騫元婕，魏雁濤

0 引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetes retinopathy，DR)是糖尿病(diabetes mellitus,DM)最嚴(yán)重的并發(fā)癥之一，也是工作年齡人群的主要致盲原因[1]，糖尿病視網(wǎng)膜病變的存在也意味著威脅生命的系統(tǒng)性血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)增加[2]。由于糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)缙诎Y狀常不明顯，容易被患者忽略而出現(xiàn)不可逆的視力損傷。因此實(shí)現(xiàn)糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期診斷和治療尤為重要。血糖控制是糖尿病視網(wǎng)膜病變治療的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但大量的臨床以及實(shí)驗(yàn)研究表明，糖尿病機(jī)體在結(jié)束高血糖刺激后，即使血糖控制良好，包括糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)趦?nèi)的并發(fā)癥也較容易出現(xiàn)[3]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)表觀遺傳調(diào)控在“代謝記憶”的發(fā)生與進(jìn)展中起著重要作用。因此，深入研究表觀遺傳學(xué)機(jī)制不僅可以為糖尿病視網(wǎng)膜病變的復(fù)雜調(diào)控機(jī)制提供新的線索，還可以為尋找新藥靶點(diǎn)及潛在的治療策略提供新的依據(jù)。本文將進(jìn)一步就表觀遺傳學(xué)在糖尿病視網(wǎng)膜病變及相關(guān)“代謝記憶”中的作用及發(fā)展做出建議和展望。

1 代謝記憶現(xiàn)象

兩項(xiàng)大型臨床試驗(yàn)，糖尿病控制和并發(fā)癥試驗(yàn)(Diabetes Control and Complications Trial,DCCT)及糖尿病干預(yù)和并發(fā)癥流行病學(xué)(Epidemiology of Diabetes Interventions and Complications, EDIC)研究，有力地證實(shí)了“代謝記憶”參與糖尿病視網(wǎng)膜病變的進(jìn)展[4]。

DCCT試驗(yàn)對(duì)招募的1型糖尿病患者進(jìn)行了多中心的大型對(duì)照臨床試驗(yàn)。強(qiáng)化治療組患者接受強(qiáng)化治療，每天注射3次或更多的胰島素，控制患者平均糖化血紅蛋白(HbA1c)約為7%；常規(guī)治療組患者參與者接受常規(guī)治療，每天注射1～2次胰島素，控制其平均HbA1c約為9%。經(jīng)過(guò)長(zhǎng)達(dá)10a的隨訪后，強(qiáng)化治療組患者視網(wǎng)膜病變風(fēng)險(xiǎn)較常規(guī)治療組顯著降低。隨后研究員又開(kāi)展了EDIC研究。EDIC是一項(xiàng)長(zhǎng)期的前瞻性、縱向、觀察性研究。EDIC研究中，原本接受強(qiáng)化治療和常規(guī)治療的患者都接受了強(qiáng)化治療，兩組患者的HbA1c水平迅速趨于相同[5]。但盡管早期血糖差異消失，常規(guī)治療組微血管并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)仍然高于早期強(qiáng)化血糖控制組，這種現(xiàn)象首次被DCCT/EDIC合作描述為“代謝記憶”[6]。代謝記憶的概念提出后，受到了越來(lái)越多人的關(guān)注，許多關(guān)于糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)病機(jī)制及生物標(biāo)志物的研究層出不窮，探尋并拓展靶向治療或許可為糖尿病視網(wǎng)膜病變提供新的方法與思路。

2 表觀遺傳修飾在糖尿病視網(wǎng)膜病變代謝記憶中的作用

表觀遺傳修飾在DNA序列不改變的條件下，通過(guò)DNA甲基化、組蛋白修飾、miRNAs調(diào)節(jié)等方面改變基因的表達(dá)。在糖尿病機(jī)體中，表觀遺傳修飾常涉及炎癥反應(yīng)、血管生成和細(xì)胞凋亡等因子，它們的表觀修飾增加了糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生的可能，使得部分糖尿病視網(wǎng)膜病變?cè)谘强刂屏己们闆r下仍難以緩解[7]。

2.1DNA甲基化DNA甲基化通常是指在DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)的催化下，將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的甲基基團(tuán)轉(zhuǎn)移到CpG二核苷酸簇(CpG島)胞嘧啶堿基的第五碳上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)。CpG島是與基因沉默相關(guān)的調(diào)控區(qū)[8]。目前發(fā)現(xiàn)，線粒體DNA(mtDNA)甲基化與糖尿病視網(wǎng)膜病變“代謝記憶”的發(fā)生密不可分，而mtDNA的正常復(fù)制和轉(zhuǎn)錄是維持線粒體功能的關(guān)鍵。

在糖尿病患者的細(xì)胞中mtDNA的合成和功能被破壞，mtDNA轉(zhuǎn)錄活性降低，使視網(wǎng)膜毛細(xì)血管周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞加速凋亡[9]。mtDNA有一個(gè)非編碼區(qū)，即置換環(huán)(D-loop)，具有重要的轉(zhuǎn)錄和復(fù)制元件，對(duì)活性氧(reactive oxygen species，ROS)高度敏感，極易受到氧化損傷。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，高糖刺激導(dǎo)致了人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞(HRECs)中5mC水平的升高，D-loop區(qū)隨之高甲基化，而正常糖處理后并不能逆轉(zhuǎn)，這種現(xiàn)象可以被DNMT-siRNA和DNMT抑制劑5-氮雜胞苷(5-AZA)阻止。同樣地高糖刺激增加了D-環(huán)中堿基錯(cuò)配的水平，并且停止高糖刺激后無(wú)法逆轉(zhuǎn)。有趣的是，在高糖刺激后的正常糖處理的階段補(bǔ)充DNMT1-siRNA或5-AZA時(shí)，D-loop區(qū)的斷裂及堿基錯(cuò)配現(xiàn)象減弱，說(shuō)明抑制DNA的甲基化可以減少堿基錯(cuò)配[10]。這表明DNA甲基化與堿基錯(cuò)配之間可能存在著某種串?dāng)_現(xiàn)象，而在高糖刺激終止后，DNA甲基化和堿基錯(cuò)配之間的串?dāng)_仍在繼續(xù)。串?dāng)_現(xiàn)象在mtDNA復(fù)制轉(zhuǎn)錄中極其重要，我們或許可以通過(guò)調(diào)節(jié)DNA的甲基化防止堿基的錯(cuò)配和線粒體功能障礙，進(jìn)而阻止糖尿病視網(wǎng)膜病變的進(jìn)展。

此外，線粒體通過(guò)融合-裂變的動(dòng)態(tài)變化來(lái)維持平衡，高糖刺激一方面會(huì)導(dǎo)致視網(wǎng)膜線粒體融合蛋白的減少[11]，另一方面高糖刺激也會(huì)抑制線粒體電子傳遞鏈復(fù)合體，線粒體電子傳遞鏈功能紊亂引起了ROS的積累，誘導(dǎo)mtDNA損傷從而釋放更多的ROS，繼續(xù)加重線粒體的破壞。這種惡性循壞參與了“代謝記憶”的進(jìn)程[12]。由PPARGC1A編碼的過(guò)氧化物酶體增生物激活受體γ輔助激活因子(PGC-1α)，可通過(guò)與輔助激活過(guò)氧化物酶體增生物激活受體(PPAR-α)的結(jié)合，調(diào)控線粒體融合蛋白以維持線粒體穩(wěn)定和誘導(dǎo)線粒體抵抗ROS的攻擊。耿爽等[13]研究發(fā)現(xiàn)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織PGC-1α mRNA表達(dá)減少，PGC-1α蛋白表達(dá)量下降；PPARGC1A啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與對(duì)照組相比顯著升高，即使后期血糖控制在合理范圍內(nèi)仍無(wú)法逆轉(zhuǎn)此現(xiàn)象。PGC-1α參與的高糖誘導(dǎo)線粒體功能障礙可能在代謝記憶中起著不可或缺的作用。因此針對(duì)DNA甲基化和mtDNA復(fù)制及修復(fù)機(jī)制的調(diào)控將成為一種減緩糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)展的潛在治療策略。

2.2組蛋白修飾紊亂組蛋白是維持染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的重要蛋白質(zhì)，其尾部的翻譯后修飾(post-translational modifications, PTMs)包括甲基化、乙酰化、磷酸化等，改變了組蛋白與DNA 的親和性，使基因轉(zhuǎn)錄發(fā)生改變[14-15]。

有研究表明，核因子2相關(guān)因子2(Nrf2)通路參與了糖尿病視網(wǎng)膜病變“代謝記憶”的過(guò)程[16]。Nrf2是一種氧化還原敏感的轉(zhuǎn)錄因子, 對(duì)ROS具有防御作用。正常情況下，Kelch樣ECH關(guān)聯(lián)蛋白1(Keap1)與 Nrf2結(jié)合，在細(xì)胞質(zhì)中抑制Nrf2的活性，使Nrf2處于“潛伏狀態(tài)”。 Nrf2在高糖刺激下轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，通過(guò)與抗氧化反應(yīng)元件(ARE)4區(qū)結(jié)合調(diào)節(jié)γ-谷氨酰半胱氨酸連接酶催化亞基(GCLC)的表達(dá)，從而起到抗氧化作用[17-18]。GCLC是抗氧化劑谷胱甘肽(GSH)合成的重要酶[19]。Mishra等[20]研究證明在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中Nrf2與GCLC-ARE4的結(jié)合減少，GCLC-ARE4上的 H3K4me2顯著增加，而 H3K4me3和 H3K4me1顯著降低，損害了其抗氧化防御系統(tǒng)；即使糖尿病大鼠在高血糖損害之后將血糖控制良好，此現(xiàn)象仍無(wú)法逆轉(zhuǎn)[21]。隨后，研究者通過(guò)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)賴氨酸特異性去甲基化酶1(LSD1) siRNA可阻止高糖誘導(dǎo)的組蛋白甲基化改變，同時(shí)改善GCLC-ARE4和GCLC與Nrf2結(jié)合的減少[20]。這一現(xiàn)象提示以組蛋白甲基化為靶點(diǎn)的LSD1 siRNA有望幫助抑制或減緩糖尿病視網(wǎng)膜病變這種致盲的疾病。此外, Kowluru等[21]研究表明Nrf2激活劑dh404(CDDO-9，11-二氫三氟酰胺)，可以靶向增強(qiáng)Nrf2的抗氧化能力，阻止血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)以及炎癥介質(zhì)如腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等上調(diào)，降低糖尿病視網(wǎng)膜病變視網(wǎng)膜毛細(xì)血管的高通透性，保護(hù)Müller細(xì)胞免受損傷。靶向Nrf2的治療有希望成為抗VEGF的替代療法，成為精準(zhǔn)控制糖尿病視網(wǎng)膜病變進(jìn)展的一份子。

高糖引起的超氧化物歧化酶2(SOD2)基因的組蛋白修飾同樣與代謝記憶息息相關(guān)。Zhong等[22]研究發(fā)現(xiàn)在糖尿病大鼠視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中線粒體錳超氧化物歧化酶(MnSOD)的活性和基因表達(dá)降低。MnSOD具有清除自由基和抗氧化的功能，由SOD2基因編碼。隨后，在高糖培養(yǎng)的牛視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)SOD2基因轉(zhuǎn)錄減少，其啟動(dòng)子和增強(qiáng)子上的H3K4me1和H3K4me2下降，并且在降低高糖后仍然無(wú)法逆轉(zhuǎn)。而當(dāng)過(guò)表達(dá)MnSOD時(shí)，可以阻止高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激物質(zhì)8-羥基-2’-脫氧鳥(niǎo)苷水平和視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的增加。8-OHdG被認(rèn)為是近年來(lái)生物體內(nèi)DNA氧化損傷的一種新的敏感生物標(biāo)志物[23]。此外，動(dòng)物試驗(yàn)中Xie等[24]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DNMT抑制劑5-氮雜-2’-脫氧胞苷(5-AZA-DC)能有效抑制高糖條件下糖尿病大鼠視網(wǎng)膜組織DNMT的表達(dá)和活性，逆轉(zhuǎn)MnSOD的表達(dá)，從而使視網(wǎng)膜細(xì)胞免遭損傷。因此，針對(duì)抗氧化酶活性及組蛋白甲基化的調(diào)節(jié)可用來(lái)阻止高糖誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜細(xì)胞凋亡，或許將為糖尿病視網(wǎng)膜病變今后的治療提供新的思路。

2.3miRNAs調(diào)節(jié)miRNAs是一種22bp左右的單鏈、內(nèi)源性非編碼小RNA，已有研究表明miRNAs通過(guò)與目標(biāo)基因的3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)結(jié)合負(fù)調(diào)控基因的表達(dá)[25]。多項(xiàng)研究表明糖尿病視網(wǎng)膜病變與血液中miRNAs譜的明顯改變有關(guān)，有時(shí)在疾病出現(xiàn)前幾年就可以檢測(cè)到。由此可見(jiàn)，miRNAs可以作為生物標(biāo)志物預(yù)測(cè)糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生[26-27]。

研究證實(shí)，糖尿病大鼠視網(wǎng)膜中組蛋白去乙酰化酶Sirtuin 1(SIRT1)的表達(dá)受到抑制，而過(guò)表達(dá)SIRT1可恢復(fù)糖尿病大鼠視網(wǎng)膜微血管的通透性，減少mtDNA的損傷[28]。Zhao等[29]研究發(fā)現(xiàn)高糖處理一方面使人視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞(HRECs)miR-23b-3p的表達(dá)上調(diào)，即使在恢復(fù)正常糖處理后也是如此；另一方面高糖可通過(guò)增加炎癥因子核因子κB乙?；?AC-NF-κB)來(lái)刺激miR-23b-3p的表達(dá)，而同時(shí)miR-23b-3p 又通過(guò)減少SIRT1來(lái)上調(diào)AC-NF-κB的表達(dá)，從而形成了miR-23b-3p/SIRT1/NF-κB反饋環(huán)。由于miRNAs本身受到轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，又直接或間接靶向轉(zhuǎn)錄因子，所以miRNAs經(jīng)常形成正反饋環(huán)[30]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示，抑制miR-23b-3p表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)SIRT1的表達(dá)來(lái)挽救“代謝記憶”效應(yīng)[29]， miR-23b-3p/SIRT1/NF-κB反饋環(huán)不僅可以早期診斷和監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展，同時(shí)還可能成為糖尿病視網(wǎng)膜病變“代謝記憶”治療的新靶點(diǎn)。

近期研究發(fā)現(xiàn)miR-200b或許可成為預(yù)測(cè)糖尿病視網(wǎng)膜病變的生物標(biāo)志物。Li等[31]在糖尿病視網(wǎng)膜病變患者中觀察到其視網(wǎng)膜miR-200b的表達(dá)降低，miR-200b通過(guò)負(fù)調(diào)控VEGFA和視網(wǎng)膜病變相關(guān)蛋白如轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)的表達(dá)進(jìn)而抑制視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞的增殖。與之相同，Dantas等[32]發(fā)現(xiàn)在2型糖尿病患者的血漿中miRNA-200b表達(dá)降低。但在增殖型糖尿病視網(wǎng)膜病變(proliferative diabetic retinopathy,PDR)患者的玻璃體中，研究者發(fā)現(xiàn)miRNA-200b的表達(dá)相比于對(duì)照組增加[33]。研究結(jié)果的不同可能與2個(gè)因素有關(guān)：(1)由于相同的miRNAs在不同類型的細(xì)胞和組織中存在差異表達(dá)的情況；(2)由于不同研究選擇的研究模型也有所不同，并且各個(gè)糖尿病研究病程的長(zhǎng)短不一也導(dǎo)致了研究結(jié)果之間的差異。兩項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)的差異說(shuō)明miRNAs相關(guān)研究還存在著一定的局限性，未來(lái)仍需要大量的動(dòng)物及臨床試驗(yàn)使miRNA-200b等miRNAs調(diào)控糖尿病視網(wǎng)膜病變的網(wǎng)絡(luò)逐漸清晰化，在精準(zhǔn)靶向治療上實(shí)現(xiàn)突破。

除此之外，當(dāng)前研究表明在糖尿病大鼠中注射miR-146a可抑制NF-κB的激活及視網(wǎng)膜微血管的滲漏[34]，這提示過(guò)表達(dá)miR-146a可能是改善糖尿病視網(wǎng)膜病變的發(fā)生與進(jìn)展有前途的靶點(diǎn)。目前多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)某些miRNAs對(duì)視網(wǎng)膜的保護(hù)作用，基于RNA的療法也具有特異性靶向的潛在優(yōu)勢(shì)。希望基于表觀遺傳學(xué)的快速發(fā)展，miRNAs能很快成為早期診斷手段的一部分，以此來(lái)預(yù)測(cè)糖尿病患者慢性并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)[35]。

3 總結(jié)與展望

面對(duì)世界范圍內(nèi)糖尿病視網(wǎng)膜病變患病率的逐年增加，目前臨床如何高效、正確進(jìn)行糖尿病視網(wǎng)膜病變的早期診斷與治療，仍然存在許多挑戰(zhàn)。諸多的臨床和實(shí)驗(yàn)研究表明， “代謝記憶”會(huì)讓糖尿病患者早期體內(nèi)不良血糖控制的有害影響持續(xù)多年，因此在疾病的初期階段制定治療方案極其必要。逆轉(zhuǎn)與代謝記憶相關(guān)的表觀遺傳修飾調(diào)節(jié)是治療糖尿病視網(wǎng)膜病變的潛在靶點(diǎn)，并且是開(kāi)發(fā)早期診斷治療很有價(jià)值的目標(biāo)。盡管目前仍有許多問(wèn)題亟待解決，但其發(fā)展?jié)摿Σ蝗菪∮U。表觀遺傳修飾相關(guān)酶的靶向調(diào)節(jié)，如DNMT抑制劑阿扎胞苷(Azacitidine,AZA)和地西他濱(Decitabine,DAC)[11]，HDACs抑制劑曲古菌素A(Trichostatin A,TSA)[36]等，部分已被美國(guó)食品和藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)，還有許多其他靶向藥物在臨床試驗(yàn)中。另外值得注意的是，miRNAs的模擬物或抑制劑目前正廣泛應(yīng)用于動(dòng)物研究，它的優(yōu)勢(shì)在于可以針對(duì)參與同一通路的多個(gè)基因進(jìn)行調(diào)控，miRNAs調(diào)節(jié)劑可能是未來(lái)消除糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)最理想的早期治療方法之一。目前糖尿病視網(wǎng)膜病變表觀遺傳修飾機(jī)制尚未完全闡明，因此，未來(lái)仍需繼續(xù)探尋研究其分子機(jī)制以及miRNAs在糖尿病視網(wǎng)膜病變發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的調(diào)控通路，并進(jìn)一步探索其治療效果，進(jìn)而為糖尿病視網(wǎng)膜病變的精確防治提供更多有效地選擇。