傅 奕，陳幫明，李 鑫，付 義，伍宏澤，劉永芳

1江西省中醫(yī)腎病臨床醫(yī)學(xué)研究中心九江市中醫(yī)院，九江 332000；2湖南中醫(yī)藥大學(xué)；3湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)診斷學(xué)湖南省重點實驗室；4湖南中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)心肺病證辨證與藥膳食療湖南省重點研究室，長沙 410208

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是一種自身免疫性疾病，以免疫復(fù)合物IgA沉積在腎小球系膜區(qū)為特征，常伴內(nèi)皮增生和足細胞損傷。在我國發(fā)病率高，約占原發(fā)性腎小球腎損害的32%～54%，約40%患者將在病程20年左右進入終末期腎病[1,2]。目前治療主要是控制血壓、降尿蛋白、激素及免疫抑制劑等，雖然可延緩疾病進展，但相關(guān)藥物不良反應(yīng)也限制了療效[3]。因此，積極探索IgAN的理想治療藥物，保護腎臟功能，已成為亟待解決的臨床問題。

中醫(yī)藥治療IgAN歷史悠久，可提高療效、保護腎功能[4]，但目前的研究角度尚單一，未能系統(tǒng)論證中醫(yī)藥治療IgAN的機制。陳幫明教授為江西省中醫(yī)腎病臨床醫(yī)學(xué)研究中心學(xué)科帶頭人，省級名中醫(yī)，集采眾家之長，認為正虛伏邪擾腎為本病病機[5]。針對正虛，擅用黃芪-冬蟲夏草藥對補益肺脾腎。黃芪甘溫，培補腎氣、健脾消腫，具有調(diào)節(jié)免疫、降低尿蛋白、保護腎功能等作用，可通過上調(diào)肝細胞生長因子(HGF)和下調(diào)轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)而抑制腎纖維化，提高IgAN外周血B淋巴細胞和降低糖基化水平[6,7]。冬蟲夏草味甘性平，補益肺腎，可抑制VEGF及IgA系膜細胞增生，修復(fù)腎臟損傷[8,9]；現(xiàn)代研究證實兩藥均有調(diào)節(jié)免疫、抑制系膜增生的功效，聯(lián)用可協(xié)同增效。故本文基于網(wǎng)絡(luò)方法的藥物作用機制發(fā)現(xiàn)策略，旨在從系統(tǒng)角度和分子水平發(fā)現(xiàn)研究付義主任黃芪-冬蟲夏草藥對的作用機制，與中醫(yī)學(xué)整體觀念和辨證論治原則具有異曲同工之妙，因此，運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)可預(yù)測黃芪-冬蟲夏草藥對治療IgAN的多成分-多靶點-多疾病的整合機制，同時為將來的實驗驗證提供方向。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃芪-蟲草藥對由黃芪20g、冬蟲夏草10g組成，中藥飲片均購于江西中醫(yī)藥大學(xué)附屬九江市中醫(yī)院中藥房。本院制劑室根據(jù)人臨床等效劑量水煎濃縮為0.72 g/mL，置于無菌棕色瓶，4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。牛血清白蛋?BSA，美國Sigma-Aldrich公司，批號：20200823)；脂多糖(LPS，美國Sigma-Aldrich公司，批號：20200815)；四氯化碳(CCl4，上海阿拉丁生化科技股份供銷公司，批號：20200705)；VEGFA(上海泛柯實業(yè)有限公司，批號20211205)。

選取SPF級雄性SD大鼠30只進行藥物血清制備，體質(zhì)量180～220g，購于湖北省實驗動物研究中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2020-0014。飼養(yǎng)于九江學(xué)院附屬醫(yī)院動物房，溫度21～25℃，相對濕度40%～70%，每日定時喂養(yǎng)，實驗動物倫理批號：LL20220304011。

1.2 黃芪-冬蟲夏草主要化學(xué)成分收集及篩選

應(yīng)用TCMSP數(shù)據(jù)庫(http://lsp.nwu.edu.IgAN/tcmsp.php)及BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/)檢索所有活性成分。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為限制條件進行篩選，得到黃芪-冬蟲夏草生物活性成分。另外對未入選數(shù)據(jù)庫，但文獻報道有生物活性的化學(xué)成分也納入候選，建立藥物-化學(xué)成分數(shù)據(jù)集。

1.3 成分潛在靶點收集

應(yīng)用TCMSP及BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫檢索黃芪-冬蟲夏草活性成分的靶基因，通過Cytoscape 3.7.2(https://cytoscape.org/)構(gòu)建活性成分-靶點互作網(wǎng)絡(luò)。

1.4 IgAN疾病靶點篩選

設(shè)置檢索詞為“IgAN”，通過GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)及OMIM數(shù)據(jù)庫(https://www.omim.org/)進行檢索，篩選得到IgAN疾病靶點，并應(yīng)用UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)篩選出人源靶點并進行標準化，獲得Swiss-Prot ID。

1.5 黃芪-冬蟲夏草活性成分與IgAN的共同靶點篩選及PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

明確IgAN相關(guān)靶點與黃芪-冬蟲夏草潛在靶點之間的相互作用，應(yīng)用R語言(https://www.r-project.org/)軟件及Perl語言程序?qū)⒓膊“悬c與藥物靶點進行交集。應(yīng)用STRING(https://string-db.org/)插件構(gòu)建共同靶點互作網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction，PPI)。應(yīng)用count.R插件獲得共同蛋白靶點出現(xiàn)的頻次。

1.6 活性成分-IgAN-靶點互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

應(yīng)用Cytoscape 3.7.2軟件中merge功能構(gòu)建活性成分-IgAN-靶點互作網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)圖中“node”代表活性成分和靶點，“edge”代表活性成分-IgAN-靶點之間的相互關(guān)系。查閱文獻，基于構(gòu)建的網(wǎng)絡(luò)探討黃芪-冬蟲夏草治療IgAN的潛在機制。

1.7 GO生物功能分析和KEGG通路富集

應(yīng)用R語言中Cluster Profiler GO.R插件及Perl語言對活性成分與IgAN共同靶點進行GO分析。應(yīng)用Cluster Profiler KEGG.R插件進行KEGG通路分析。根據(jù)富集因子值分析核心通路富集程度，探究黃芪-冬蟲夏草治療IgAN的可能的生物功能及信號通路機制。

1.8 分子對接

采用AutoDock vina軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)中度值最高的VEGFA與黃芪-冬蟲夏草5個主要成分進行分子對接。從RCSB PDB蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫和PubChem數(shù)據(jù)庫中分別獲得靶點蛋白的三維結(jié)構(gòu)和主要成分的化學(xué)結(jié)構(gòu)，采用AutoDock Tools對上述蛋白受體和配體進行常規(guī)處理，再用其插件Autogrid得到對接活性位點，進行分子對接，得到結(jié)合能(affinity)。

1.9 分組及給藥

實驗大鼠隨機分為空白組和模型組，模型組大鼠按改良的聯(lián)合免疫誘導(dǎo)法BSA+LPS+CCl4建立模型。具體方法：BSA，加蒸餾水配制成100 g/L濃度，按600 mg/kg隔日灌胃1次，持續(xù)12周；CCl4+蓖麻油，每只0.1 mL+0.3 mL，每周首日頸部皮下注射1次，持續(xù)12周；LPS按0.05 mg/只的量，于第6周和第8周首日尾靜脈各注射1次?？瞻捉M則采用同一時間、等體積的蒸餾水灌胃，蓖麻油(0.5 mL)皮下注射以及尾靜脈注射[10]。12周后，模型組大鼠腎臟病理免疫熒光提示腎小球IgA沉積[10]。造模成功大鼠隨機分為模型組和黃芪-冬蟲夏草藥對組，空白組、模型組按10 mL/kg給予蒸餾水灌胃；藥對組黃芪和蟲草配伍后用含0.1%羧甲基纖維素鈉的蒸餾水配制成生藥量為1.27 g/mL的溶液備用(根據(jù)黃芪與蟲草(2∶1)的劑量(黃芪20 g，蟲草10g)，換算為動物給藥劑量配置)。每日1次，持續(xù)21日。

1.10 標本檢測

給藥第21天后分別收集大鼠24 h尿液，記錄尿量，并送醫(yī)院檢驗科檢測尿蛋白含量。治療結(jié)束后次日，安樂死大鼠，迅速暴露并分離出腎臟(在冰臺上操作)，從腎門處剪下腎臟并快速剝離腎包膜，組織勻漿。送醫(yī)院檢驗科，采用酶聯(lián)免疫法按說明書測定腎組織VEGFA含量。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 黃芪-冬蟲夏草藥物有效成分挖掘

利用TCMSP數(shù)據(jù)庫對黃芪-冬蟲夏草藥對現(xiàn)有的成分進行挖掘，限定OB≥30%和DL≥0.18進行選取，去除重復(fù)成分后獲得27個有效成分(見表1)。

表1 黃芪-蟲草藥對活性成分

2.2 黃芪-冬蟲夏草的活性成分的收集和篩選

獲得27個生物活性成分，其作用靶點共109個(不含重復(fù))，其中排名靠前的主要成分有花生四烯酸、β-谷甾醇、槲皮素。對應(yīng)成分與作用靶點，發(fā)現(xiàn)單個活性成分可作用多個靶點，多個活性成分也可共同作用單個靶點，證實黃芪-冬蟲夏草是以多靶點、多途徑來發(fā)揮整體作用。

2.3 IgAN的靶點篩選

利用GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫挖掘得到IgAN的疾病治療靶點，設(shè)置Relevance score≥3.6并刪去重復(fù)靶點，共得到604個IgAN的疾病治療靶點。

2.4 共同靶點篩選及互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將604個IgAN治療靶點與藥物活性成分作用靶點應(yīng)用R語言軟件及Perl語言程序篩選出共同靶點共37個；應(yīng)用STRING數(shù)據(jù)平臺輸入37個共同靶點，在“high confidence：0.9”的模式下構(gòu)建互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)(見圖1)。應(yīng)用count.R插件統(tǒng)計出現(xiàn)頻次前10的蛋白靶點，出現(xiàn)頻次較高的有VEGFA、HIF1A、NOS3、CASP3等(見表2)，可作為黃芪-冬蟲夏草治療IgAN的潛在靶點。

圖1 共同靶點互作網(wǎng)絡(luò)(PPI)Fig.1 Common target interaction network (PPI)

表2 常見蛋白質(zhì)靶點頻率

2.5 生物分子網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

采用Cytoscape 3.7.2軟件在活性成分-靶點互作網(wǎng)絡(luò)圖中，共獲得42個節(jié)點(靶點37個，活性成分5個)(見圖2)。其中三角形代表黃芪-冬蟲夏草活性成分，橢圓形代表黃芪-冬蟲夏草活性成分與IgAN的共同靶點。

2.6 黃芪-冬蟲夏草治療IgAN的生物功能(GO)分析及核心通路篩選

并利用R語言軟件對以上共同靶點進行GO功能分析得到的柱狀圖(見圖3)，其中的生物過程主要涉及類固醇結(jié)合、細胞凋亡過程的半胱氨酸型內(nèi)肽酶活性、雌激素受體結(jié)合、膽固醇結(jié)合等。這體現(xiàn)了黃芪-冬蟲夏草可能通過調(diào)控多個復(fù)雜的生物過程來治療IgAN。圖4顯示了黃芪-冬蟲夏草作用靶點的KEGG通路富集分析結(jié)果。通過分析，37個共同靶點主要分布脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號通路、AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路、PI3K-Akt信號通路等多條信號通路中，這些表明黃芪-冬蟲夏草通過作用于多條信號通路來協(xié)調(diào)治療IgAN。

圖2 活性成分-靶點互作網(wǎng)絡(luò)Fig.2 Interaction network of compounds-targets

圖3 GO功能分析直方圖Fig.3 Histogram of GO analysis

圖4 KEGG富集分析圖Fig.4 Results of KEGG pathway analysis

2.7 分子對接

采用AutoDock vina軟件將主要成分與關(guān)鍵靶點VEGFA進行分子對接后，得到結(jié)合能數(shù)值分別為β-谷甾醇-26.6 kJ/mol、異鼠李素-22.02 kJ/mol、山奈酚-19.34 kJ/mol、槲皮素-18.21 kJ/mol、花生四烯酸-12.89 kJ/mol，結(jié)合能越小對接越好。表中主要成分都能與靶點蛋白較好地結(jié)合。其中β-谷甾醇與VEGFA結(jié)合性最好(見圖5)。結(jié)果表明，這5種主要成分與蛋白靶點相互作用，結(jié)合后呈現(xiàn)穩(wěn)定狀態(tài)。

圖5 β-谷甾醇與VEGFA的分子對接圖Fig.5 Molecular docking diagram of β-sitosterol and VEGFA

2.8 黃芪-冬蟲夏草對IgAN大鼠對尿蛋白影響

模型組尿蛋白較空白組顯著增加(P<0.05)，黃芪-冬蟲夏草組尿蛋白較模型組顯著降低(P<0.05)，結(jié)果見表3。

表3 尿蛋白定量

2.9 黃芪-冬蟲夏草對腎組織VEGFA含量的影響

與正常組比較，模型組VEGFA含量顯著升高(P<0.05)，給予黃芪-冬蟲夏草治療后，VEGFA含量較模型組顯著下降(P<0.05)，結(jié)果見表4。

表4 對腎組織VEGFA含量影響

3 討論與結(jié)論

依據(jù)其臨床特征，本病歸屬中醫(yī)學(xué)尿血、尿濁、慢腎風(fēng)等范疇。中醫(yī)學(xué)認為本病多為脾腎虧虛為本，濕濁內(nèi)蘊，日久成瘀為標；根據(jù)對文獻挖掘證據(jù)表明，中藥治療IgAN以補益肺脾腎為主，活血化瘀貫穿始終[11]。陳幫明主任認為IgAN免疫復(fù)合物沉積屬中醫(yī)“微干血”，“瘀、濁”為其核心病機，黃芪-冬蟲夏草藥對不僅可補益肺脾腎，且可抑制腎纖維化、祛除腎中頑瘀，延緩腎功能進展[5,12]。

本研究篩選出37個生物活性成分，從活性成分-靶點互作網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果中得知其關(guān)鍵活性成分是花生四烯酸、β-谷甾醇、異鼠李素、山奈酚、槲皮素?；ㄉ南┧崾且环Nn-6必需脂肪酸，可調(diào)節(jié)人體免疫功能、抗血小板聚集、抗凝、抑制腎纖維化、保護足細胞[13,14]；β-谷甾醇通過提高抗氧化酶的活性，如超氧化物歧化酶(SOD)，谷胱甘肽(GSH)和過氧化氫酶(CAT)等，具有顯著抗氧化作用，且可以降低腫瘤壞死因子(TNF-α)、IL-6水平，抑制TLR受體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮抑炎作用[15]。異鼠李素通過作用TGF-β1/Smad3和TGF-β1/p38 MAPK通路抑制細胞外基質(zhì)形成而抑制纖維化[16]。山奈酚可通過抑制ASK1/MAPK通路，顯著降低氧化應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化[17]；通過NF-κB信號通路抑制炎癥因子釋放[18]。槲皮素是一種黃酮類化合物，具有抗氧化、抑炎、降低代謝毒素、保護腎臟的作用[19]。綜上，黃芪-冬蟲夏草主要活性成分可能通過抗纖維化、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、抑制炎癥等從而發(fā)揮治療IgAN作用。

基于黃芪-冬蟲夏草活性成分-IgAN-靶點互作網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)了VEGFA、HIF1A、NOS3、CASP3等關(guān)鍵靶點。研究表明，VEGFA是VEGF的亞型，可促進間質(zhì)纖維化，在IgAN患者腎小球和腎小管上皮細胞中高表達，可破壞腎臟屏障，加重蛋白尿，可獨立預(yù)測IgAN患者臨床結(jié)局[20]。免疫復(fù)合物沉積系膜區(qū)，刺激內(nèi)皮細胞分泌大量VEGF，與受體結(jié)合后誘導(dǎo)血管新生，同時通過刺激氧化應(yīng)激、炎癥，進一步加重系膜增生，胞外基質(zhì)增多，導(dǎo)致腎小球硬化[21]。HIF1A可以通過在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后激活Notch-1，從而促進腎纖維化[22]。NOS3可減少SOD水平，發(fā)揮抗氧化、抑炎作用[23]。Caspase-3是細胞凋亡過程中主要效應(yīng)因子，介導(dǎo)腎臟炎癥反應(yīng)、纖維化形成的相關(guān)凋亡[24]。

結(jié)合KEGG數(shù)據(jù)庫對信號通路注釋分析發(fā)現(xiàn)，黃芪-冬蟲夏草的生物有效成分可能通過作用于脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號通路、AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路、PI3K-Akt信號通路等。脂質(zhì)與動脈粥樣硬化是腎臟疾病合并心血管風(fēng)險的主要因素[25]。流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路是抑制炎癥、血管舒張、抗動脈粥樣硬化的主要途徑[26]。AGE/RAGE可促進炎性細胞因子釋放和細胞外基質(zhì)生成，導(dǎo)致腎小球肥大和腎小球硬化，亦可與膠原蛋白發(fā)生交聯(lián)，而介導(dǎo)蛋白質(zhì)沉積[27]。PI3K-Akt信號通路可介導(dǎo)腎臟炎癥和細胞凋亡[28]。

綜上，本研究顯示黃芪-冬蟲夏草通過作用于VEGFA、HIF1A、NOS3、CASP3關(guān)鍵靶點及脂質(zhì)與動脈粥樣硬化信號通路、AGE-RAGE信號通路、流體剪切應(yīng)力與動脈粥樣硬化通路、PI3K-Akt信號通路等多條信號通路而抑制纖維化、抗炎、氧化應(yīng)激等多個病理環(huán)節(jié)，從而發(fā)揮多環(huán)節(jié)、多靶點的整合調(diào)節(jié)效應(yīng)。分子對接也確證上述成分和靶點之間有較強的結(jié)合活性。同時結(jié)合了IgA大鼠模型對有強烈結(jié)合活性VEGFA靶點進行驗證，結(jié)果表明黃芪-冬蟲夏草藥對可以顯著降低模型組大鼠尿蛋白、VEGFA含量，證實黃芪-冬蟲夏草可通過多分子靶點、多途徑而延緩IgA腎病進程。