佟彬良，遲玉乾，顏 文，趙夢然，張 卓，周春華△

（1.河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院藥學(xué)部，河北 石家莊 050031；2.河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，河北 石家莊 050017）

橙花叔醇是源于刺人參根莖、茶樹、枇杷葉等的倍半萜烯化合物，存在于多種植物和花卉的精油中。反式-橙花叔醇是黃檀屬植物降香黃檀揮發(fā)油的主要活性成分［1-4］，具有抗氧化、抗微生物、抗生物膜、抗?jié)?、增?qiáng)皮膚滲透性、抗腫瘤、抗損傷、抗炎等生物活性及體外抗寄生蟲活性［5-10］，同時(shí)表現(xiàn)出抗膽堿酯酶、鎮(zhèn)痛、抗炎、抗焦慮活性，故可將其作為治療阿爾茨海默病的潛在植物化學(xué)物質(zhì)［11］。橙花叔醇可通過靶向Toll樣受體4/核因子-κB（TLR4/NF-κB）信號傳導(dǎo)抑制炎性反應(yīng)通路而改善大鼠的心臟功能［12］，其脂質(zhì)體與環(huán)磷酰胺合用可減輕神經(jīng)毒性作用［13］，與氟康唑合用可增強(qiáng)抗真菌作用［14］。其結(jié)構(gòu)中含有3個(gè)雙鍵，包括順式和反式2種構(gòu)型，順式/反式比為40/60。目前，單一構(gòu)型橙花叔醇的藥代動力學(xué)（PK）性質(zhì)尚不清楚。本研究中建立了測定大鼠血漿中反式-橙花叔醇質(zhì)量濃度的液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法，為其PK研究提供依據(jù)?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器、試藥與動物

1.1 儀器

Agilent 1200型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；AB SCIEX 3200 QTRAP?LC-MS/MS System（美國Sciex公司），配有Analyst 1.6.3數(shù)據(jù)處理軟件；Sartorius BP211D型電子分析天平（德國Sartorius公司，精度為0.01 mg）；KW-250E型超聲波清洗儀（昆州市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為40 kHz）；SMART-P型超純水器（上海力新儀器有限公司）。

1.2 試藥

反式-橙花叔醇（trans-nerolidol，化學(xué)分子式C15H26O，相對分子質(zhì)量222.37，上海源葉生物科技有限公司，批號A19O7R2317，純度95%）；磺胺甲噁唑（Sulfamethoxazole，北京索萊寶生物科技有限公司，批號321A023，純度99%）；肝素鈉注射液（常州千紅生化制藥股份有限公司，規(guī)格為每支12500 U∶2 mL，國藥準(zhǔn)字H32022088，批號152101008A）；水為實(shí)驗(yàn)室自制純凈水。

1.3 動物

雄性Sprague-Dawley（SD）遠(yuǎn)交群大鼠，體質(zhì)量200 g，由河北省實(shí)驗(yàn)動物中心提供（動物實(shí)驗(yàn)許可證號為SYXK<冀>2020-002）。實(shí)驗(yàn)前12 h/12 h明暗交替適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜與質(zhì)譜條件

2.1.1 色譜條件

色譜柱：Synergi fusion-RP C18柱（50 mm×3.0 mm，4 μm）；流動相：乙腈-含0.1%甲酸和1 mmol/L乙酸銨的水溶液（40∶60，V/V）；流速：400 μL/min；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：40 μL；分析時(shí)間：3.0 min。

2.1.2 質(zhì)譜條件

電噴霧離子源（ESI），正離子模式，多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）；噴霧電壓：5500 V；溫度：650℃；霧化氣壓力：414 kPa；加熱氣壓力：448 kPa；氣簾氣壓力：172 kPa；解簇電壓、碰撞能量和監(jiān)測離子對反式-橙花叔醇分別為34 V，15 eV，221.2/135.2，內(nèi)標(biāo)磺胺甲噁唑分別為40 V，31 eV，254.1/108.1。反式-橙花叔醇和磺胺甲噁唑的化學(xué)結(jié)構(gòu)、產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖見圖1。

圖1 化學(xué)結(jié)構(gòu)和產(chǎn)物離子質(zhì)譜圖A.Trans-nerolidol B.SulfamethoxazoleFig.1 Chemical structures of trans-nerolidol，sulfamethoxazole and MS/MS spectra of products

2.2 溶液制備

取反式-橙花叔醇對照品適量，精密稱定，加乙腈制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的對照品貯備液；加乙腈稀釋，制得質(zhì)量濃度分別為0.025，0.05，0.25，1，2，5，10，20，50，100 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)工作液。

取磺胺甲噁唑?qū)φ掌愤m量，精密稱定，加乙腈制成質(zhì)量濃度為100 μg/mL的內(nèi)標(biāo)貯備液；加乙腈稀釋，制得質(zhì)量濃度為1 μg/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.3 給藥與血樣采集［15］

適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，選擇體質(zhì)量相近、健康狀況良好的雄性大鼠6只，給藥前禁食12 h，自由飲水。灌胃給藥，劑量為50 mg/kg，分別于給藥后10，20，30 min及1，2，3，4，6，8，12 h時(shí)在眼眥后靜脈叢采血，使用肝素處理后的離心管采集血液約0.3 mL，離心（轉(zhuǎn)速4500 r/min）5 min，取上清液，轉(zhuǎn)移至另一離心管中，凍存待測［1，16-17］。

2.4 血漿樣品處理

取大鼠待測/空白血漿50 μL，置離心管，加乙腈20 μL、內(nèi)標(biāo)工作液20 μL、乙腈200 μL，渦旋混勻1 min，離心（轉(zhuǎn)速為14000 r/min）10 min，取上清液100 μL，進(jìn)樣分析。

2.5 方法學(xué)考察

標(biāo)準(zhǔn)曲線建立與定量下限確定：取空白血漿50 μL，置離心管中，加反式-橙花叔醇系列標(biāo)準(zhǔn)工作液20 μL，制成質(zhì)量濃度分別為0.01，0.02，0.1，0.4，0.8，2，4，8，20，40 μg/mL的系列血漿標(biāo)準(zhǔn)溶液，以待測物質(zhì)量濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)、待測物與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值（Y）為縱坐標(biāo)，權(quán)重因子選擇1/X2，以最小二乘法進(jìn)行線性回歸，得回歸方程Y=0.00639X-0.00121（r=0.9972，n=10）。結(jié)果表明，反式-橙花叔醇血漿檢測質(zhì)量濃度在0.01～40 μg/mL范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好，定量下限為0.01 μg/mL。

專屬性試驗(yàn)：制備不同空白大鼠血漿樣品、加入反式-橙花叔醇稀釋至0.01 μg/mL的空白大鼠血漿樣品、灌胃給藥3 h后的大鼠血漿樣品，平行6份。按2.4項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下條件測定。結(jié)果反式-橙花叔醇、磺胺甲噁唑保留時(shí)間分別為1.41 min和1.14 min，血漿內(nèi)源性物質(zhì)對樣品無明顯干擾，表明方法專屬性良好。LC/MS-MS圖見圖2。

圖2 專屬性試驗(yàn)液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜圖A.trans-nerolidol B.SulfamethoxazoleA1，B1.Blank plasma samples of rats A2，B2.Blank plasma samples of rats adding the trans-nerolidol diluted to the mass concentration of 0.01 μg/mL A3，B3.Plasma samples after the intragastric administration of 50 mg/kg of trans-nerolidol for 3 hFig.2 LC-MS/MS chromatograms of the specificity test

精密度試驗(yàn)：在連續(xù)3 d內(nèi)重復(fù)制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品、6份4種濃度的質(zhì)控樣品，按2.4項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下條件測定。結(jié)果見表1。

表1 大鼠血漿樣品中反式-橙花叔醇的精密度試驗(yàn)結(jié)果、提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)（n=6）Tab.1 Results of the precision test，extraction recovery test and matrix effect of trans-nerolidol in plasma samples of rats（n=6）

提取回收試驗(yàn)：取精密度試驗(yàn)項(xiàng)下6份質(zhì)控樣品及提取后的空白基質(zhì)制備的相應(yīng)濃度的血漿樣品，按2.4項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下條件測定。結(jié)果見表1。

基質(zhì)效應(yīng)：制備提取后的空白基質(zhì)制備的相應(yīng)濃度的血漿樣品、水代血漿樣品，重復(fù)6份，按2.4項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下條件測定。結(jié)果待測物和內(nèi)標(biāo)的基質(zhì)效應(yīng)分別為93.30%～97.51%和92.20%，此方法基質(zhì)效應(yīng)均滿足2020年版《中國藥典》9012指導(dǎo)原則要求［18］。結(jié)果見表1。

殘留效應(yīng)：取標(biāo)準(zhǔn)曲線定量下限樣品、空白血漿樣品，平行6份，按2.4項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下條件測定，計(jì)算絕對殘留。結(jié)果空白血漿中反式-橙花叔醇的殘留峰面積與定量下限峰面積的比值均低于20%，空白樣品中內(nèi)標(biāo)磺胺甲噁唑的殘留峰面積與上述質(zhì)控血漿樣品內(nèi)標(biāo)峰面積的比值均低于5%，表明方法殘留效應(yīng)符合要求。

稀釋可靠性：配制質(zhì)量濃度為80 μg/mL的含藥空白血漿樣品，用空白血漿稀釋10倍和20倍，平行6份，按2.4項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下條件測定。計(jì)算每個(gè)稀釋倍數(shù)濃度測定值與理論濃度的比值［19］，結(jié)果稀釋后樣品的準(zhǔn)確度和精密度均在±15%范圍內(nèi)。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：制備血漿標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品及6份質(zhì)控樣品，考察3次凍融循環(huán)、室溫放置8 h、處理后室溫放置8 h及凍存14 d的血漿樣品的穩(wěn)定性。按2.4項(xiàng)下方法處理，按2.1項(xiàng)下條件測定。結(jié)果經(jīng)過3次凍融循環(huán)，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為5.8%～8.4%，相對誤差（RE）為-5.20%～7.30%；經(jīng) 過 短 期8 h放 置，RSD為4.60%～7.40%，RE為-7.30%～6.50%；處理后室溫放置8 h，RSD為4.50%～7.30%，RE為-6.30%～7.30%；放置14 d后，RSD為5.70%～8.30%，RE為-5.50%～7.50%，表明反式-橙花叔醇穩(wěn)定性良好。

2.6 PK研究

按2.4項(xiàng)下方法處理含藥血漿樣品，按2.1項(xiàng)下條件測定，血藥濃度-時(shí)間曲線見圖3。采用PKSolver 2.0軟件分析，利用非房室模型計(jì)算主要PK參數(shù)。結(jié)果見表2。

圖3 大鼠灌胃給藥50 mg/kg反式-橙花叔醇后血藥濃度-時(shí)間曲線Fig.3 Blood concentration-time curve after the intragastric administration of 50 mg/kg of trans-nerolidol in rats

表2 大鼠單次灌胃給藥50 mg/kg反式-橙花叔醇的藥代動力學(xué)參數(shù)Tab.2 PK parameters after the single intragastric administration of 50 mg/kg of trans-nerolidol in rats

3 討論

3.1 質(zhì)譜條件選擇

SAITO等［20］利用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）法選擇監(jiān)測質(zhì)荷比（m/z）為161.0的離子檢測模式。HE等［15］對質(zhì)譜條件進(jìn)行優(yōu)化時(shí)，利用選擇離子檢測模式，并選擇橙花叔醇脫去一分子水后的質(zhì)子化離子，m/z為205.0作為監(jiān)測離子。優(yōu)化質(zhì)譜條件時(shí)發(fā)現(xiàn)，一級質(zhì)譜圖中m/z為221.2時(shí)離子豐度最高且穩(wěn)定，因此選定該m/z作為待測物的分子離子峰。產(chǎn)物離子對選擇時(shí)，m/z為221.2/81.1和221.2/135.2的兩組離子對豐度較高。結(jié)果顯示，監(jiān)測離子對m/z為221.2/135.2時(shí)檢測靈敏度高。選擇反應(yīng)檢測模式噪音和干擾更少，靈敏度與信噪比更高，尤其適用于復(fù)雜的基質(zhì)背景高的樣品。

3.2 色譜條件選擇

參考文獻(xiàn)［15］，選擇色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流速1 mL/min，分析時(shí)間14.5 min。結(jié)果流動相消耗多，分析時(shí)間長。其中，順式與反式-橙花叔醇分離度較低，約為1.2，可能有基質(zhì)效應(yīng)，降低了響應(yīng)值［21］；且橙花叔醇出峰時(shí)間過長，峰形展寬。本研究中選擇色譜柱（50 mm×3.0 mm，4 μm），流速400 μL/min，分析時(shí)間3 min。節(jié)約了時(shí)間和流動相，且分離效果好，峰寬更窄。

相比文獻(xiàn)［15］選擇的甲醇-水（含0.1%甲酸）流動相系統(tǒng)，本研究中選擇乙腈作為流動相系統(tǒng)有機(jī)相，也提高了內(nèi)標(biāo)和待測物的響應(yīng)值。流動相系統(tǒng)的水相中額外加入乙酸銨，內(nèi)標(biāo)和反式-橙花叔醇的峰形變好、響應(yīng)值變高。最終選擇乙腈-含0.1%甲酸和1 mmol/L乙酸銨的水溶液（40∶60，V/V）進(jìn)行等度洗脫。

3.3 內(nèi)標(biāo)選擇

HE等［15］選擇地西泮作為內(nèi)標(biāo)，其與橙花叔醇在同一體系下的色譜行為差異偏大，表現(xiàn)在保留時(shí)間相差較多。SAITO等［20］采用GC-MS法分離時(shí)，其內(nèi)標(biāo)尼醇與橙花叔醇響應(yīng)值差異過大，且色譜圖中干擾峰較多。本研究中選定的內(nèi)標(biāo)磺胺甲噁唑在該色譜條件下保留時(shí)間與待測物相近，在質(zhì)譜正離子模式下響應(yīng)良好，且內(nèi)標(biāo)磺胺甲噁唑和待測物峰面積的匹配性較好。

3.4 樣品前處理方法的選擇

HE等［15］考察了固相萃?。⊿PE）、液液萃?。↙LE）及蛋白沉淀（PP）的方法，發(fā)現(xiàn)液液萃取溶劑為乙酸乙酯-正丁醇（9∶1，V/V）時(shí)響應(yīng)值最高。經(jīng)考察，發(fā)現(xiàn)后2種方法靈敏度相當(dāng)，定量下限均為0.01 μg/mL。故選擇蛋白沉淀法對樣品進(jìn)行前處理。

3.5 PK

文獻(xiàn)［15］報(bào)道大鼠腹腔注射25 mg/kg橙花叔醇在20 min時(shí)達(dá)最大血藥濃度（8.30 μg/mL），半衰期為0.350 h，約120 min后無法檢測到橙花叔醇。本研究中灌胃反式-橙花叔醇50 mg/kg在30 min時(shí)達(dá)最大血藥濃度（21.38 μg/mL），半衰期為1.95 h，約8 h后無法檢測到反式-橙花叔醇。腹腔注射給藥和灌胃給藥2種方式藥物吸收程度有較大差異。藥物的順式和反式構(gòu)型對藥物發(fā)揮療效有顯著影響，還會影響代謝器官的代謝作用，順式和反式橙花叔醇代謝可能存在差異。HE等［15］的研究僅確定了異構(gòu)體的總PK參數(shù)。且?guī)缀鯖]有證據(jù)支持單一異構(gòu)體的生物活性或毒性，因?yàn)樗亲鳛橐粋€(gè)整體使用的［22-23］。關(guān)于橙花叔醇的文獻(xiàn)報(bào)道很少，尤其缺乏對橙花叔醇單一異構(gòu)體系統(tǒng)的PK研究。國內(nèi)有氣相色譜法、高效液相色譜（HPLC）法測定橙花叔醇含量的報(bào)道［24-25］，但都是測定中藥材及中藥制劑中的含量，未見PK研究。SAITO等［20］建立了測定小鼠血漿橙花叔醇含量的GC-MS法。王秀麗等［26］利用HPLC法測定大鼠血漿中反式-橙花叔醇含量，但并未進(jìn)行PK研究，且順式和反式-橙花叔醇峰分離效果一般。本研究中優(yōu)化液相色譜條件，并采用靈敏度更高的質(zhì)譜檢測方式，系統(tǒng)研究了橙花叔醇單一異構(gòu)體的PK參數(shù)。

綜上所述，所建立的LC-MS/MS法穩(wěn)定可行，可用于大鼠口服反式-橙花叔醇血藥濃度的測定及PK研究。