姚伯昕， 許凌暉， 許天星， 郭燕妮

機體在應(yīng)激狀態(tài)下，交感神經(jīng)釋放去甲腎上腺素(norepinephrine，NE)。關(guān)于神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)調(diào)控免疫系統(tǒng)的具體機制尚未完全明確。真皮血管受交感神經(jīng)支配，且在皮膚炎癥中處于關(guān)鍵地位，推測NE可能通過血管內(nèi)皮細(xì)胞調(diào)節(jié)皮膚炎癥反應(yīng)。本課題組前期工作[1]發(fā)現(xiàn)，經(jīng)NE處理的小鼠真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞(primary dermal microvascular endothelial cells，pDMECs)可促使抗原呈遞后CD4+T淋巴細(xì)胞向Th17分化。CXCL9、CXCL10 和CXCL11為Th1型趨化因子，CCL17和CCL22為Th2型趨化因子，分別趨化Th1和Th2細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)，CXCL10和CCL17與多種炎癥性皮膚病相關(guān)，白癜風(fēng)、斑禿、銀屑病性關(guān)節(jié)炎患者的皮損或血清的CXCL10表達明顯升高[2-4]，而CCL17則在特應(yīng)性皮炎、蕁麻疹、大皰性天皰瘡等有較高表達[5-7]。本研究擬在前期研究的基礎(chǔ)上進一步研究NE對小鼠pDMECs CXCL10和CCL17表達的影響，探討NE對皮膚炎癥反應(yīng)的調(diào)控機制，以期為臨床治療炎癥性皮膚病提供可能的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物和細(xì)胞系 6～12周的雌性BALB/c小鼠[許可證號：SCXK(滬)2019-0012，上海斯萊克實驗動物有限公司]，SPF級，體質(zhì)量18～22 g。小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后開始實驗，飼養(yǎng)環(huán)境設(shè)定室溫20～22 ℃、濕度40%～70%，維持12 h光/暗循環(huán)，充分供應(yīng)飲水及飼料。實驗前一天，小鼠頸背部用電動剃刀去毛。細(xì)胞系：BALB/c小鼠pDMECs細(xì)胞(中國科學(xué)院細(xì)胞庫)。動物研究獲動物實驗倫理委員會批準(zhǔn)。

1.1.2 試劑和儀器 內(nèi)皮細(xì)胞完全生長培養(yǎng)液(上海普邁生物科技有限公司)；胎牛血清(美國Gibco公司)；鼠趨化因子CXCL10和CCL17引物序列(上海擎科生物科技有限公司)；Trizol試劑(批號：15596-026，美國Invitrogen公司)；HiScript Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號：R101-01/02)及SYBR Green Master Mix熒光染料(批號：Q111-02)(美國VAZYME公司)；CXCL10、CCL17 ELISA試劑盒(批號：E-EL-M0021c、E-EL-M0012c，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)；非選擇性β腎上腺素受體拮抗劑普萘洛爾(propranolol，Prop)及α腎上腺素受體拮抗劑酚妥拉明(phentolamine，Phent)(美國Sigma公司)。電熱恒溫培養(yǎng)箱(ICV-450，日本ASONE公司)；多功能酶標(biāo)儀(Flexstation3，美國Molecular Devices公司)；實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(real time fluorescent quantitative polymerase chain reaction, qRT-PCR)儀(QuantStudio 6，美國ABI公司)；PCR儀(EDC-810，北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) pDMECs接種于25 mL培養(yǎng)瓶中，以含有5%胎牛血清的內(nèi)皮細(xì)胞完全生長培養(yǎng)液培養(yǎng)，于37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2條件下進行培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%時胰酶消化傳代，取3～4代pDMECs用于實驗。以5×104mL-1濃度接種于24孔板，每孔1 mL。37 ℃孵育過夜后，進行分組實驗。

1.2.2 ELISA法檢測不同濃度NE干預(yù)后CXCL10 和CCL17的表達 pDMECs共分為6組，依次為未加刺激劑的對照組、LPS組(1 μg/mL LPS)、LPS與不同濃度NE(10-8、10-7、10-6和10-5mol/L)共孵育組(先加入NE，1 h后加入LPS)。48 h 后收集上清液，采用ELISA法檢測細(xì)胞上清液中CXCL10和CCL17的表達，參照ELISA試劑盒說明書操作。

1.2.3 ELISA法檢測腎上腺素受體拮抗劑封閉受體后CXCL10和CCL17的表達 α腎上腺素受體拮抗劑組：將pDMECs分為5組，依次為未加刺激劑的對照組、LPS組(1 μg/mL LPS)、LPS+NE組(10-5mol/L NE)、LPS+NE+Phent組(10-5mol/L Phent)及LPS+Phent組，先加入Phent封閉1 h后再加入NE。48 h后收集上清液，采用ELISA法檢測上清液中CXCL10和CCL17的表達。β腎上腺素受體拮抗劑組：將pDMECs分為5組，依次為未加刺激劑的對照組、LPS組(1 μg/mL LPS)、LPS+NE組(10-5mol/L NE)、LPS+NE+Prop組(10-5mol/L Prop)及LPS+Prop組，先加入Prop封閉1 h后再加入NE。48 h后收集上清液，采用ELISA法檢測上清液中CXCL10和CCL17的表達。

1.2.4 qRT-PCR檢測小鼠真皮CXCL10和CCL17 mRNA的表達 BALB/c小鼠隨機分為4組，對照組(NE處理組、未處理組)和模型組(NE處理組、未處理組)，每組5只。NE處理組頸背兩側(cè)皮膚皮內(nèi)注射含1 μg NE的PBS 100 μL，未處理組以同樣的方式僅注射PBS。注射15 min后，模型組小鼠頸背兩側(cè)皮膚皮內(nèi)再注射含0.5 μg LPS的PBS 100 μL，對照組以同樣的方式僅注射PBS。24 h 后切取注射部位約0.5 cm2的皮膚組織，切取深度以達到真皮全層為宜。PBS漂洗后，真皮側(cè)在下置于含0.5 U/mL的蛋白酶(dispase)和0.38%胰蛋白酶(trypsin)的PBS中。漂浮45 min后取出皮膚，PBS漂洗，刮除表皮。取真皮低溫充分勻漿后，通過Trizol法提取真皮組織中的總RNA，根據(jù)HiScript Reverse Transcriptase逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA，再添加SYBR Green Master Mix進行qRT-PCR擴增。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min→95 ℃ 變性15 s→60 ℃退火60 s，共40個循環(huán)。以β-actin為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt法進行相對定量。引物序列由上海擎科生物有限公司合成(表1)。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 不同濃度NE對pDMECs表達CXCL10和CCL17的影響 與對照組比較，LPS組pDMECs細(xì)胞上清液中CXCL10和CCL17表達均明顯升高[(91.118±5.360)和(60.014±1.690)pg/mL](P<0.001，圖1)；與LPS組比較，經(jīng)不同濃度(10-8、10-7、10-6、10-5mol/L)NE處理，隨著濃度增加，CXCL10表達逐漸降低[(77.787±2.388)、(63.788±3.681)、(52.089±1.802)、(37.942±3.470)pg/mL](P<0.05)，呈劑量依賴性；經(jīng)不同濃度(10-7、10-6、10-5mol/L)NE處理，隨著濃度增加，CCL17表達也逐漸降低[(49.617±2.988)、(42.465±2.274)、(37.664±1.843)pg/mL](P<0.05)，也呈劑量依賴性。兩組均以10-5mol/L NE濃度下降最顯著，后續(xù)以此濃度為實驗濃度。臺盼藍染色進行細(xì)胞活力研究，加入NE培養(yǎng)48 h后不影響pDMECs的活力，排除趨化因子表達的降低為細(xì)胞死亡的結(jié)果(數(shù)據(jù)未顯示)。

NE：去甲腎上腺素；LPS：脂多糖。A：NE抑制LPS誘導(dǎo)的CXCL10表達，呈劑量依賴性；B：NE抑制LPS誘導(dǎo)的CCL17表達，呈劑量依賴性。與對照組比較，###：P<0.001；與LPS組比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01，☆☆☆：P<0.001。圖1 不同濃度NE對LPS誘導(dǎo)pDMECs CXCL10和CCL17表達的影響Fig.1 Different concentrations of NE on LPS-induced CXCL10 and CCL17 expressions by pDMECs

2.2 Phent或Prop封閉受體對CXCL10和CCL17表達的影響 與對照組比較，各LPS組pDMECs細(xì)胞上清液中CXCL10和CCL17表達均明顯升高(P<0.001)。與LPS組比較，LPS+NE組兩個指標(biāo)表達均明顯降低(P<0.01)，LPS+Phent組和LPS+Prop組無明顯變化(P>0.05)，LPS+NE+Phent組仍明顯降低(P<0.05)，而LPS+NE+Prop組則無明顯降低(P>0.05)。具體見表2和圖2。

表2 Phent或Prop封閉受體對NE抑制CXCL10和CCL17表達的影響

2.3 NE對BALB/c小鼠皮膚CXCL10和CCL17 mRNA表達的影響 NE處理組小鼠皮膚真皮CXCL10 和CCL17 mRNA的表達水平均較僅注射PBS組明顯降低[(1.755±0.295)，(1.323±0.112)](P<0.05，圖3)。

3 討 論

神經(jīng)免疫系統(tǒng)是一個復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，已證實降鈣素基因相關(guān)肽、血管活性腸肽、P物質(zhì)、垂體腺苷酸環(huán)化酶激活肽和兒茶酚胺等神經(jīng)遞質(zhì)是神經(jīng)系統(tǒng)和免疫細(xì)胞間強有力的調(diào)節(jié)因子。應(yīng)激狀態(tài)下，交感神經(jīng)末梢分泌兒茶酚胺，尤其是NE。腎上腺素受體分為α腎上腺素受體和β腎上腺素受體，廣泛表達于皮膚各種細(xì)胞，如角質(zhì)形成細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞[8-9]、朗格漢斯細(xì)胞等。本課題組之前的研究[1]也證實了小鼠pDMECs 表達α腎上腺素受體和β腎上腺素受體。真皮血管內(nèi)皮細(xì)胞受交感神經(jīng)支配，且表達腎上腺素受體，這為本研究提供了理論及解剖學(xué)基礎(chǔ)。皮膚血管內(nèi)皮細(xì)胞在皮膚的炎癥反應(yīng)中起關(guān)鍵性作用，可以產(chǎn)生各種細(xì)胞因子和趨化因子參與炎癥反應(yīng)[10]。趨化因子通過與白細(xì)胞上的受體結(jié)合，定向調(diào)節(jié)白細(xì)胞的粘附和遷移，招募白細(xì)胞至炎癥部位而發(fā)揮功能。LPS在體內(nèi)可激活單核巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞等，合成和釋放TNF-α、IL-6等多種細(xì)胞因子和炎性介質(zhì)，常用于炎癥相關(guān)研究[11-12]。李敏等[13]研究表明，LPS處理24 h后，人皮膚微血管內(nèi)皮細(xì)胞外促炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α 含量明顯升高。本研究選擇LPS誘導(dǎo)小鼠pDMECs，探討NE對pDMECs趨化因子CXCL10和CCL17表達的影響。

NE：去甲腎上腺素；LPS：脂多糖；Phent：酚妥拉明；Prop：普萘洛爾。A：預(yù)先Phent封閉后加入NE，CXCL10表達仍降低；B：預(yù)先Phent封閉后加入NE，CCL17表達仍降低；C：預(yù)先Prop封閉后加入NE，CXCL10表達無明顯降低；D：預(yù)先Prop封閉后加入NE，CCL17表達無明顯降低。與對照組比較，###：P<0.001；與LPS組比較，☆：P<0.05，☆☆：P<0.01，☆☆☆：P<0.001。圖2 Phent或Prop封閉受體對NE抑制CXCL10和CCL17表達的影響Fig.2 Effects on NE-induced suppression of CXCL10 and CCL17 by Phent or Prop

NE：去甲腎上腺素；LPS：脂多糖。A：LPS誘導(dǎo)的BALB/c小鼠，皮下注射NE，真皮CXCL10 mRNA的相對表達量減少；B：LPS誘導(dǎo)的BALB/c小鼠，皮下注射NE，真皮CCL17 mRNA的相對表達量減少。LPS誘導(dǎo)的NE組與PBS組比較，#：P<0.05，##：P<0.01。圖3 BALB/c小鼠真皮CXCL10和CCL17 mRNA的相對表達量Fig.3 The relative expressions of CXCL10 and CCL17 mRNA in the dermis of BALB/c mice

本研究存在一定局限性：動物實驗未能確定NE在體內(nèi)作用的相關(guān)靶細(xì)胞，且未能同步行小鼠皮膚病理檢查以觀測皮膚炎癥改變；未深入探討NE調(diào)節(jié)趨化因子表達的具體作用機制。這些不足在今后的研究中應(yīng)進一步完善。

綜上所述，NE可通過皮膚血管內(nèi)皮細(xì)胞β腎上腺素受體，抑制炎癥趨化因子CXCL10和CCL17的表達，從而發(fā)揮抗炎作用。炎癥性皮膚病發(fā)病率高，影響患者生活質(zhì)量，抗炎藥物市場需求大，近年不斷出現(xiàn)新型外用抗炎藥，如鈣調(diào)磷酸酶抑制劑、JAK抑制劑[19-20]、PDE-4抑制劑[21]等。本研究為開發(fā)新型神經(jīng)免疫調(diào)節(jié)及抗炎藥物(特別是外用藥物)提供可能的新方向。