陳 妲， 吳江妮， 韋二丹， 丘新澤， 范俊華， 黃杰安， 劉詩權(quán)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是最常見的惡性腫瘤之一，病死人數(shù)約占全球腫瘤相關(guān)病死人數(shù)的9%[1]。目前，盡管CRC的診斷和治療取得了進步，但CRC患者的存活率并未得到顯著的改善，且50%以上的CRC患者在確診時已發(fā)生區(qū)域性或遠處轉(zhuǎn)移。腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor 6，TRAF6)是一種經(jīng)典的E3泛素連接酶，它的泛素化活性受到多種因素的調(diào)節(jié)，并在磷酸酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)、核因子-κB(nuclear factor-κB,NF-κB)、Wnt信號通路以及自噬中發(fā)揮重要作用，最終影響炎癥反應(yīng)、神經(jīng)性疾病和癌癥的發(fā)生[2]。TRAF6不僅可調(diào)控胃癌細胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)并促進遷移，還可通過參與催化底物賴氨酸(lysine，Lys)63位點泛素化而促進CRC的遷移、侵襲和淋巴轉(zhuǎn)移[3-4]。其E3泛素連接酶活性很大程度上依賴于K63的自聚泛素化和去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUB)作用，靶向調(diào)控TRAF6-K63的去泛素化酶作用可抑制腫瘤細胞的遷移[5]。有研究顯示，DUB通過蛋白翻譯后修飾(protein post-translational modification，PTM)調(diào)節(jié)EMT，進而調(diào)控腫瘤的轉(zhuǎn)移[6-7]。卵巢腫瘤結(jié)構(gòu)域蛋白去泛素化酶5(deubiquitinating enzyme ovarian tumor domain-containing protein 5，OTUD5)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種DUB亞型，OTUD5選擇性地切割E3泛素連接酶TRAF3上Lys63連接的多聚泛素鏈。OTUD5內(nèi)的離散泛素相互作用基序是結(jié)合并有效去除TRAF3泛素化作用所必需的，OTUD5通過阻斷泛素化導致E3泛素連接酶與下游信號復合物分離，從而發(fā)揮負調(diào)節(jié)先天免疫反應(yīng)作用[8]。研究表明，OTUD5在原發(fā)性肝癌組織中的表達顯著下調(diào)，其降低水平與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移和惡性表型相關(guān)，敲除OTUD5可促進裸鼠模型中肝癌的生長[9]。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，OTUD5在宮頸癌中的低表達與EMT和患者較短的生存期相關(guān)；但也有研究發(fā)現(xiàn)OTUD5在宮頸癌中高表達，促進宮頸癌細胞增殖[10-11]。另外也有研究發(fā)現(xiàn)OTUD5在肺癌、腺癌和宮頸癌中低表達，且與患者較短生存期相關(guān)；進一步分析發(fā)現(xiàn)OTUD5的低表達與腫瘤大小、惡性程度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[12]。本研究通過免疫組織化學法和實時熒光定量聚合酶鏈式反應(yīng)(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)法檢測TRAF6和OTUD5在CRC中的表達情況，并探討這兩個因子的關(guān)聯(lián)性，為CRC患者的診斷和預后預測提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1標本來源 收集2017年3月至2018年3月在廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院接受手術(shù)治療的50例CRC患者的臨床病理資料。選擇其CRC組織及其對應(yīng)的癌旁組織(距離腫瘤邊緣>10 cm)。50例患者中男29例，女21例；年齡32～81歲，中位年齡62歲。TNM分期為Ⅰ期7例，Ⅱ期31例，Ⅲ期5例，Ⅳ期7例。出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移10例，未出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移40例；發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移8例，未發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移42例。

1.2納入與排除標準 納入標準：(1)術(shù)前未接受過化學療法或放射療法；(2)行CRC根治術(shù)，且術(shù)后病理檢查確診為CRC。排除標準：(1)合并其他腫瘤者；(2)合并慢性疾病者；(3)有吸毒史者。以上所有組織標本的收集均經(jīng)患者知情同意，本研究獲醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準(2021-0274)。

1.3免疫組織化學染色法 將組織標本進行石蠟包埋和組織切片，60 ℃烘箱烤片30 min，烘干后用二甲苯進行脫蠟，梯度洗脫脫水。分別滴加3% H2O2溶液、山羊血清封閉液(北京中杉金橋生物公司)至標本上，濕盒中室溫靜置15 min。滴加TRAF6或OTUD5一抗(TRAF6工作濃度為1∶400，美國Affinity公司；OTUD5工作濃度為1∶200，北京Bioss公司)，濕盒中4 ℃孵育過夜。復溫，使用磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)沖洗3次，分別滴加生物素標記二抗、辣根過氧化物酶標記的鏈霉素卵白素(北京中杉金橋生物公司)，濕盒中37 ℃孵育15 min。PBS浸洗3次，5 min/次。采用3，3-二氨基苯聯(lián)胺(diamino-benzidine，DAB)顯色劑和蘇木素進行復染，滴加適量中性樹膠封片，于顯微鏡下進行觀察。

1.4免疫組織化學染色結(jié)果判讀 綜合染色強度及陽性細胞數(shù)量進行半定量分析[13]，根據(jù)陽性細胞染色強度(A)：無明顯著色為0分；細胞漿內(nèi)出現(xiàn)淡黃色顆粒，明顯高于背景為1分；出現(xiàn)較多棕黃色顆粒為2分；出現(xiàn)大量棕褐色顆粒為3分。每例隨機觀察5個高倍鏡視野，計數(shù)500個細胞中染色陽性細胞所占比率(B)：陽性細胞數(shù)<5%為0分；5%～25%為1分；26%～50%為2分；>50%為3分。A與B相加為最終得分，以0～2分判定為陰性(-)，≥3分判定為陽性(+)。

1.5細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染實驗 選擇人正常結(jié)腸上皮細胞株NCM460、CRC細胞株HT29進行實驗，細胞均購自中國科學院上海細胞培養(yǎng)庫。使用含10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進行HT29、NCM460細胞培養(yǎng)。細胞轉(zhuǎn)染：HT29細胞以5×104cells/孔分別接種于6孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，待細胞生長融合度約達30%時進行轉(zhuǎn)染。通過慢病毒轉(zhuǎn)染將編碼人TRAF6的慢病毒載體(Lenti- TRAF6-IRES-EGFP；5×108TU/ml)導入HT29細胞。另外，用空白載體(LTEN-EGFP，3×108TU/ml)轉(zhuǎn)染HT29細胞。選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞進行進一步實驗。培養(yǎng)箱條件設(shè)置為37 ℃，5% CO2。胎牛血清、青-鏈霉素混合液、DMEM培養(yǎng)基均購自美侖生物技術(shù)有限公司。過表達TRAF6表達的siRNA和陰性對照siRNA均由吉凱基因股份有限公司合成。

1.6RT-qPCR檢測方法 采用總RNA提取試劑盒(Takara公司)提取細胞總RNA，并使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Takara公司)將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Power SYBR Green Master Mix(Genstar，中國北京)進行RT-qPCR，所用引物均由生工生物科技有限公司合成，引物序列見表1。以GAPDH為內(nèi)參，根據(jù)2-ΔΔCt法計算TRAF6 mRNA、OTUD5 mRNA的相對表達量。重復3次獨立實驗。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1CRC組織及其癌旁組織中TRAF6陽性表達率比較 TRAF6主要表達于腺上皮的胞漿和胞膜。見圖1。CRC組織中TRAF6的陽性表達率為84.00%(42/50)，癌旁組織中TRAF6的陽性表達率為28.00%(14/50)，兩組差異有統(tǒng)計學意義(χ2=31.818，P=0.000)。

圖1 CRC組織及其癌旁組織中TRAF6的表達情況比較圖(免疫組織化學染色，×400)

2.2CRC組織及其癌旁組織中OTUD5陽性表達率比較 OTUD5主要表達于腺上皮的胞漿和胞膜。見圖2。CRC組織中OTUD5的陽性表達率為32.00%(16/50)，癌旁組織中OTUD5的陽性表達率為54.00%(27/50)，兩組差異有統(tǒng)計學意義(χ2=4.937，P=0.026)。

圖2 CRC組織及其癌旁組織中OTUD5表達情況比較圖(免疫組織化學染色，×400)

2.3TRAF6、OTUD5表達情況與CRC患者臨床病理特征的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果 以CRC組織中TRAF6、OTUD5的表達情況進行分組。結(jié)果顯示，TRAF6陰性組遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生率高于TRAF6陽性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表2。OTUD5陰性組TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的人數(shù)比例大于OTUD5陽性組，且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生率高于OTUD5陽性組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表2 CRC患者TRAF6表達情況與臨床病理特征關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果[n(%)]

表3 CRC患者OTUD5表達情況與臨床病理特征關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果[n(%)]

2.4TRAF6 mRNA與OTUD5 mRNA在CRC細胞及人正常結(jié)腸上皮細胞的表達水平比較 HT29細胞的TRAF6 mRNA表達水平顯著高于NCM460細胞(t=6.960，P=0.000)，OTUD5 mRNA表達水平顯著低于NCM460細胞(t=13.840，P=0.000)。見圖3。

圖3 HT29細胞與NCM460細胞TRAF6 mRNA、OTUD5 mRNA表達水平比較圖

2.5TRAF6過表達對CRC細胞OTUD5 mRNA表達水平的影響 過表達TRAF6的HT29細胞[TRAF6(+)-HT29]中，OTUD5 mRNA表達水平顯著低于正常HT29細胞(t=32.555，P=0.000)。見圖4。

圖4 TRAF6過表達HT29細胞與正常HT29細胞的OTUD5 mRNA表達水平比較圖

3 討論

3.1CRC是常見的惡性腫瘤，易發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移，嚴重危害人們健康。泛素化是蛋白質(zhì)翻譯后修飾的一種重要方式，具有介導蛋白的降解(Lys48位點)或調(diào)節(jié)其作為信號分子(Lys63位點)的生物學功能[14-15]。泛素化在CRC的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的作用，被證實參與了從正常細胞向癌細胞的轉(zhuǎn)化，以及癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移過程，對CRC患者的預后有重要影響[16-17]。

3.2泛素修飾的平衡受到E3泛素連接酶和DUB兩者的調(diào)控，通常Lys63位點被泛素化后可修飾蛋白間相互作用，導致信號通路的活化或蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運[2]。研究發(fā)現(xiàn)TRAF6作為E3泛素連接酶可催化ULK1、Beclin-1等自噬相關(guān)蛋白發(fā)生Lys63位點泛素化，進而激活自噬過程[18-19]。自噬在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中起促進作用，涉及細胞癌前病變、EMT、浸潤轉(zhuǎn)移、腫瘤免疫微環(huán)境等[20]。TRAF6高表達與癌癥進展密切相關(guān)，TRAF6以Lys63位點連接自噬相關(guān)蛋白不僅可誘導自噬，調(diào)控胃癌細胞EMT并促進腫瘤遷移，還可通過其泛素化位點124mut影響CRC的遷移、侵襲和淋巴轉(zhuǎn)移[3-4]。另有研究顯示，TRAF6可通過Lys48位點調(diào)控自噬選擇性的β-catenin降解，抑制CRC細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[21]。糖原合成酶激酶3β(glycogen synthetase kinase 3β，GSK3β)可通過誘發(fā)TRAF6的Try266位點發(fā)生磷酸化，促進TRAF6發(fā)生K48連接的多聚泛素化修飾，并啟動其發(fā)生蛋白酶體途徑的降解，進而抑制TRAF6介導的自噬選擇性的β-catenin降解途徑，促進CRC細胞發(fā)生侵襲和轉(zhuǎn)移。因此，TRAF6兩種泛素化功能位點在發(fā)生轉(zhuǎn)移腫瘤中的自噬作用機制可能不同。本研究結(jié)果顯示，TRAF6在人CRC組織、癌細胞株中高表達，且與CRC的遠處轉(zhuǎn)移具有關(guān)聯(lián)性。

3.3DUB從目的蛋白中去除泛素的功能在腫瘤局部侵襲、擴散和遠處轉(zhuǎn)移等腫瘤生物學行為中起著重要作用[22]。有研究提示，低水平的OTUD5與肝癌、肺癌、宮頸癌的不良預后顯著相關(guān)，是腫瘤發(fā)生侵襲、轉(zhuǎn)移以及患者不良生存預后的獨立影響因素[9-12]。本研究結(jié)果顯示，OTUD5在CRC組織中低表達，且OTUD5陰性組TNM分期為Ⅲ～Ⅳ期的人數(shù)比例顯著大于OTUD5陽性組，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠處轉(zhuǎn)移發(fā)生率顯著高于OTUD5陽性組，這與相關(guān)研究結(jié)果相似。OTUD5是靶向去除TRAF6 Lys63泛素化的DUB亞型[8]，且與自噬相關(guān)。OTUD5可調(diào)控哺乳動物雷帕霉素靶蛋白1/2(mammalian target of rapamycin complex 1/2，mTORC1/2)信號通路，敲除哺乳動物細胞的OTUD5基因可以誘導mTOR相關(guān)細胞自噬表型[23]，推測OTUD5通過去除靶蛋白中泛素分子，從而起到逆轉(zhuǎn)TRAF6的作用；通過調(diào)控自噬信號通路，從而抑制腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移。本研究結(jié)果顯示，HT29細胞過表達TRAF6會抑制OTUD5的表達，提示兩者存在負關(guān)聯(lián)，推測OTUD5可能通過結(jié)合E3泛素連接酶TRAF6并去除K63位點多聚泛素化，從而在CRC的發(fā)生、轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用。

綜上所述，TRAF6、OTUD5在CRC的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，其有望成為CRC診斷、治療和預后預測的標志物。但本研究樣本量相對較少，對于其具體的機制仍有待進一步探索。