王靜， 康媛潔， 劉翠翠， 石曉嵐， 馬彩玲

支氣管哮喘(bronchial asthma, BA)簡(jiǎn)稱為哮喘，是一種以氣道炎癥、氣道高反應(yīng)性、黏液高分泌、黏液水腫和氣道重塑為主要特征的異質(zhì)性炎癥性疾病，是最常見(jiàn)的慢性呼吸道疾病之一[1]。支氣管上皮細(xì)胞(bronchial epithelial cells, EBCs)作為呼吸道防御的第一道防線，可通過(guò)合成和釋放細(xì)胞因子及趨化因子等維持氣道微環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[2]。近年來(lái)的研究[2-4]發(fā)現(xiàn)，EBCs的損害、脫落能夠?qū)е職獾姥装Y和氣道重塑，而改善EBCs損傷被認(rèn)為是治療BA和其他高反應(yīng)性氣道疾病的重要策略。脂多糖(lipo polysaccharides, LPS)是構(gòu)成革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的重要成員，有誘導(dǎo)機(jī)體炎癥反應(yīng)的作用，常被作為EBCs損傷體外研究的刺激源[5-6]。G蛋白偶聯(lián)受體家族C組5型(G protein coupled receptor family C group 5 member A, GPRC5A)是G蛋白偶聯(lián)受體家族中的一員，在調(diào)節(jié)小鼠肺損傷過(guò)程中發(fā)揮重要作用[7]。文獻(xiàn)[8]報(bào)道，以GPRC5A為靶標(biāo)的藥物Tretinoin對(duì)BA有一定的治療作用，但GPRC5A在BA中的具體功能機(jī)制尚未明確。筆者擬通過(guò)研究LPS刺激下EBCs中GPRC5A的表達(dá)和GPRC5A過(guò)表達(dá)后對(duì)EBCs的細(xì)胞活力、細(xì)胞凋亡、炎癥反應(yīng)及氣道黏蛋白分泌的影響，探討GPRC5A對(duì)BA的影響和可能的作用機(jī)制。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 收集2018年2月—2020年1月西安市兒童醫(yī)院呼吸哮喘中心招募的42組重度BA患者，年齡(41.02±8.14)歲(29～58歲)，男性17例，女性25例。選取同期28組健康受試者作為對(duì)照組，年齡(39.71±9.40)歲(27～61歲)，男性15例，女性13例。參與者未接受全身類(lèi)固醇或者激素治療。根據(jù)GINA指南[9]，BA診斷基于反復(fù)發(fā)作的喘息、呼吸困難、咳嗽和痰液產(chǎn)生等。本研究通過(guò)西安市兒童醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理號(hào)20220065)，參與者均簽署書(shū)面知情同意書(shū)。

1.2 材料 正常人EBCs株16HBE(中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù))；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基(美國(guó)Gibco公司)；LPS(E.coliO55:B5)、MTT 試劑和脂質(zhì)體2000(美國(guó)Sigma公司)；胰蛋白酶、DMSO、青霉素-鏈霉素溶液和PCR引物(中國(guó)上海生工生物公司)；pcDNA3.1載體質(zhì)粒、Lipofectamine 3000試劑(美國(guó)Invitrogen公司)；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、裂解液和凋亡檢測(cè)試劑盒(中國(guó)上海碧云天生物公司)；RNeasy mini試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)；GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Promega公司)；SYBR R Premix Ex TaqTM試劑(日本TaKaRa公司)；PVDF 膜和發(fā)光顯影液(美國(guó)Millipore公司)；NF-κB p65抗體(1∶800, GTX00947, 美國(guó)Gene Tex公司)；κB抑制因子抗體(inhibitory kappa B alpha, IκBα)(1∶1 000, A1187, 美國(guó)ABclonal公司)；GPRC5A抗體(1∶1 000, ab155557)；Bax抗體(1∶500, ab53154)；Bcl-2抗體(1∶500, ab196495)；Cleaved caspase-3(1∶1 000, ab2302)；GAPDH 抗體(1∶1 000, ab9485)和辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗(1∶10 000, ab205718)(均為美國(guó)Abcam公司)。

1.3 方法

1.3.1 數(shù)據(jù)分析 從基因表達(dá)組學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)(gene expression omnibus, GEO)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)獲得轉(zhuǎn)錄組基因芯片的數(shù)據(jù)集GSE64913。該數(shù)據(jù)集共進(jìn)行17位重度BA患者和23位健康受試者外周氣道上皮組織的收集和基因表達(dá)分析。

1.3.2 組織樣本獲取及分析 通過(guò)支氣管上皮刷分別采集重度BA患者和對(duì)照組的氣道上皮組織，-80 ℃下凍存。

1.3.3 EBCs損傷模型的建立及分組 用含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)EBCs株16HBE，置于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)，于細(xì)胞匯合至70%～80%時(shí)傳代。首先進(jìn)行LPS誘導(dǎo)EBCs損傷模型的劑量及時(shí)間梯度試驗(yàn)，以不同質(zhì)量濃度的LPS(10、25、50、100 mg/mL)刺激狀態(tài)良好的16HBE細(xì)胞，處理不同時(shí)間(6、12、24、48 h)，MTT法測(cè)定細(xì)胞活力以確定用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)的最佳非細(xì)胞毒性劑量及處理時(shí)間。將細(xì)胞分為4組，每組3個(gè)復(fù)孔：Control組(未處理)、LPS 組(50 mg/L LPS處理24 h)、LPS+pcDNA組(轉(zhuǎn)染pcDNA后經(jīng)50 mg/L LPS處理24 h)和LPS+pcDNA-GPRC5A組(轉(zhuǎn)染pcDNA-GPRC5A后經(jīng)50 mg/L LPS處理24 h)。其中pcDNA為pcDNA3.1質(zhì)粒，作為空白載體對(duì)照；pcDNA-GPRC5A過(guò)表達(dá)質(zhì)粒是將人源GPRC5A基因插入pcDNA3.1載體中構(gòu)建而成。使用Lipofectamine 3000試劑進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)的檢測(cè)。

1.3.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)檢測(cè)GPRC5A、IL-6和TNF-α mRNA的表達(dá) 利用RNeasy mini試劑盒從細(xì)胞裂解液中提取總RNA，采用GoScriptTM逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)獲得cDNA。根據(jù)SYBR R Premix Ex TaqTM試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR定量檢測(cè)，利用GAPDH為內(nèi)參。使用引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列

1.3.5 Western-blot法檢測(cè)GPRC5A、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、MUC5AC、NF-κB p65、IκBα的蛋白表達(dá) 將處理結(jié)束后的16HBE細(xì)胞裂解于含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液，于冰上裂解10 min，4 ℃×12 000 r/min離心30 min，上清液即為總蛋白。利用BCA蛋白定量試劑盒檢測(cè)獲得的總蛋白濃度后，利用SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳，將目的蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用含5%脫脂乳T(mén)ris緩沖液進(jìn)行封閉2 h，分別加入兔抗 GPRC5A、Bax、Bcl-2、Cleaved caspase-3、MUC5AC、IκBα、NF-κB p65、GAPDH，4 ℃過(guò)夜，再加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，利用ECL發(fā)光液進(jìn)行顯影，蛋白條帶灰度值由Image J軟件進(jìn)行定量。

1.3.6 MTT檢測(cè)16HBE細(xì)胞活力 收集處理后的16HBE細(xì)胞，以適當(dāng)密度接種至96孔細(xì)胞板上。每組設(shè)5個(gè)平行孔。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，培養(yǎng)結(jié)束后棄培養(yǎng)液，添加20 μL質(zhì)量濃度為5 mg/mL 的MTT溶液。孵育4 h后，加入DMSO溶液震蕩反應(yīng)至結(jié)晶溶解。采用酶標(biāo)儀在λ=490 nm處檢測(cè)16HBE細(xì)胞的吸光度(optical density, OD)，其變化趨勢(shì)與細(xì)胞活力變化一致，可以表征細(xì)胞活力[10]。

1.3.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)16HBE細(xì)胞的凋亡 收集處理結(jié)束后的16HBE細(xì)胞，用500 μL的binding buffer懸浮細(xì)胞，加入5 μL的annexin V FITC避光反應(yīng)20 min，加入5 μL的PI避光反應(yīng)20 min，用0.048 mm銅篩過(guò)濾，1 h內(nèi)采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。每個(gè)樣品做3次平行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

2 結(jié) 果

2.1 GPRC5A在LPS活化的16HBE細(xì)胞和氣道上皮組織中表達(dá) BA患者組織中GPRC5 mRNA的表達(dá)水平高于對(duì)照組(P<0.05，圖1A)。在氣道上皮組織的樣本數(shù)據(jù)集GSE64913中，患有嚴(yán)重BA的人群中GPRC5A mRNA的表達(dá)量低于對(duì)照組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1B)。與Control組細(xì)胞比較，LPS處理呈劑量和時(shí)間依賴性降低16HBE細(xì)胞活力，其中50 mg/mL的LPS處理16HBE細(xì)胞24 h可使細(xì)胞活力下降約50%(P<0.05，圖1C～D)，因此，該處理?xiàng)l件下的細(xì)胞可作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的體外BA模型。通過(guò)qRT-PCR和Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與Control組比較，LPS處理組的GPRC5A mRNA和蛋白的表達(dá)量均降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1E～F)。

GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；BA：支氣管哮喘；GPRC5A：G蛋白偶聯(lián)受體家族C組5型；LPS：脂多糖。A、B圖中G1組：重度BA氣道上皮組織(n=42)；G2組：健康受試氣道上皮組織(n=28)。與G2組比較，#：P<0.05。C圖中Control組：未處理的16HBE細(xì)胞；不同濃度LPS(10、25、50、100 mg/mL)處理的16HBE細(xì)胞。與Control組比較，#：P<0.05；與25 mg/mL LPS組比較，$：P<0.05；與50 mg/mL LPS組比較，&：P<0.05。D圖中Control組：未處理的16HBE細(xì)胞；50 mg/mL LPS處理16HBE細(xì)胞不同時(shí)間(6、12、24、48 h)。與Control組比較，#：P<0.05；與LPS 6 h處理組比較，$：P<0.05；與LPS 24 h處理比較，&：P<0.05。E、F圖Control組：未處理的16HBE細(xì)胞；LPS組：50 mg/L LPS處理24 h的16HBE細(xì)胞；與Control組比較，#：P<0.05。圖1 GPRC5A在LPS活化的16HBE細(xì)胞和氣道上皮組織中的表達(dá)Fig.1 Expression of GPRC5A in LPS-induced 16HBE cells and airway epithelial tissues

2.2 GPRC5A 促進(jìn)16HBE細(xì)胞活力并抑制凋亡 qRT-PCR和Western-blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與Control組及對(duì)照組比較，pcDNA-GPRC5A轉(zhuǎn)染組中GPRC5A的mRNA和蛋白表達(dá)水平提高，且差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2A～B)。與Control組比較，LPS處理組的細(xì)胞活力降低，而細(xì)胞凋亡率顯著升高，Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)顯著增加，Bcl-2蛋白表達(dá)顯著下降，且差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖2C～F)。此外，與LPS處理組比較，pcDNA-GPRC5A轉(zhuǎn)染組的細(xì)胞活力升高，細(xì)胞凋亡率降低，Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)降低，Bcl-2蛋白表達(dá)上調(diào)，且差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

GPRC5A：G蛋白偶聯(lián)受體家族C組5型；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；LPS：脂多糖。A～F圖中Control組：未處理的16HBE細(xì)胞；pcDNA組：轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空白載體質(zhì)粒的16HBE細(xì)胞；pcDNA-GPRC5A組：轉(zhuǎn)染pcDNA-GPRC5A質(zhì)粒的16HBE細(xì)胞；LPS Control組：50 mg/L LPS處理24 h的16HBE細(xì)胞；LPS+pcDNA組：50 mg/L LPS處理24 h后，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空白載體質(zhì)粒的16HBE細(xì)胞；LPS+pcDNA-GPRC5A組：50 mg/L LPS處理24 h后，轉(zhuǎn)染pcDNA-GPRC5A質(zhì)粒的16HBE細(xì)胞。與Control組比較，#：P<0.05；與LPS+pcDNA組比較，$：P<0.05。圖2 GPRC5A過(guò)表達(dá)對(duì)LPS活化的16HBE細(xì)胞活力與凋亡的影響Fig.2 Effects of GPRC5A overexpression on cell viability and apoptosis in LPS-induced 16HBE cells

2.3 GPRC5A抑制LPS活化的炎癥因子、氣道黏蛋白的表達(dá) LPS處理組的TNF-α與IL-6 mRNA表達(dá)水平高于Control組，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而LPS處理組在過(guò)表達(dá)GPRC5A后，TNF-α 與IL-6 mRNA表達(dá)水平降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3A～B)。LPS處理組的氣道黏蛋白MUC5AC蛋白表達(dá)量高于Control組，在過(guò)表達(dá)GPRC5A后，MUC5AC蛋白表達(dá)量又下降，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖3C～D)。

2.4 GPRC5A抑制LPS活化的NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá) Western-blot檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn)，與Control組比較，LPS處理組NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白IκBα與NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平升高，且差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。LPS處理組在轉(zhuǎn)染pcDNA-GPRC5A后，IκBα與NF-κB p65的蛋白表達(dá)水平降低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

TNF-α：腫瘤壞死因子-α；LPS：脂多糖；GPRC5A：G蛋白偶聯(lián)受體家族C組5型；IL-6：白細(xì)胞介素-6；MUC5AC：黏蛋白5AC；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶。Control組：未處理的16HBE細(xì)胞；LPS Control組：50 mg/L LPS處理24 h的16HBE細(xì)胞；LPS+pcDNA組：50 mg/L LPS處理24 h后，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空白載體質(zhì)粒的16HBE細(xì)胞；LPS+pcDNA-GPRC5A組：50 mg/L LPS處理24 h 后，轉(zhuǎn)染pcDNA-GPRC5A質(zhì)粒的16HBE細(xì)胞。與Control組比較，#：P<0.05；與LPS+pcDNA組比較，$：P<0.05。圖3 GPRC5A過(guò)表達(dá)對(duì)LPS活化的16HBE細(xì)胞炎癥和氣道黏蛋白MUC5AC表達(dá)的影響Fig.3 Effects of GPRC5A overexpression on inflammation and MUC5AC expression in LPS-induced 16HBE cells

LPS：脂多糖；GAPDH：甘油醛-3-磷酸脫氫酶；IκBα：人核因子κB(NF-κB)抑制蛋白α；NF-κB p65：NF-κB的一個(gè)亞基，由p65-RelA和RelB組成；GPRC5A：G蛋白偶聯(lián)受體家族C組5型。Control組：未處理的16HBE細(xì)胞；LPS Control組：50 mg/L LPS處理24 h的16HBE細(xì)胞；LPS + pcDNA組：50 mg/L LPS處理24 h后，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空白載體質(zhì)粒的16HBE細(xì)胞；LPS+pcDNA-GPRC5A組：50 mg/L LPS處理24 h后，轉(zhuǎn)染pcDNA-GPRC5A質(zhì)粒的16HBE細(xì)胞。與Control組比較，#：P<0.05；與LPS+pcDNA組比較，$：P<0.05。圖4 GPRC5A過(guò)表達(dá)對(duì)LPS活化的16HBE細(xì)胞NF-κB通路相關(guān)蛋白IκBα與NF-κB p65表達(dá)的影響Fig.4 Effects of GPRC5A overexpression on the expression of NF-κB pathway related proteins IκBα and NF-κB p65 in LPS-induced 16HBE cells

3 討 論

G蛋白偶聯(lián)受體是一類(lèi)含有7個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域的受體，廣泛存在于真核生物體內(nèi)，多以二聚體的形式與胞內(nèi)G蛋白相互結(jié)合來(lái)傳遞信號(hào)，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的重要生理活動(dòng)[11]。GPRC5A是G蛋白偶聯(lián)受體家族的一個(gè)成員，最初是在人類(lèi)口腔鱗癌細(xì)胞株UMSCC-22B 中發(fā)現(xiàn)，可被維甲酸(retinoic acid，RA)誘導(dǎo)和調(diào)節(jié)，因此，又稱為RA誘導(dǎo)基因1(retinoic acid inducible gene 1,RAIG1)[12]，其主要在支氣管肺泡上皮中表達(dá)，對(duì)于肺穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)有重要意義。近年來(lái)研究[13-14]發(fā)現(xiàn)，與GPRC5A在小鼠和人肺組織中的特異性表達(dá)比較，其在肺癌組織中的表達(dá)水平顯著下調(diào)，并且GPRC5A敲除小鼠在 1～2 a中會(huì)自發(fā)肺癌，表明GPRC5A可能是一種肺癌抑癌基因。進(jìn)一步的研究[15]報(bào)道，在接受LPS刺激后，GPRC5A敲除小鼠肺組織中產(chǎn)生的炎癥因子和趨化因子水平顯著高于野生型小鼠，由此說(shuō)明GPRC5A敲除使小鼠肺組織對(duì)LPS刺激更敏感。本研究結(jié)果表明，在成功構(gòu)建的LPS誘導(dǎo)的16HBE EBCs損傷模型中，GPRC5A的表達(dá)明顯降低，提示GPRC5A可能參與調(diào)控BA的進(jìn)展。

值得注意的是，LPS可與白細(xì)胞分化抗原14(cluster of differentiation 14, CD14)/Toll樣受體4(Toll-like receptor 4, TLR4)/骨髓分化蛋白2(myeloid differentiation protein 2, MD2)復(fù)合物模式識(shí)別受體(pattern recognition receptor, PRR)結(jié)合，調(diào)節(jié)IκBα的穩(wěn)定性進(jìn)而影響NF-κB的轉(zhuǎn)位及炎性因子的釋放[16-17]。GPRC5A基因敲除通過(guò)激活在小鼠肺上皮細(xì)胞中的NF-κB信號(hào)通路，從而促進(jìn)了肺部炎癥和腫瘤發(fā)生，而抑制NF-κB信號(hào)通路能夠逆轉(zhuǎn)上述改變，提示GPRC5A基因在疾病中的作用與NF-κB信號(hào)通路有關(guān)[7,18]。NF-κB信號(hào)通路通過(guò)調(diào)節(jié)一些細(xì)胞因子的表達(dá)，參與細(xì)胞的炎癥反應(yīng)、腫瘤發(fā)生、免疫反應(yīng)、細(xì)胞凋亡等多種生物學(xué)進(jìn)程[19]。大量臨床數(shù)據(jù)顯示，在BA患者痰液中的嗜酸性粒細(xì)胞、EBCs、肺泡巨噬細(xì)胞等細(xì)胞中均存在NF-κB信號(hào)通路的激活現(xiàn)象，并且NF-κB調(diào)控的炎癥細(xì)胞因子(TNF-α、IL-1β、IL-6等)、趨化因子與黏附因子(ICAM-1、VCAM-1)及炎性類(lèi)酶(iNOS, COX-2)等均在BA疾病發(fā)生過(guò)程中起著主要作用[16,19-22]。此外，氣道黏蛋白MUC5AC能促進(jìn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)誘導(dǎo)BA的發(fā)生[23]。有趣的是，在體內(nèi)外的研究[22, 24-25]中均發(fā)現(xiàn)，抑制NF-κB信號(hào)通路的激活，可以調(diào)節(jié)EBCs中炎癥因子和MUC5AC的分泌，并對(duì)細(xì)胞的增殖及凋亡產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)，在16HBE細(xì)胞中，過(guò)表達(dá)GPRC5A可通過(guò)下調(diào)NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白(IκBα與NF-κB p65)的表達(dá)，抑制LPS誘導(dǎo)的炎癥因子TNF-α、IL-6以及氣道黏蛋白MUC5AC分泌，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞活力，抑制細(xì)胞凋亡。由此可見(jiàn)，GPRC5A過(guò)表達(dá)對(duì)LPS誘導(dǎo)的16HBE細(xì)胞損傷有調(diào)控作用。

綜上所述，本研究闡明了GPRC5A在EBCs損傷的炎癥反應(yīng)和凋亡中的作用，并發(fā)現(xiàn)其機(jī)制與NF-κB信號(hào)通路有關(guān)，為GPRC5A在BA中的功能研究及機(jī)制探索提供了理論基礎(chǔ)，同時(shí)為BA疾病的治療中提供潛在靶點(diǎn)。后續(xù)研究中應(yīng)進(jìn)一步分析GPRC5A對(duì)BA病理進(jìn)展中的氣道高反應(yīng)性、氣道重塑及黏液栓形成的影響；從動(dòng)物水平驗(yàn)證GPRC5A在BA發(fā)生、發(fā)展中的作用。