白夢天，李 韻，胡竹林

0 引言

近年來，過敏性結(jié)膜炎的發(fā)病率逐年上升，該趨勢在經(jīng)濟發(fā)達(dá)的國家和地區(qū)更為明顯[1-2]。遺傳背景的差異難以較好解釋該流行病學(xué)特點。目前的觀點認(rèn)為，過敏性結(jié)膜炎發(fā)病率增高主要與工業(yè)化進(jìn)展加劇、城市環(huán)境污染以及全球氣候變暖有關(guān)[3-4]。但結(jié)合日常診療實際，發(fā)現(xiàn)多數(shù)過敏性結(jié)膜炎患者均有較好的生活條件和潔凈舒適的工作環(huán)境，因此我們猜想，是否“過度潔凈”的環(huán)境反而增加了過敏性結(jié)膜炎的發(fā)病率。“衛(wèi)生假說”指出，不潔的居住環(huán)境、較差的生活條件、家庭成員多以及經(jīng)濟水平低的國家和地區(qū)過敏性哮喘、濕疹等發(fā)病率較低，這可能與更易暴露于微生物、寄生蟲以及動植物有關(guān)[5]，而在生命早期階段反復(fù)暴露于變應(yīng)原(塵螨、花粉以及微生物等)可顯著降低成年后發(fā)生過敏性疾病的風(fēng)險[6]。

抗原特異性治療(antigen-specific immunotherapy，AIT)正是基于“衛(wèi)生假說”而提出的，是誘導(dǎo)免疫耐受狀態(tài)而針對過敏性疾病病因的治療方式。通過多次口服或皮下注射低劑量特異性抗原，不僅能夠抑制Th2、Th17細(xì)胞功能，還能夠誘導(dǎo)和活化調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)和Breg引發(fā)機體產(chǎn)生特異性免疫耐受，從而減輕機體過敏癥狀[7]。已有研究證實，皮下免疫療法可緩解哮喘癥狀[8]，舌下含服法可改善過敏性鼻結(jié)膜炎癥狀[9]，口服法可改善自身免疫性腦脊髓炎[10]、葡萄膜炎[11]、哮喘[12]癥狀。但該方法療程長，且不同個體對治療的效果有明顯差異，分析可能是由于患病后較難誘導(dǎo)免疫耐受狀態(tài)，或成年人難以誘導(dǎo)和維持免疫耐受狀態(tài)。

基于此，我們認(rèn)為，個體的免疫耐受狀態(tài)，取決于其首次暴露于致敏原時淋巴細(xì)胞發(fā)育情況以及細(xì)胞因子的生理環(huán)境，根據(jù)該情況和環(huán)境的差異表現(xiàn)出不同的免疫狀態(tài)，從而避免或減輕過敏性結(jié)膜炎的發(fā)生。目前，關(guān)于過敏性結(jié)膜炎免疫耐受的研究更多的是對已經(jīng)發(fā)病的個體進(jìn)行免疫耐受治療，臨床上關(guān)于過敏性結(jié)膜炎的治療仍以脫離過敏原，減輕炎癥反應(yīng)為主，而未過多關(guān)注生命早期的生活環(huán)境對疾病的影響。故本研究先給予新生小鼠持續(xù)抗原刺激，待其成年后以相同抗原再刺激，觀察小鼠眼部情況和全身炎癥反應(yīng)有無減輕，初步探索生命早期與過敏性結(jié)膜炎的關(guān)系。以期從“衛(wèi)生假說”和免疫耐受的角度更深入地認(rèn)識和理解過敏性結(jié)膜炎，從而為過敏性結(jié)膜炎的預(yù)防和診治提供新的思路。

1 材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SPF級Balb/c新生小鼠50只，雄性23只(體質(zhì)量：1周齡時4.12±1.83g；3周齡時9.83±2.03g；7周齡時19.74±2.93g；8周齡時22.43±3.02g)，雌性27只(體質(zhì)量：1周齡時4.42±0.73g；3周齡時9.92±2.04g；7周齡時17.04±1.73g；8周齡時20.83±2.53g)。所有小鼠購買自昆明醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心[SCXK(滇)K2015-0002]，實驗地點為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院昆明動物研究所[SYXK(滇)K2017-0008]。本實驗方案通過昆明醫(yī)科大學(xué)動物倫理委員會審核(No.kmmu 2019002)。本實驗遵從動物實驗的3R原則，在動物飼養(yǎng)中給予人道主義關(guān)懷。

1.1.2主要試劑和儀器豚草花粉(ragweed，short，RW)，Greer Labs公司(美國)；卵清蛋白(ovalbumin，OVA)，Sigma公司(美國)；屋塵螨(house dust mite，HDM)，Greer Labs公司(美國)；氫氧化鋁佐劑(aluminum hydroxide adjuvant)，Thermo公司(美國)；RNAiso Plus， TaKaRa公司(日本)；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser，TaKaRa公司(日本)；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ，TaKaRa公司(日本)；mice IL-17 ELISA Kit，ELK Biotechnology公司(武漢)。QuantStudio 12K flex實時熒光定量PCR系統(tǒng)，ABI公司(美國)；手術(shù)顯微鏡，蔡司公司(德國)。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立本課題組前期工作已完成動物模型建立的條件和方法的摸索及驗證，均達(dá)到實驗要求[13-14]。Balb/c新生乳鼠50只隨機分為空白對照組、OVA+皮下注射組、OVA+霧化吸入組、OVA+灌胃組、RW+皮下注射組、RW+霧化吸入組、RW+灌胃組、HDM+皮下注射組、HDM+霧化吸入組、HDM+灌胃組(n=5只/組)。除空白對照組外，1周齡時，各組將相應(yīng)抗原(5mg/kg)溶解于10μL氫氧化鋁佐劑中，并通過相應(yīng)暴露方式處理小鼠，隔日1次，直至3周齡，其中霧化吸入組小鼠在鼠籠中放置霧化裝置，并加入40mL雙蒸水，每次霧化30min；7周齡時，各組小鼠給予相應(yīng)抗原(25mg/kg)腹腔注射1次；8周齡時，各組再次給予相應(yīng)抗原10mg/kg溶解于氫氧化鋁佐劑10μL中滴雙眼，連續(xù)滴3d。末次滴眼20min后行眼前段照相，24h后處死小鼠(注射大劑量戊巴比妥鈉)，小心分離雙眼結(jié)膜組織并放置于1.5mL離心管中進(jìn)行總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄后，RT-qPCR法檢測結(jié)膜重組人正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌因子(RANTES)、IL-17 mRNA表達(dá)水平；心臟采血后行ELISA檢測血清IL-17濃度變化情況。

1.2.2小鼠血清的制備腹腔注射0.2%戊巴比妥鈉徹底麻醉小鼠，全身酒精消毒，轉(zhuǎn)入無菌操作臺內(nèi)，仰臥固定于手術(shù)臺上。用消毒后的剪刀沿小鼠左側(cè)3～4肋間剪開胸壁，暴露心臟。將1mL針頭刺入右心，小心吸取血液后注入1.5mL離心管中，于4℃冰箱中放置24h。3 500r/min離心15min，可見血清呈淡黃色位于離心管最上層。用移液器小心吸取血清于新的1.5mL離心管中，放置于-80℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3RT-qPCR法檢測結(jié)膜組織中IL-17和RANTESmRNA表達(dá)TRIzol法進(jìn)行結(jié)膜組織總RNA提取，逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA，模板3μL， 總 體 系 為 20μL。引物序列：IL-17正向引物：5’-TTTAACTCCCTTGGCGCAAAA-3’，反向引物：5’-CTTTCCCTCCGCATTGACAC-3’；RANTES(CCL5)正向引物：5’-TGCCTAAAGTGTCACATTTTGCTCA-3’，反向引物：5’-CTAAGGAGTGATACACCTCGTAGTTG-3’；β-actin正向引物：5’-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3’，反向引物：5’-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3’。

1.2.4ELISA法檢測血清IL-17濃度按試劑盒使用說明進(jìn)行操作，450nm處空白對照調(diào)零后測每孔吸光度(A)值。 橫坐標(biāo)為標(biāo)準(zhǔn)品濃度，縱坐標(biāo)為A值，將各標(biāo)準(zhǔn)品的坐標(biāo)點連線，繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)待測標(biāo)本的A值在曲線上查找對應(yīng)濃度，并乘以稀釋倍數(shù)后得出相應(yīng)濃度。

2 結(jié)果

2.1眼前段照相觀察各組小鼠眼表變化情況眼前段照相結(jié)果顯示，OVA+霧化吸入組、OVA+灌胃組、RW+灌胃組、HDM+霧化吸入組表現(xiàn)為遇強光睜眼困難，其中HDM+霧化吸入組結(jié)膜囊內(nèi)還可見大量黏液性分泌物；RW+霧化吸入組、HDM+灌胃組小鼠可見角膜及球結(jié)膜處絲狀黏液性分泌物伴倒睫；OVA+皮下注射組、RW+皮下注射組小鼠可見結(jié)膜囊內(nèi)少量黏液性分泌物，眼瞼輕度水腫，睜眼情況較好、未見明顯倒睫(圖1)。

圖1 各組小鼠眼前段照相情況 A：空白對照組；B：OVA+皮下注射組；C：OVA+霧化吸入組；D：OVA+灌胃組；E：RW+皮下注射組；F：RW+霧化吸入組；G：RW+灌胃組；H：HDM+皮下注射組；I：HDM+霧化吸入組；J：HDM+灌胃組。

2.2小鼠結(jié)膜組織中IL-17和RANTESmRNA的表達(dá)情況各組小鼠結(jié)膜IL-17 mRNA相對表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=4.82，P=0.03)。各處理組小鼠結(jié)膜IL-17 mRNA相對表達(dá)水平均較空白對照組增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中RW+灌胃組增高最顯著(t=14.92，P=0.0008)；RW+皮下注射組增高程度最低(t=3.18，P=0.037)(圖2A)。各組小鼠結(jié)膜RANTES mRNA表達(dá)水平差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=7.18，P=0.01)。各處理組小鼠結(jié)膜RANTES mRNA相對表達(dá)水平均較空白對照組增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中RW+灌胃組增高最顯著(t=31.59，P<0.001)(圖2B)。上述結(jié)果提示，小鼠在生命早期階段多次皮下注射OVA和RW后，結(jié)膜組織中IL-17和RANTES mRNA相對表達(dá)水平增高的程度低于其他處理方式。

圖2 各組小鼠結(jié)膜組織IL-17和RANTES mRNA相對表達(dá)水平 aP<0.05, bP<0.01 vs 空白對照組。

2.3ELISA檢測血清IL-17濃度各組小鼠血清IL-17濃度差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=43.14，P<0.001)。與空白對照組相比，除OVA+霧化吸入組(t=1.86，P=0.116)和RW+皮下注射組(t=1.82，P=0.118)外，其余處理組小鼠血清IL-17濃度均增高，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，其中OVA+灌胃組(25.75±4.25pg/mL)、RW+灌胃組(26.16±5.08pg/mL)和HDM+霧化吸入組(26.70±5.79pg/mL)升高顯著(圖3)。上述結(jié)果提示，小鼠在生命早期階段多次霧化吸入OVA和多次皮下注射RW后，血清中IL-17濃度增高的程度低于其他處理方式。

圖3 各組小鼠血清中IL-17濃度 aP<0.05, bP<0.01 vs 空白對照組。

3 討論

目前，環(huán)境因素對于過敏性結(jié)膜炎的影響日益受到關(guān)注，而從“衛(wèi)生假說”和免疫耐受的角度審視生命早期環(huán)境因素對于過敏性結(jié)膜炎的影響，對于更深入地認(rèn)識過敏反應(yīng)機制、制定新的預(yù)防和治療策略可能具有深遠(yuǎn)的現(xiàn)實意義。因此，如在小鼠生命早期開始給予抗原暴露，且能構(gòu)建較為穩(wěn)定的免疫耐受狀態(tài)以減輕成年后對過敏原的反應(yīng)性，則有利于針對臨床上如何避免形成易過敏體質(zhì)、重新認(rèn)識過敏性結(jié)膜炎的發(fā)生和發(fā)展以及制定新的預(yù)防和診治方法提供了一定的現(xiàn)實參考意義。故本研究將所有親代小鼠終生飼養(yǎng)于獨立通氣籠具(individual ventilated cages，IVC)系統(tǒng)中，確保新生小鼠僅能經(jīng)特定的暴露方式暴露于特定抗原下，以保證實驗環(huán)境的可控制性。

IL-17不僅可發(fā)揮自身的促炎作用，還能與Th2發(fā)揮協(xié)同促炎作用[15]。研究顯示，IL-17缺陷小鼠的Th2細(xì)胞反應(yīng)顯著降低，并且氣道嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目和活性下降[16]。此外，IL-17通過上調(diào)IL-13活性以激活STAT-6而參與過敏反應(yīng)，這是IL-17同Th2細(xì)胞協(xié)同反應(yīng)的首個被發(fā)現(xiàn)的機制[17]。C-C家族趨化因子RANTES可分別來自于血小板、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞，其通過募集T細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞(dendritic cells，DCs)、嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞在過敏反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，其與免疫性疾病的嚴(yán)重程度相關(guān)[18-19]。在過敏性哮喘患者的肺組織和支氣管肺泡灌洗液中均有RANTES高表達(dá)，而抑制RANTES功能后，呼吸道嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)量下降，氣道炎癥顯著改善[20]。RANTES與過敏性結(jié)膜炎的關(guān)系也得到證實。Leonardi等[21]用TNF-α刺激人結(jié)膜成纖維細(xì)胞24h后，RANTES和Th2細(xì)胞因子濃度均顯著增加。此外，末次滴眼激發(fā)6h后，棕色挪威大鼠(brown Norway rats，BN)結(jié)膜組織中未檢測到RANTES mRNA表達(dá)，而24h后，RANTES mRNA在結(jié)膜組織大量表達(dá)[22]。我們既往研究中利用小劑量RW多次皮下注射構(gòu)建免疫耐受小鼠，其結(jié)膜組織中RANTES mRNA及蛋白表達(dá)水平、脾細(xì)胞懸液中IL-17濃度均低于陽性對照組(過敏性結(jié)膜炎組)，而睜眼情況、結(jié)膜水腫程度以及黏液分泌情況同陽性對照組相比均顯著改善，但不同條件下構(gòu)建的免疫耐受狀態(tài)是否存在差異仍不得而知[14]。本研究在不同暴露方式下，發(fā)現(xiàn)小鼠眼表狀態(tài)均出現(xiàn)異常，結(jié)膜組織RANTES和IL-17 mRNA相對表達(dá)水平和血清IL-17濃度均上升，但經(jīng)皮下注射的小鼠眼表狀態(tài)更為穩(wěn)定，且RANTES和IL-17的表達(dá)受抑制程度均高于灌胃和霧化吸入，提示經(jīng)皮下注射的小鼠免疫耐受程度較高。但不同抗原之間的差異難以直接觀察，故我們將重點討論不同暴露方式與過敏性結(jié)膜炎免疫耐受模型之間的關(guān)系。

小鼠胃腸道中的共生微生物及酶類既可發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能(分泌趨化因子、細(xì)胞因子等)，又可對進(jìn)入胃腸道的蛋白質(zhì)、脂肪等物質(zhì)進(jìn)行酶解，破壞原有的結(jié)構(gòu)和功能，但同時會產(chǎn)生新的蛋白質(zhì)、多糖和多肽等物質(zhì)，這些新物質(zhì)亦具有免疫原性[23-24]。此外，隨著母乳喂養(yǎng)的結(jié)束，母乳中免疫球蛋白介導(dǎo)的被動免疫將減弱，腸道固有層和上皮層內(nèi)的B細(xì)胞和T細(xì)胞數(shù)目將逐漸達(dá)到成人水平，因此，隨著年齡的增長，穩(wěn)定和持久的免疫耐受狀態(tài)將難以構(gòu)建[25]。Longo等[26]將60名5歲對牛奶過敏的兒童隨機分為試驗組和對照組，在1a時間內(nèi)，試驗組從小劑量開始給予，并逐漸增加牛奶劑量；而對照組完全不給予牛奶，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗組11名兒童對牛奶耐受，16名可接受少量牛奶，3名仍對其過敏；而對照組仍全部對牛奶過敏，因此認(rèn)為口服小劑量牛奶可誘導(dǎo)對牛奶過敏的兒童產(chǎn)生免疫耐受。本研究結(jié)果表明，經(jīng)灌胃后的小鼠眼表體征較明顯，IL-17和RANTES表達(dá)受抑制程度較低，表明免疫耐受狀態(tài)相對較差。分析原因可能有以下幾點：(1)標(biāo)準(zhǔn)尺寸的灌胃針難以進(jìn)入乳鼠食管，大量抗原物質(zhì)無法進(jìn)入胃腸道；(2)乳鼠胃容積很小且食管肌肉發(fā)育不完善，部分抗原經(jīng)食管反流后被排出體外。

呼吸道誘導(dǎo)免疫耐受狀態(tài)的解剖學(xué)基礎(chǔ)為鼻相關(guān)淋巴組織，其中皺襞細(xì)胞(M細(xì)胞)可特異性攝取部分抗原，從而誘導(dǎo)免疫耐受[27]。Li等[28]給予4～5周齡A/J小鼠呼吸道滴入超敏肌鈣蛋白(cardiac troponin I，cTnI) 誘導(dǎo)免疫耐受狀態(tài)成功后構(gòu)建實驗性自身免疫性心肌炎動物模型，結(jié)果顯示心肌細(xì)胞浸潤和纖維化程度、左心室功能部分恢復(fù)，血清IL-10濃度升高。其還發(fā)現(xiàn)，單次大劑量較多次小劑量可誘導(dǎo)更佳的免疫耐受狀態(tài)，且隨著抗原刺激間隔時間的延長，免疫耐受狀態(tài)的持續(xù)時間和穩(wěn)定性會下降。但Jiang等[29]利用呼吸道滴入光感受器間視黃醇結(jié)合蛋白(interphotoreceptor retinoid binding protein，IRBP)誘導(dǎo)自身免疫性葡萄膜炎小鼠模型時卻發(fā)現(xiàn)，多次小劑量比單次大劑量誘導(dǎo)的免疫耐受狀態(tài)更穩(wěn)定。盡管呼吸道存在內(nèi)屏障以限制抗原，但經(jīng)霧化處理后的抗原可緩慢入血，因此血液中抗原濃度低，需反復(fù)抗原刺激以維持免疫耐受狀態(tài)。吸入性免疫耐受狀態(tài)的維持更需要抗原持續(xù)性刺激，一旦停止吸入抗原，其免疫耐受狀態(tài)將逐漸消退甚至消失，故需通過反復(fù)吸入抗原維持其狀態(tài)[30]。因此，經(jīng)霧化吸入的小鼠眼部體征及促炎因子表達(dá)高于經(jīng)皮下注射小鼠的可能原因為腹腔注射和霧化吸入的時間間隔較長，免疫耐受狀態(tài)減弱。如縮短霧化吸入和腹腔注射、滴眼之間的時間間隔，應(yīng)當(dāng)能減輕小鼠眼表體征和促炎因子表達(dá)水平。

皮下注射的抗原可被細(xì)胞外基質(zhì)緩慢吸收入血，并顯著延長注射抗原的Cmax持續(xù)時間。此外，間質(zhì)淋巴管可直接將分子量>20×103Da的分子吸收，因此可直接進(jìn)入淋巴系統(tǒng)[31]。Carton等[32]將主要組織相容性復(fù)合體(major histocompatibility complex，MHC)予以熒光標(biāo)記后，將其與CD40結(jié)合可見大量DCs迅速移行至注射部位，且在二次注射時皮下淋巴結(jié)的中T細(xì)胞更易活化和增殖且記憶性T細(xì)胞可持續(xù)轉(zhuǎn)移至附近淋巴結(jié)。因此，持續(xù)注入皮下的抗原幾乎可完全被吸收而直接進(jìn)入血液循環(huán)和淋巴循環(huán)，從而誘導(dǎo)出較穩(wěn)定的免疫耐受狀態(tài)。

由于結(jié)膜屬于全身共有黏膜系統(tǒng)，其與呼吸道黏膜、消化道黏膜以及皮下黏膜組織具有相似的病理生理學(xué)機制，因此，某個部位的免疫狀態(tài)改變將引發(fā)遠(yuǎn)端黏膜組織免疫狀態(tài)的改變[33-35]。盡管黏膜共有免疫是復(fù)雜的全身性免疫反應(yīng)，但該現(xiàn)象在臨床中卻十分常見。如在日常工作中，從“衛(wèi)生假說”、免疫耐受及黏膜共有免疫的角度理解過敏性結(jié)膜炎，可能會為其預(yù)防和診治提供新的思路和方式。本研究結(jié)果支持機體的免疫耐受狀態(tài)可在結(jié)膜組織中得到反映，但不同部位的黏膜組織對于刺激的反應(yīng)效能以及抗原的處理能力存在差異。

總之，本研究是以“衛(wèi)生假說”為理論基礎(chǔ)，即在生命早期階段接觸適量的寵物、蛋白類制品以及微生物對于機體的免疫調(diào)控發(fā)揮了保護性作用。目前針對過敏性結(jié)膜炎的治療仍以脫離過敏源，抑制炎癥反應(yīng)為主，而較少關(guān)注生命早期環(huán)境對疾病的影響。因此，從“衛(wèi)生假說”和免疫耐受的角度理解過敏性結(jié)膜炎的發(fā)生和發(fā)展，既有利于個人調(diào)整生活習(xí)慣以預(yù)防過敏性結(jié)膜炎，又可為過敏性結(jié)膜炎的公共預(yù)防和臨床治療提供新的思路。