周智高， 何華奇*， 蔣圣娟

(1.安徽科技學(xué)院 農(nóng)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100；2.安徽科技學(xué)院 生命與健康科學(xué)學(xué)院，安徽 鳳陽 233100)

大球蓋菇(Strophariarugoso-annulataFarlow apud Murrill),又名酒紅大球蓋菇、皺環(huán)球蓋菇、皺球蓋菇、裴氏球蓋菇、裴氏假黑傘等[1],隸屬于真菌門、擔(dān)子菌綱、傘菌目、球蓋菇科、球蓋菇屬。該菇1922年首次被發(fā)現(xiàn)并命名于美國(guó),其后歐洲各國(guó)、日本、中國(guó)也相繼發(fā)現(xiàn)其分布[2]。大球蓋菇營(yíng)養(yǎng)豐富、色澤艷麗,菇味清香柔和、菇質(zhì)嫩脆、適口性好[3-4]。國(guó)內(nèi)學(xué)者對(duì)大球蓋菇的生物學(xué)特性、制種及栽培技術(shù)進(jìn)行了研究[5-6]。大球蓋菇種質(zhì)資源十分豐富[7-8],廣泛栽培的品種之間有何遺傳關(guān)系尚不清楚,本研究利用同工酶和RAPD技術(shù)[9-11],研究大球蓋菇菌株的親緣關(guān)系,以期為大球蓋菇的栽培和育種工作提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

供試大球蓋菇(Strophariarugoso-annulata)菌株編號(hào)及來源見表1，由上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院食用菌研究所菌種保藏中心提供。

表1 供試菌株編號(hào)及來源Table 1 Numbers and sources of teseted isolates of Stropharia rugoso-annulata

1.2 供試培養(yǎng)基

完全培養(yǎng)基(CYM培養(yǎng)基):20 g葡萄糖、2 g蛋白胨、2 g酵母膏、0.5 g MgSO4·7H2O；0.46 g KH2PO4、1 g K2HPO4、1 000 mL蒸餾水[12]。

1.3 大球蓋菇酯酶同工酶的提取和電泳

供試菌株接種于CYM培養(yǎng)基,25 ℃培養(yǎng)15 d。酯酶同工酶提取方法及聚丙烯酰胺凝膠電泳均按潘迎捷等[9]方法進(jìn)行,分離膠濃度為7.5%,濃縮膠濃度為4%,交聯(lián)度為2.7%。

1.3.1 酯酶和過氧化物同工酶的提取 將大球蓋菇菌種接種至CYM液體培養(yǎng)基中,25 ℃培養(yǎng)15 d。收集菌絲體冷凍干燥24 h。取1 mg干燥菌絲體研磨成粉末,加1.5 mL 0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH6.4),10 000 r/min,4 ℃下離心20 min,上清液4 ℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 聚丙烯酰胺凝膠的配制和電泳 將樣品與凝膠上樣緩沖液(40%蔗糖,0.25%溴酚藍(lán))按5∶1混合,取35 μL 上樣于加樣孔中,采用濃縮膠電泳電壓70 V,分離膠電泳電壓90 V,進(jìn)行電泳。

1.3.3 酯酶同工酶染色液配制 160 mg醋酸-1-萘酯、160 mg醋酸-2-萘酯,溶解于8 mL丙酮后,加入320 mL 0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 6.4),然后加入160 mg固藍(lán)RR鹽,攪拌溶解,過濾。

1.3.4 過氧化物同工酶染色液配制 A液：1.2 g聯(lián)苯胺用9 mL冰醋酸溶解(80 ℃)后,加51 mL蒸餾水;B液：4%氯化銨;C液：5% EDTA;D液：0.3%過氧化氫。按v(A)∶v(B)∶v(C)∶v(D)∶v(水)=30∶30∶30∶30∶240混勻。

1.3.5 聚丙烯酰胺凝膠同工酶染色 取下凝膠,置于現(xiàn)配制的同工酶染色液中,37 ℃染色20 min至同工酶條帶完全顯色。將凝膠用蒸餾水洗滌,除盡染色液,用7%冰乙酸固定后，VDS觀察并拍照。

1.4 RAPD 擴(kuò)增

DNA提取參考譚琦等[13-14]的方法。RAPD反應(yīng)采用20種上海生物工程中心合成的隨機(jī)引物,即S12、S8、S10、S12-S19、S42-S44、S47、S59、S60和OPA02、OPA03、OPA05。

PCR反應(yīng)程序?yàn)?92 ℃變性5 min,然后92 ℃變性1 min,35 ℃復(fù)性1 min,72 ℃延伸2 min,重復(fù)此循環(huán)45次。最后72 ℃補(bǔ)平5 min。反應(yīng)結(jié)束后,反應(yīng)產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),觀察電泳結(jié)果并拍照。

1.5 聚類分析

統(tǒng)計(jì)聚丙烯酰胺凝膠電泳中的同工酶條帶和瓊脂糖凝膠電泳中的DNA條帶,用NTSYS軟件中的Simqual程序計(jì)算大球蓋菇不同菌株間相似系數(shù),然后用平均連鎖聚類分析方法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析,構(gòu)建遺傳相關(guān)聚類圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 酯酶同工酶分析

2.1.1 酯酶同工酶酶譜 10株不同來源大球蓋菇菌株的酯酶同工酶酶譜中共存在18種遷移率不同的酶帶,其相對(duì)遷移率在0.15～0.91之間,酶帶總數(shù)為44條,10株大球蓋菇菌株酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜如圖1所示。

圖1 10株大球蓋菇菌株酯酶同工酶酶譜Fig.1 Schematic map on esterase isoenzyme of Stropharia rugoso-annulata isolates

2.1.2 酶譜的相似系數(shù)和聚類分析 根據(jù)大球蓋菇酯酶同工酶聚丙烯酰胺凝膠電泳條帶結(jié)果,用NTSYS Simqual程序計(jì)算出不同菌株的相似系數(shù),組成相似系數(shù)矩陣,用UPGMA聚類法,將10株菌株之間的相似系數(shù)進(jìn)行聚類,構(gòu)建樹狀聚類圖,如圖2所示。

圖2 大球蓋菇菌株酯酶同工酶酶譜樹狀聚類圖Fig.2 Dendrogram of cluster analysis based on similarity coefficient of Stropharia rugoso-annulata isolates

從10株菌株之間的相似系數(shù)及其樹狀聚類圖可以看出，10株菌株聚成了不同的類,最大的2類之間的相似系數(shù)只有0.009 6,這說明菌株之間的遺傳差異很大;St4和St5間的相似系數(shù)為1.000 0,來源都是美國(guó),可能是同一菌株,編號(hào)不同或本來是同一菌株,后流傳到不同的地方;St1、St2、St4、St5聚為一類,相似系數(shù)在0.500 0以上,雖然St1來源于浙江松陽,但其與美國(guó)的幾個(gè)菌株相似系數(shù)較大,說明它與美國(guó)的菌株具有一定的同源性。

2.2 大球蓋菇菌株過氧化物同工酶分析

不同大球蓋菇菌株過氧化物同工酶電泳圖譜中總共出現(xiàn)18條酶帶,電泳圖譜見圖3。St4、St7、St8、St9、St10沒有酶帶出現(xiàn),重復(fù)試驗(yàn),結(jié)果一致。這說明大球蓋菇的過氧化物同工酶活力不高,酶帶單調(diào),不適宜用做檢測(cè)遺傳多樣性的生化標(biāo)記。

圖3 10株大球蓋菇菌株過氧化物同工酶酶譜Fig.3 Schematic map on peroxidese isoenzyme patterns of 10 isolates in Stropharia rugoso-annulata

2.3 RAPD分析

2.3.1 RAPD結(jié)果統(tǒng)計(jì) 利用20個(gè)隨機(jī)引物對(duì)10株大球蓋菇進(jìn)行了RAPD分析,結(jié)果顯示,有16個(gè)隨機(jī)引物的擴(kuò)增效果較好,條帶豐富,重復(fù)性好,這16個(gè)引物分別可擴(kuò)增出8～21個(gè)條帶,共擴(kuò)增出241條條帶,平均每個(gè)引物有15.1個(gè)DNA擴(kuò)增片段,片段大小在200～4 000 bp之間,引物S59、S60擴(kuò)增產(chǎn)物圖譜見圖4～5。

圖4 隨機(jī)引物S59擴(kuò)增產(chǎn)物圖譜Fig.4 Map of results amplified by primer S43

圖5 隨機(jī)引物S60擴(kuò)增產(chǎn)物圖譜Fig.5 Map of results amplified by primer S60

2.3.2 10株大球蓋菇的相似系數(shù)和聚類分析 根據(jù)10株菌株以16種引物擴(kuò)增的DNA條帶結(jié)果,用NTSYS軟件中的Simqual程序計(jì)算出不同菌株間的相似系數(shù),組成相似系數(shù)矩陣,用UPGMA聚類法,將10株菌株之間的相似系數(shù)進(jìn)行聚類,構(gòu)建樹狀類聚圖,如圖6所示。

圖6 10株大球蓋菇菌株DNA相似系數(shù)的樹狀聚類圖Fig.6 Dendrogram of cluster analysis based on DNA similarity coefficient of 10 isolates

從10個(gè)菌株之間的相似系數(shù)及樹狀聚類圖可以看出，菌株St2、St4和St5的相似系數(shù)在0.800 0以上,其親緣關(guān)系較近,St9、St10、St11之間及與其他菌株之間相似系數(shù)均在0.500 0以下,說明它們之間的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。本結(jié)果與同工酶結(jié)果基本一致,說明菌株之間具有較大的遺傳多樣性。

3 結(jié)論與討論

10個(gè)菌株遺傳多樣性的RAPD分析與酯酶同工酶的結(jié)果基本相同,進(jìn)一步證明10株大球蓋菇菌株之間存在著豐富的遺傳多樣性,只是在菌株之間的相似系數(shù)上,同工酶的分析結(jié)果大體上都低于RAPD的分析結(jié)果。由此看來,10個(gè)菌株在同工酶上表現(xiàn)出更大的遺傳多樣性。除St4和St5外,其他菌株間的遺傳相似系數(shù)最大只在0.5左右,而St7和St8聚成的一類與其他菌株所成一類間的遺傳相似系數(shù)只有0.009 6。大球蓋菇菌株間的過氧化物酶酶譜由于酶帶較少,不宜用做檢測(cè)遺傳多樣性的生化標(biāo)記。

RAPD結(jié)果中,St1、St2、St4、St5相似系數(shù)在0.500 0以上,與酯酶同工酶相同,說明核酸水平和蛋白質(zhì)水平表現(xiàn)出一致性。但St6和St10在核酸水平和蛋白質(zhì)水平上有一定的差異,可能是由于在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平上存在復(fù)雜的表達(dá)調(diào)控。

通過聚類分析發(fā)現(xiàn),同工酶酶譜顯示大球蓋菇菌株間最小的相似系數(shù)為0.009 6,而RAPD擴(kuò)增條帶譜顯示大球蓋菇菌株間最小的相似系數(shù)也只有0.195 3,說明大球蓋菇菌株之間遺傳差異性十分明顯,育種工作者可根據(jù)菌株間的親緣關(guān)系選擇親本進(jìn)行雜交,從而容易獲得性狀超越雙親的新菌株,為大球蓋菇的生長(zhǎng)提供優(yōu)良品種。

就目前來看,很多高校都建有食用菌種質(zhì)資源庫(kù),但是資源庫(kù)中的種類繁多,存在很多“同物異名”的現(xiàn)象,同工酶作為基因編碼的產(chǎn)物,由于模板作用,酶蛋白質(zhì)中多肽鏈上的氨基酸順序(通過RNA)直接反應(yīng)了DNA鏈上堿基對(duì)的順序,其變化能代表DNA分子水平上的變化。酯酶同工酶在食用菌個(gè)體內(nèi)具有較高的相對(duì)穩(wěn)定性,酶譜資料可以作為鑒定物種以及研究分類、進(jìn)化與變異的重要指標(biāo)。因此,同工酶分析被廣泛應(yīng)用于各種大型真菌的分類鑒定[15]。在一定范圍內(nèi),雙親間的親緣關(guān)系、生態(tài)類型和生理特征差異越大,雙親間相對(duì)性狀的優(yōu)缺點(diǎn)越能彼此互補(bǔ),雜交優(yōu)勢(shì)就越明顯,因此,雜交親本間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近是育種成敗的關(guān)鍵[16]。