦制作石蠟標(biāo)本，冠狀位切片，厚6 μm。將石蠟切片放置60 ℃烤箱1小時(shí)后，二甲苯脫蠟15分鐘兩次，梯度酒精下行各3分鐘，蘇木素8分鐘，自來(lái)水沖洗10分鐘，純水洗滌5秒，伊紅染色40秒，自來(lái)水沖洗60秒，梯度酒精上行各10秒，二甲苯各5分鐘，中性樹(shù)膠封片。待其干燥后，于顯微鏡下觀察。

1.5.3 免疫組化染色 將石蠟切片烤片脫蠟后，枸櫞酸鈉緩沖液90 ℃修復(fù)抗原20分鐘，隨后待其冷卻至室溫；PBS漂洗3次，每次5分鐘；甲醇雙氧水室溫孵育10分鐘，PBS漂洗同上；正常非免疫羊血清37 ℃孵育10分鐘，PBS漂洗同上；一抗(SIRT1抗體1∶400稀釋；FOXO3A抗體1∶800稀釋)4 ℃冰箱過(guò)夜；PBS漂洗；生物素標(biāo)記二抗37 ℃孵育10分鐘，PBS漂洗；DAB顯色1分鐘。常規(guī)脫水，透明，中性樹(shù)膠封片。待其干燥后，于顯微鏡下觀察。

1.5.4 蛋白免疫印跡法檢測(cè)SIRT1、FOXO3A表達(dá)情況 各組余下6只小鼠在快速斷頭分離出新鮮的海馬組織后，保存在液氮中。取研磨后的新鮮組織加入含PMSF的裂解液抽提全細(xì)胞蛋白。用核蛋白和胞漿蛋白提取試劑盒參照說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞核蛋白與細(xì)胞漿蛋白。用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。蛋白變性上樣，SDS-PAGE凝膠電泳60分鐘，轉(zhuǎn)膜90分鐘。封閉液封閉2小時(shí)后置于一抗稀釋液(SIRT1 1∶2 000；FOXO3A 1∶2 000)4°C孵育過(guò)夜。次日洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗稀釋液(1∶2 000)孵育60分鐘，將膜片置于X光片盒中于暗室中感光、顯影、定影。最后清水沖洗，晾干保存，掃描。IPP軟件分析各條帶灰度值。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 小鼠逃避潛伏期變化

重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果顯示組間比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)，時(shí)間因素有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明逃避潛伏期有隨時(shí)間變化的趨勢(shì)。時(shí)間和分組的交互作用有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，說(shuō)明時(shí)間因素的作用隨著分組的不同而不同。

與空白對(duì)照組同期對(duì)比，第2天模型組的逃避潛伏期明顯增加(P<0.05)，從第3天開(kāi)始模型組與空白對(duì)照組間的差異顯著(P<0.01)，提示APP/PS1模型小鼠造模成功。與模型組同天比較，電針組第4天、第5天的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05，P<0.01)，電針+抑制劑組第5天的逃避潛伏期明顯縮短(P<0.05)?？瞻讓?duì)照組、電針組、電針+抑制劑組第4天、第5天與第2天比較有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.01)。見(jiàn)表1，圖1。

表1 各組AD模型小鼠第四象限入水逃避潛伏期的變化秒)

圖1 各組AD模型小鼠逃避潛伏期變化趨勢(shì)圖

2.2 小鼠空間探索實(shí)驗(yàn)

與空白對(duì)照組對(duì)比，模型組小鼠穿越站臺(tái)次數(shù)及原站臺(tái)所在象限運(yùn)動(dòng)距離百分比顯著減少(P<0.01)。與模型組對(duì)比，電針組穿越原站臺(tái)次數(shù)明顯增多(P<0.05)，在目標(biāo)象限的運(yùn)動(dòng)距離百分比明顯擴(kuò)大(P<0.05)，電針+抑制劑組穿越原站臺(tái)次數(shù)及Ⅰ象限運(yùn)動(dòng)距離百分比僅有增長(zhǎng)趨勢(shì)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組AD模型小鼠站臺(tái)進(jìn)入次數(shù)及Ⅰ象限運(yùn)動(dòng)距離百分比的比較

2.3 小鼠海馬區(qū)HE染色

空白對(duì)照組小鼠海馬DG區(qū)顆粒層神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量較多，排列規(guī)則、緊密，核仁清晰；與空白對(duì)照組對(duì)比，模型組顆粒層神經(jīng)細(xì)胞減少，排列散亂，胞核深染，部分神經(jīng)元出現(xiàn)胞核固縮，胞體縮小、胞核溶解。電針組顆粒細(xì)胞層比模型組較厚，核固縮狀態(tài)、胞核染色及胞核溶解情況明顯好于模型組。電針+抑制劑組核溶及核縮情況介于模型組與電針組之間。見(jiàn)圖2。

注：A空白對(duì)照組;B模型組;C電針組;D電針+抑制劑組。

2.4 小鼠海馬區(qū)SIRT1、總FOXO3A平均光密度表達(dá)

SIRT1主要定位在神經(jīng)元的細(xì)胞核內(nèi)，F(xiàn)OXO3A主要定位于細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核中，陽(yáng)性表達(dá)呈棕褐色。與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬區(qū)SIRT1平均光密度明顯降低(P<0.01)，總FOXO3A平均光密度明顯升高(P<0.01)，且主要定位在細(xì)胞質(zhì)中；與模型組比較，電針組小鼠SIRT1平均光密度明顯上升(P<0.01)，總FOXO3A平均光密度明顯下降(P<0.01)，且主要定位在細(xì)胞核中，電針+抑制劑組SIRT1平均光密度升高(P<0.01)，總FOXO3A平均光密度有下降趨勢(shì)但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，且其主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。見(jiàn)圖3，表3。

圖3 各組AD模型小鼠海馬區(qū)SIRT1、FOXO3A蛋白表達(dá)比較(免疫組化，×400)

表3 各組AD模型小鼠海馬區(qū)SIRT1、FOXO3A平均光密度值比較

2.5 小鼠海馬區(qū)SIRT1、FOXO3A(細(xì)胞核)、FOXO3A(細(xì)胞質(zhì))蛋白表達(dá)

與空白對(duì)照組比較，模型組小鼠海馬區(qū)SIRT1、FOXO3A(細(xì)胞核)蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01)，F(xiàn)OXO3A(細(xì)胞質(zhì))蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，電針組小鼠FOXO3A(細(xì)胞質(zhì))蛋白表達(dá)顯著下降(P<0.01)，SIRT1、FOXO3A(細(xì)胞核)蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01)，電針+抑制劑組SIRT1、FOXO3A(細(xì)胞核)蛋白表達(dá)有所升高(P<0.05)，F(xiàn)OXO3A(細(xì)胞質(zhì))蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.01)。見(jiàn)圖4，表4。

注：A空白對(duì)照組;B模型組;C電針組;D電針+抑制劑組。

表4 各組AD模型小鼠海馬組織SIRT1、胞核FOXO3A、胞質(zhì)FOXO3A蛋白表達(dá)比較

3 討論

多項(xiàng)研究表明，SIRT1/FOXO3A信號(hào)通路的激活或抑制在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有神經(jīng)保護(hù)作用[8-10]。研究證實(shí)，SIRT1通路可介導(dǎo)FOXO3A活化，通過(guò)去乙?；疐OXO3A，激活各種自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)，之后恢復(fù)線粒體自噬[11-13]。對(duì)SIRT1/FOXO3A通路的研究可能有利于尋找治療AD的新靶點(diǎn)。SIRT1是依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸輔酶的去乙?；讣易宄蓡T之一，參與調(diào)節(jié)多種與線粒體增殖和自噬相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)及活性，對(duì)線粒體數(shù)量和質(zhì)量的調(diào)節(jié)起著主要作用[14-15]。轉(zhuǎn)錄因子FOXO3A對(duì)自噬的調(diào)控作用與其在細(xì)胞內(nèi)的定位有關(guān)，當(dāng)其位于細(xì)胞核內(nèi)，具有轉(zhuǎn)錄活性；相反，當(dāng)轉(zhuǎn)移至細(xì)胞質(zhì)時(shí)，則轉(zhuǎn)錄失活。SIRT1可通過(guò)去乙?；疐OXO3A，促進(jìn)FOXO3A的核轉(zhuǎn)位從而提高其轉(zhuǎn)錄活性[16]。本研究的免疫組化及蛋白免疫印跡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：APP/PS1模型小鼠海馬區(qū)的SIRT1蛋白表達(dá)顯著下降，而總FOXO3A蛋白表達(dá)明顯升高，且模型組小鼠FOXO3A主要分布在細(xì)胞質(zhì)中；在經(jīng)電針干預(yù)后，發(fā)現(xiàn)小鼠海馬區(qū)SIRT1蛋白表達(dá)明顯升高，總FOXO3A蛋白表達(dá)明顯下降并主要分布于細(xì)胞核內(nèi)；但在電針治療的基礎(chǔ)上增加自噬抑制劑3-MA后，小鼠海馬區(qū)SIRT1蛋白表達(dá)有所升高，總FOXO3A蛋白表達(dá)略有下降但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義且分布在細(xì)胞質(zhì)中為多。電針組與電針+抑制劑組均能增加海馬區(qū)SIRT1、胞核FOXO3A的陽(yáng)性表達(dá)和降低胞質(zhì)FOXO3A的陽(yáng)性表達(dá)，但電針+抑制劑組的增加/降低幅度均比電針組小，這可能與3-MA自噬抑制劑限制了電針的干預(yù)效果有關(guān)。

中醫(yī)認(rèn)為AD的病機(jī)主要為髓海不足，腦神失養(yǎng)。腦的正常生理活動(dòng)與陽(yáng)氣的溫煦和推動(dòng)作用有著密切關(guān)系，督脈入絡(luò)腦，總督一身之陽(yáng)氣，頭為百脈之宗，“百會(huì)”“印堂”“水溝”穴均位于頭面部、督脈上，其中“百會(huì)”穴位于頭頂部正中，“印堂”穴處于兩眉頭之正中，“水溝”穴在人中溝正中，均位于機(jī)體左右分界處，三穴同用共起通督啟神、調(diào)和陰陽(yáng)之功效。大量臨床研究表明針刺在改善AD患者的相關(guān)癥狀，延緩其疾病進(jìn)程的同時(shí)，針刺相比藥物治療副作用更少，顯著提高了AD患者的生活質(zhì)量[17]。本研究行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：電針組可以提高APP/PS1小鼠的空間學(xué)習(xí)記憶能力及記憶保持能力，形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果顯示電針組能改善海馬區(qū)神經(jīng)元的損傷程度，均提示電針組治療效果優(yōu)于電針+抑制劑組。

AD是世界范圍內(nèi)老年性癡呆最常見(jiàn)的原因。AD腦的組織病理學(xué)特征是細(xì)胞外淀粉樣斑塊(包含淀粉樣β肽)和神經(jīng)元內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)(包含過(guò)度磷酸化的Tau蛋白)[18]?！熬€粒體級(jí)聯(lián)假說(shuō)”[19]認(rèn)為AD早期病理表現(xiàn)與線粒體功能障礙關(guān)系密切,有證據(jù)表明在早期AD患者/動(dòng)物模型的大腦中存在明顯的線粒體功能障礙[20-21]。最近研究表明線粒體自噬存在障礙時(shí)，會(huì)引起氧化損傷和細(xì)胞能量的缺乏，最終使β淀粉樣蛋白和Tau蛋白異常堆積，從而導(dǎo)致突觸功能障礙和認(rèn)知缺陷，引發(fā)AD[22]。因此在AD早期進(jìn)行干預(yù)以提高自噬或線粒體自噬水平，從而及時(shí)清除嚴(yán)重受損的線粒體，維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，可能是治療AD的新途徑。

綜上所述，“通督啟神”法電針能夠明顯上調(diào)APP/PS1小鼠海馬區(qū)SIRT1蛋白表達(dá)，促進(jìn)FOXO3A核轉(zhuǎn)位，提高FOXO3A的轉(zhuǎn)錄活性，改善AD小鼠學(xué)習(xí)記憶能力和記憶保持能力。但FOXO3A是否提高了PINK1、BNIP3等與自噬/線粒體自噬相關(guān)的靶基因的轉(zhuǎn)錄，還需進(jìn)一步的深入研究。