楊 慧，李 鋼，淮瑞平，楊丹妮，雷利杰，歐陽(yáng)艷，熊莉麗

西南交通大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，成都 610031

黃連(CoptischinensisFranch.)屬于毛茛科、黃連屬，在《本草綱目》中記載：黃連具有清熱燥濕，瀉火解毒之效[1]。黃連屬植物約有18種，我國(guó)產(chǎn)6種，分別是黃連、三角葉黃連、云南黃連、峨眉黃連、五葉黃連、五裂黃連，一個(gè)變種：短萼黃連，以上前三種習(xí)稱為“味連”“雅連”和“云連”。四川是黃連的主要產(chǎn)地之一，《名醫(yī)別錄》記載：“黃連生巫陽(yáng)及蜀郡大山，二月八月采”[2]。早在明代以前，四川峨眉地區(qū)就開始人工栽培黃連，目前四川峨眉地區(qū)就有GAP味連種植基地。傳統(tǒng)中藥黃連水煎液對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌等體外抑菌效果顯著[3]。黃連及其有效成分的抗菌機(jī)理是復(fù)雜多樣的，包括破壞細(xì)菌細(xì)胞膜、抑制胞內(nèi)大分子物質(zhì)的合成、阻斷細(xì)菌分裂和發(fā)育、干擾Z環(huán)的形成以抑制細(xì)胞分裂蛋白FtsZ[4]。

內(nèi)生菌是指棲息在植物器官中的細(xì)菌或真菌，能夠在植物內(nèi)部組織中定居，且不會(huì)對(duì)宿主造成明顯的傷害。植物內(nèi)生菌是重要的生物活性產(chǎn)物的新來(lái)源[5]。有學(xué)者從松果屬植物Conocarpuserecta中分離到內(nèi)生真菌Cytosporasp.，在其發(fā)酵液中篩選出新型抗菌化合物cytosporone D，對(duì)金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、大腸桿菌以及白色念珠菌抑菌效果顯著[6]。日益嚴(yán)峻的抗生素耐藥性已經(jīng)對(duì)人類健康構(gòu)成重大威脅[7]，發(fā)掘藥用植物內(nèi)生真菌資源是尋找新型抗菌藥物的新途徑之一[8]。

四川作為黃連主產(chǎn)地之一，目前對(duì)川黃連內(nèi)生真菌多樣性的相關(guān)研究仍為空白，同時(shí)對(duì)于黃連內(nèi)生真菌代謝產(chǎn)物的抑菌活性和機(jī)制也未見有研究。目前已有的黃連內(nèi)生菌研究集中于分離菌株代謝產(chǎn)物中的單體化合物[9,10]以及篩選產(chǎn)小檗堿的黃連內(nèi)生真菌[11,12]。藥用植物內(nèi)生菌多樣性及內(nèi)生菌代謝產(chǎn)物的進(jìn)一步研究等方面均具有深入研究的意義和價(jià)值，因此本研究依托于川黃連的產(chǎn)地優(yōu)勢(shì)，探究四川地區(qū)黃連內(nèi)生真菌的多樣性，進(jìn)一步研究其代謝產(chǎn)物抑菌機(jī)制，為黃連內(nèi)生真菌資源的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

基因擴(kuò)增儀A200(杭州朗基科學(xué))；真菌基因組DNA快速抽提試劑盒(上海生工)；Inspect掃描電子顯微鏡(美國(guó)FEI)；E-1045離子濺射裝置(日立高新技術(shù)那珂事務(wù)所)。

1.2 植物材料

黃連采自四川省樂山市峨眉山市，經(jīng)鑒定為一株五年生味連(CoptischinensisFranch.)。

1.3 供試菌株

金黃色葡萄球菌ATCC25923(Staphylococcusaureus)；大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)來(lái)自四川省人民醫(yī)院/四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院檢驗(yàn)科。

1.4 黃連內(nèi)生真菌分離純化

將采集到的新鮮黃連洗凈后對(duì)完整枝段及須根部分進(jìn)行表面消毒后切成0.5 cm×0.5 cm的組織塊，接種到加入青鏈霉素的PDA平板上，正置28 ℃培養(yǎng)[13]。設(shè)置對(duì)照實(shí)驗(yàn)組驗(yàn)證表面消毒程序有效及操作環(huán)境潔凈。培養(yǎng)5～7天后，采用菌絲尖端接種法進(jìn)行純化，保存于4 ℃冰箱。記錄分離黃連組織塊數(shù)目，按如下公式計(jì)算植株內(nèi)生真菌定殖率。

內(nèi)生真菌定殖率=

(分離菌株數(shù)目/分離組織塊數(shù)目)×100%

1.5 內(nèi)生真菌鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定包括菌落形態(tài)特征描述及菌絲、孢子形態(tài)的觀察。采用載玻片濕室培養(yǎng)法觀察，經(jīng)乳酸酚棉藍(lán)染色液染色固定后在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲及孢子形態(tài)。參考真菌分類學(xué)相關(guān)書籍[14]，對(duì)分離到的真菌進(jìn)行初步分類。

分子生物學(xué)鑒定即采用內(nèi)部轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer，ITS)測(cè)序的方法，利用測(cè)序數(shù)據(jù)建立系統(tǒng)發(fā)育樹，鑒定其親緣關(guān)系[15]。提取真菌DNA，選擇引物ITS5/ITS4(北京擎科生物科技有限公司合成)，ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)；ITS5(5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′)[16]。PCR條件：98 ℃預(yù)變性30 s；98 ℃變性10 s，57.3 ℃退火5 s，72 ℃延伸4 s，28個(gè)循環(huán)；72 ℃終延伸1 min。序列數(shù)據(jù)經(jīng)處理后與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)Blast比對(duì)，采用鄰接法構(gòu)建進(jìn)化樹，自展值5 000，對(duì)內(nèi)生真菌的種屬關(guān)系進(jìn)行分類，如若進(jìn)化樹待測(cè)序列的自展支持值>90%，則基本認(rèn)定為此種。

1.6 內(nèi)生真菌抗菌性篩選

活化金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌，采用平板稀釋法測(cè)定菌落數(shù)目，稀釋菌液濃度為1×106CFU/mL。內(nèi)生真菌抗菌性篩選采用打孔法[17]：在LB培養(yǎng)基上均勻涂布菌液，用7 mm打孔器在平板中央打去瓊脂塊，再將黃連內(nèi)生真菌平板上最外緣打取菌塊接種至涂布好菌液的LB固體平板上，每組設(shè)置3個(gè)平行，37 ℃培養(yǎng)，游標(biāo)卡尺十字交叉法測(cè)量抑菌圈大小。

1.7 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性

“1.6”初篩到的抑菌菌株Cop S01、Cop L01、Cop FR01進(jìn)一步擴(kuò)大發(fā)酵收集代謝產(chǎn)物?；罨蠼臃N于40 mL PDB培養(yǎng)基后，28 ℃搖床180 r/min，7天后進(jìn)一步擴(kuò)大培養(yǎng)體積至1 200 mL，菌絲菌液分離，二氯甲烷萃取菌液，收集有機(jī)相旋蒸后稱量產(chǎn)物質(zhì)量，甲醇溶解后備用。抑菌活性檢測(cè)采用紙片擴(kuò)散法[18]，S.aureus作為受試菌株，菌液濃度為1×106CFU/mL，均勻涂布于LB平板，將Cop S01、Cop L01、Cop FR01發(fā)酵產(chǎn)物用甲醇充分溶解后制成30%的溶液，將無(wú)菌紙片放入無(wú)菌平皿內(nèi)，在每張紙片上緩緩滴加20 μL發(fā)酵產(chǎn)物，使其全部吸收，每組設(shè)置3個(gè)平行。將含有發(fā)酵產(chǎn)物及空白對(duì)照的紙片用無(wú)菌鑷子分別置于LB平板上，將平板正置于4 ℃冰箱過夜，后轉(zhuǎn)入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～20 h后觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.8 Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物抑菌機(jī)制初探

Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物MIC、MBC值的測(cè)定：10 mL LB培養(yǎng)基中加入100 μL濃度為1×106CFU/mLS.aureus菌液，稀釋產(chǎn)物濃度梯度為0、2、4、6、8、10、11、12 mg/mL，37 ℃ 200 r/min培養(yǎng)。觀察各個(gè)梯度濃度下菌液的渾濁度，肉眼不可見渾濁的最低濃度即為MIC。取100 μL平板涂布后培養(yǎng)觀察記錄，每組設(shè)置3個(gè)平行。若該濃度下平板無(wú)菌落生長(zhǎng)，則該濃度為MBC值。

S.aureus生長(zhǎng)曲線及給藥前后胞外大分子物質(zhì)含量測(cè)定：將濃度為1×106CFU/mL菌液取100 μL加入10 mL LB培養(yǎng)基中，實(shí)驗(yàn)組加入10 mg/mL Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物，37 ℃ 200 r/min振蕩培養(yǎng)18 h，每2 h取樣，測(cè)量對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組OD600 nm，繪制生長(zhǎng)曲線。測(cè)定加入發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)S.aureus細(xì)胞膜完整性的影響：核酸與蛋白質(zhì)在OD260 nm和OD280 nm下有最大吸收值，因此在0～18 h內(nèi)檢測(cè)在該波長(zhǎng)下的紫外吸光值可以估測(cè)胞外核酸和蛋白含量變化[19]。

掃描電子顯微鏡檢測(cè)Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)S.aureus形態(tài)的影響。收集生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的S.aureus細(xì)胞用3%戊二醛懸浮固定細(xì)菌，用無(wú)菌水漂洗2次，用梯度濃度乙醇脫水處理樣品。最后加入100%酒精重懸后，離子濺射噴鍍后電鏡下觀察[20]。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌鑒定結(jié)果

實(shí)驗(yàn)從黃連中分離到94株內(nèi)生真菌，經(jīng)純化去重后得到14株黃連內(nèi)生真菌，以分離植株拉丁名和分離部位進(jìn)行編號(hào)如下表1。根狀莖部位內(nèi)生真菌定殖率是27.8%，莖部位內(nèi)生真菌定殖率是56.7%，葉部位內(nèi)生真菌定殖率是52.5%，須根部位內(nèi)生真菌定殖率是39.6%。

表1 黃連內(nèi)生真菌分離純化結(jié)果

純化后的黃連內(nèi)生真菌經(jīng)傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定如圖1所示。提取真菌基因組DNA后擴(kuò)增ITS序列，將擴(kuò)增成功的PCR產(chǎn)物送樣測(cè)序(北京擎科生物科技有限公司)。繪制黃連內(nèi)生真菌系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2。共鑒定菌株14株，來(lái)自5目、7科、11屬、11個(gè)種，同時(shí)將測(cè)序數(shù)據(jù)上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，得到相應(yīng)序列號(hào)。菌種鑒定結(jié)果如表2。

圖1 黃連內(nèi)生真菌菌落形態(tài)及顯微形態(tài)圖Fig.1 Morphology and microscopic morphology of endophytes in C.chinensis注：A～N對(duì)應(yīng)菌種編號(hào)Cop R01～07、Cop S01～04、Cop L01、Cop FR01～02。A1～N1為菌種菌落，A2～N2為菌絲、孢子形態(tài)。Note:A-N correspond to Cop R01-07,Cop S01-04,Cop L01,Cop FR01-02.A1-N1 are fungal colonies,A2-N2 are mycelium and spore morphology.

圖2 基于ITS rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree based on ITS rDNA sequences

表2 黃連內(nèi)生真菌ITS鑒定結(jié)果

2.2 內(nèi)生真菌抗菌性結(jié)果

黃連內(nèi)生真菌抗菌性結(jié)果如下表3所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明所有黃連內(nèi)生真菌對(duì)S.aureus均具有抑菌作用，且Cop S01、Cop L01、Cop FR01對(duì)S.aureus有非常顯著的抑菌活性，它們的抑菌環(huán)大小超過了35 mm，他們分別屬于Cercosporasp.、Colletotrichumsp.、Colletotrichumsp.。

2.3 內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物抑菌結(jié)果

富集Cop S01、Cop L01、Cop FR01發(fā)酵產(chǎn)物質(zhì)量分別為738.7、472.8、446.4 mg。紙片擴(kuò)散法測(cè)得黃連內(nèi)生真菌發(fā)酵產(chǎn)物結(jié)果如下圖3所示。Cop S01、Cop L01、Cop FR01均對(duì)S.aureus有顯著抑菌作用，其中Cop L01抑菌效果極其顯著，抑菌圈超過20 mm。

表3 純化得到的14株黃連內(nèi)生真菌抗菌性結(jié)果

圖3 Cop S01、Cop L01、Cop FR01代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌效果圖Fig.3 Antibacterial effect of Cop S01,Cop L01 and Cop FR01 metabolites on S.aureus注：與空白對(duì)照組比較，**P < 0.01；****P < 0.000 1。Note:Compared with control,**P < 0.01;****P < 0.000 1.

2.4 Cop L01代謝產(chǎn)物抑菌機(jī)制初探

測(cè)定Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物MIC、MBC值。培養(yǎng)18～24 h后，10 mg/mL濃度菌液澄清無(wú)渾濁，判定該濃度下Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物能夠極大程度地抑制S.aureus的生長(zhǎng)，因此Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物MIC值為10 mg/mL。如圖4所示，隨著給藥濃度不斷加大，平板上菌落數(shù)不斷減少，10 mg/mL濃度下平板上菌落數(shù)減少至可數(shù)，11 mg/mL和12 mg/mL濃度下平板上無(wú)菌落數(shù)，因此Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物MBC值為11 mg/mL。

圖4 Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物MIC和MBC值測(cè)定Fig.4 Cop L01 fermentation product MIC and MBC value determination注：a～h分別對(duì)應(yīng)濃度0、2、4、6、8、10、11、12 mg/mL。Note:a-h correspond to concentrations of 0,2,4,6,8,10,11,12 mg/mL.

如圖5所示，Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物在MIC濃度下明顯抑制金黃色葡萄球菌生長(zhǎng)，表現(xiàn)為加入發(fā)酵產(chǎn)物后即發(fā)揮抑菌作用。如圖6所示，隨著培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)，OD260 nm和OD280 nm數(shù)值均較對(duì)照組有明顯升高，胞外蛋白及核酸含量均有上升。說明培養(yǎng)時(shí)間越長(zhǎng)，金黃色葡萄球菌細(xì)胞壁細(xì)胞膜完整性受到影響，細(xì)胞內(nèi)容物逐漸外泄，引起胞外大分子含量上升。

圖5 Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物與S.aureus生長(zhǎng)曲線Fig.5 Cop L01 fermentation product and S.aureus growth curve

掃描電子顯微鏡結(jié)果如圖7示，對(duì)照組細(xì)菌形態(tài)完整，呈現(xiàn)葡萄串狀，表面光滑；加入MIC濃度Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物培養(yǎng)16～18 h后，金黃色葡萄球菌表面出現(xiàn)明顯粗糙，細(xì)胞間出現(xiàn)黏連，細(xì)胞凹陷破裂，細(xì)菌數(shù)量明顯減少，菌體形態(tài)較正常S.aureus有顯著變化。

圖6 Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)S.aureus核酸、蛋白泄漏的影響Fig.6 Effects of Cop L01 fermentation products on S.aureus nucleic acid and protein leakage注：a為核酸泄漏情況；b為蛋白質(zhì)泄漏情況。Note:a is nucleic acid leakage;b is protein leakage.

圖7 Cop L01發(fā)酵產(chǎn)物MIC濃度培養(yǎng)對(duì)S.aureus細(xì)胞形態(tài)的影響Fig.7 The effect of MIC of Cop L01 fermentation product on S.aureus morphology注：a：正常生長(zhǎng)S.aureus細(xì)胞形態(tài)；b：加入發(fā)酵產(chǎn)物培養(yǎng)后S.aureus細(xì)胞形態(tài),標(biāo)尺4 μm。Note:a:Normal growth S.aureus cell morphology;b:S.aureus cell morphology after fermentation product.scale bar 4 μm.

3 結(jié)論

本研究從川黃連植株根狀莖、莖、葉和須根中分離得到14株內(nèi)生真菌，包括Paraboeremiasp.、Ilyonectriasp.、Clonostachyssp.、Volutellasp.、Fusariumavenaceum、Cylidrocladiellasp.、Cercosporasp.、Dendryphionnanum、Phomatosporabiseriata、Colletotrichumsp.、Didymellaceaesp.。除去文獻(xiàn)中已經(jīng)報(bào)道的Ilyonectria屬和Fusarium屬[9-12]，其余12株內(nèi)生真菌未見報(bào)道，因此本研究極大地豐富了四川地區(qū)黃連內(nèi)生真菌物種多樣性，為后期研究打下良好基礎(chǔ)。

黃連作為傳統(tǒng)中藥，對(duì)抗菌抗炎具有良好作用，但在內(nèi)生菌領(lǐng)域內(nèi)卻鮮有研究，本研究篩選出抑制S.aureus生長(zhǎng)的黃連內(nèi)生真菌菌株Cop L01，屬于Colletotrichumsp.。對(duì)比國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，此類菌是常見的植物內(nèi)生菌，包括青蒿[21,22]、石斛[23]、紅豆杉[24]等植物中均有分離到。同時(shí)對(duì)于該種菌代謝產(chǎn)物的抑菌活性研究已有不少成果，青蒿內(nèi)生真菌Colletotrichumsp.代謝產(chǎn)物對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、白色念珠菌和黑曲霉均有抑菌效果[21]；黃荊內(nèi)生真菌Colletotrichumsp.甲醇提取物對(duì)多重耐藥金黃色葡萄球菌表現(xiàn)出抗菌活性，MIC值為31 μg/mL[25]。綜上所述，本研究得到的菌株Cop L01值得更深入研究，有必要對(duì)Cop L01代謝產(chǎn)物成分的組成、相關(guān)化合物的結(jié)構(gòu)等做進(jìn)一步研究，文獻(xiàn)中也報(bào)道出具有產(chǎn)小檗堿的黃連內(nèi)生真菌，可進(jìn)一步探尋黃連內(nèi)生真菌是否能夠產(chǎn)生與宿主相同或相似的次生代謝產(chǎn)物，亦或是有新型活性物質(zhì)的出現(xiàn)。內(nèi)生真菌是天然活性物質(zhì)來(lái)源的一大寶庫(kù)，研究者應(yīng)全面深入地開發(fā)利用這一資源。