曾琳源， 王立翔， 張桂元， 唐可禺， 林 潤， 陳 斌， 戴海濤， 楊建勇， 黃勇慧

納米技術(shù)的進步和腫瘤免疫治療在臨床的成功，提示兩個學科的融合必將為改善腫瘤治療產(chǎn)生巨大的動力。石墨烯及其衍生物，例如直鏈烷基修飾氧化石墨烯(linear alkyl grafted graphene oxide，GO-C18)納米載體的二維結(jié)構(gòu)使其具有極高的比表面積和卓越的載藥性能[1-2]。本課題組已在前期工作中初步證明阿霉素(doxorubicin，DOX)負載的GO-C18經(jīng)導(dǎo)管動脈化療栓塞(transcatheter arterial chemoembolization，TACE)治療肝癌是安全有效的[3-4]。然而，肝癌腫瘤免疫環(huán)境復(fù)雜，各種治療方式引起的機體免疫細胞狀態(tài)改變對療效影響亦十分重要。治療對免疫系統(tǒng)的刺激有抗腫瘤效應(yīng)，亦有促腫瘤生長效應(yīng)[5-6]。研究報道納米藥物載體對機體免疫系統(tǒng)、免疫細胞具有一定的影響[7-8]。GO-C18對機體免疫細胞造成影響尚不確定，有必要明確其對機體免疫細胞的作用，探索GO-C18作為藥物載體治療肝癌時對免疫識別腫瘤抗原、殺傷腫瘤細胞的作用。本研究將不同濃度氧化石墨烯(graphene oxide,GO)、GO-C18干預(yù)體外細胞，利用免疫細胞表面特異性生物標志物，通過流式細胞儀檢測巨噬細胞抗原呈遞、吞噬功能和M1表型及活化，以及T細胞、B細胞的活化。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 實驗動物BALB/c小鼠，18～22 g，購自廣東省實驗動物中心(動物實驗倫理批號SYSU-IACUC-2019-000106)，L1210細胞株(廣州吉妮歐生物科技有限公司)，胎牛血清(北京TransGen Biotech公司)，RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；青霉素/鏈霉素抗生素(美國Gibco公司)，CytoFLEX流式細胞儀(美國Beckman公司)。CD3 APC-A700、CD8 PC7(美國Beckman公司)，CD69 PE、CD4 FITC、CD80 FITC、CD86 PB450、信號調(diào)節(jié)蛋白α(signal regulatory protein alpha,SIRPα) APC、主要組組織相容性復(fù)合物Ⅱ(major group histocompatibility complex Ⅱ,MHCⅡ) APC(美國BD公司)等抗體用于流式細胞分析和細胞分選。GO、GO-C18由本課題組按照前期方法制備[1]。材料均輻照滅菌。

1.2細胞培養(yǎng)及共培養(yǎng)體系構(gòu)建 巨噬細胞、T細胞、B細胞及L1210細胞均于含1%青霉素/鏈霉素、10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。所有細胞取對數(shù)期細胞進行實驗。小鼠巨噬細胞-白血病細胞共培養(yǎng)體系建立方法：將處于對數(shù)期巨噬細胞和L1210細胞制成細胞懸液，巨噬細胞以6×105/孔鋪于0.4 μm孔徑的Transwell小室中，L1210細胞以3×105/孔鋪于Transwell小室下面6孔板的底部，加入適量完全培養(yǎng)基。待接種24 h細胞貼壁后將上培養(yǎng)室移回種有L1210細胞的Transwell培養(yǎng)板進行共培養(yǎng)，構(gòu)建共培養(yǎng)體系并分組實驗。

1.3巨噬細胞提取培養(yǎng)及功能檢測

1.3.1 巨噬細胞提取 取6～8周BALB/c小鼠，采用頸部脫臼法處死，解剖取出股骨和脛骨，剔除干凈肌肉組織后在75%酒精內(nèi)浸泡5 min，隨后于超凈工作臺內(nèi)剪去兩端骨骺暴露出骨髓腔，用1 ml注射器吸取無菌生理鹽水，將針頭插入骨髓腔內(nèi)沖洗出骨髓細胞，反復(fù)沖洗3次。收集沖洗液于干凈細胞皿內(nèi)，經(jīng)1 500 r/min離心5 min后吸去上清，加入紅細胞裂解液靜置5 min后用等量生理鹽水終止反應(yīng)，1 500 r/min離心5 min后取細胞沉淀，將所得骨髓細胞種于細胞皿內(nèi)，同時加入50 ng/ml巨噬細胞集落刺激因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)誘導(dǎo)巨噬細胞分化，經(jīng)過7 d后，成功誘導(dǎo)出巨噬細胞進行常規(guī)培養(yǎng)。

1.3.2 巨噬細胞吞噬能力檢測 成功誘導(dǎo)巨噬細胞后，設(shè)置GO、GO-C18兩個實驗組，使用藥物濃度相同；對照組以磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline,PBS)進行處理。以200 μg/ml、100 μg/ml、50 μg/ml濃度的GO、GO-C18和等量的PBS分別處理巨噬細胞24 h和48 h，顯微鏡下觀察細胞狀態(tài)，并通過抗CD47、IgG抗體檢測各組巨噬細胞的吞噬能力[9]。然后，使用10 μg/ml GO、GO-C18同法處理巨噬細胞12 h和24 h，并觀察細胞狀態(tài)，檢測其吞噬能力。建立巨噬細胞-L1210細胞共培養(yǎng)體系，以10 μg/ml GO、GO-C18處理巨噬細胞12 h和24 h后，檢測巨噬細胞對L1210腫瘤細胞的吞噬能力，同法觀察細胞狀態(tài)并檢測其吞噬能力[10-11]。

1.3.3 巨噬細胞活化及其他功能檢測 以10 μg/ml GO、10 μg/ml GO-C18和等量的PBS分別處理巨噬細胞24 h和48 h后，加入抗CD69、CD80、CD86、SIRPα、MHCⅡ抗體行流式分析，檢測巨噬細胞表面CD69、CD80、CD86、SIRPα、MHCⅡ等標志物的表達情況[12-14]。

1.4其他免疫細胞的活化檢測 取BALB/c小鼠脾臟淋巴細胞在體外培養(yǎng)，利用抗CD3、CD4、CD8抗體流式分選CD4+T、CD8+T、B細胞，同樣設(shè)置PBS、GO、GO-C18三組進行實驗。以10 μg/ml GO、10 μg/ml GO-C18和等量的PBS處理CD4+T、CD8+T細胞、B細胞48 h、60 h和72 h后，加入抗CD69抗體行流式分析，檢測CD69表達情況[12，15]。

2 結(jié)果

2.1巨噬細胞的吞噬功能 首先檢測200 μg/ml和100 μg/ml兩個濃度的GO、GO-C18分別處理24 h和48 h后對巨噬細胞吞噬能力的影響，發(fā)現(xiàn)其對巨噬細胞有明顯的細胞毒性，細胞死亡。于是，用50 μg/ml的處理濃度分別檢測這兩個納米材料對巨噬細胞吞噬能力的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)處理24 h和48 h后，其對巨噬細胞仍有明顯的細胞毒性，細胞死亡。最后，用10 μg/ml的納米材料處理12 h和24 h后，巨噬細胞正常生長，并可吞噬GO顆粒，于是檢測了10 μg/ml的納米材料處理巨噬細胞后，巨噬細胞對L1210腫瘤細胞吞噬能力未受到明顯影響(P>0.05)。見圖1～2。

圖1 10 μg/ml的GO和GO-C18分別處理巨噬細胞12 h后吞噬能力圖

圖2 10 μg/ml的GO和GO-C18分別處理巨噬細胞24 h后吞噬能力圖

2.2巨噬細胞活化與其他功能 通過流式分析檢測10 μg/ml的GO、GO-C18分別處理24 h和48 h后巨噬細胞表面標志物的表達變化，從而判斷其對于巨噬細胞的活化(CD69)、M1表型(CD80、CD86)、M2表型(SIRPα)、抗原提呈能力(MHCⅡ)的影響。結(jié)果表明，10 μg/ml的GO、GO-C18分別處理24 h和48 h后，其對于巨噬細胞的活化、M1表型、M2表型、抗原提呈能力均無明顯的影響(P>0.05)。見圖3～4。

圖3 10 μg/ml的GO和GO-C18分別處理巨噬細胞24 h后標志物表達情況圖

圖4 10 μg/ml的GO和GO-C18分別處理巨噬細胞48 h后標志物表達情況圖

2.3其他免疫細胞的活化 用10 μg/ml的GO、GO-C18分別處理48 h、60 h和72 h后，檢測其對于脾臟中的免疫細胞的影響。通過流式細胞技術(shù)檢測脾臟中的CD4+T細胞、CD8+T細胞、B細胞中CD69的表達情況。結(jié)果表明，10 μg/ml的GO、GO-C18分別處理48 h、60 h和72 h后，GO、GO-C18組CD4+T細胞、CD8+T細胞、B細胞活化較PBS均沒有產(chǎn)生明顯的影響(P>0.05)。見圖5～8。

圖5 10 μg/ml的GO和GO-C18分別處理T細胞48 h后活化狀態(tài)圖

圖6 10 μg/ml的GO和GO-C18分別處理T細胞60 h后活化狀態(tài)圖

圖7 10 μg/ml的GO和GO-C18分別處理T細胞72 h后活化狀態(tài)圖

圖8 10 μg/ml的GO和GO-C18分別處理B細胞48 h、60 h、72 h后活化狀態(tài)圖

3 討論

3.1介入醫(yī)學的發(fā)展與新材料的發(fā)展密切相關(guān)，目前“醫(yī)工”結(jié)合使得更多的新型材料逐漸應(yīng)用于介入領(lǐng)域[16]。GO作為一種新型、潛在的栓塞介入材料，已經(jīng)逐漸得到介入領(lǐng)域的重視。本課題組前期設(shè)計制備的阿霉素負載的直鏈烷基修飾氧化石墨烯(doxorubicin loaded linear alkyl grafted graphene oxide，DOX@GO-C18)能安全且有效地用于肝癌的TACE治療[3，17]。兔VX2肝癌實驗動物模型接受TACE治療2周后，CT增強掃描顯示腫瘤血供顯著減少；病理檢查顯示腫瘤明顯壞死，且術(shù)前及術(shù)后2周肝功能損傷是有限且可逆的，無嚴重并發(fā)癥。

3.2納米技術(shù)可以改善藥物對特定組織、細胞和亞細胞區(qū)室的靶向遞送，確保藥物持續(xù)穩(wěn)定和釋放，減少劑量限制性毒性，并減輕腫瘤免疫微環(huán)境施加的不利影響。研究報道納米藥物或載體對腫瘤免疫微環(huán)境具有一定調(diào)節(jié)作用，主要表現(xiàn)在增強腫瘤免疫原性、活化抗原呈遞細胞、T細胞及自然殺傷細胞、調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)巨噬細胞、抑制甚至消除髓系來源的抑制細胞等[18-19]。有研究表明，部分納米材料，例如納米羥基磷灰石具有免疫調(diào)節(jié)潛力，使T細胞和M1巨噬細胞標志物的表達升高促進M2巨噬細胞極化、組織血管化[20]。聚乙二醇納米載體可以誘發(fā)體內(nèi)產(chǎn)生抗體，激活補體，某些補體激活途徑還促進抗炎M2表型巨噬細胞，從而進一步促進腫瘤生長[21]。因此，研究納米載體本身對于免疫細胞，甚至免疫系統(tǒng)的影響是非常重要的。本研究初步探索了GO-C18作為載體對主要免疫細胞，包括巨噬細胞、T細胞、B細胞功能狀態(tài)的影響。結(jié)果顯示GO-C18及GO在10 μg/ml的濃度下對機體巨噬細胞活化、發(fā)揮吞噬功能、抗原呈遞無抑制作用，對T細胞、B細胞的活化亦無明顯影響。因此，在體外的細胞實驗中，可以看到GO-C18作為載體，并沒有對免疫細胞產(chǎn)生正向或者負向的影響，本身無免疫原性。其具備了通過加載藥物，改造成為免疫增強或者免疫抑制納米載體的潛力。目前應(yīng)用于臨床的栓塞材料，比如明膠海綿、栓塞微球等，其本身也無免疫原性。

3.3本研究的局限性主要是：(1)沒有在體內(nèi)進行GO-C18對免疫細胞影響的研究。栓塞用的GO-C18對體內(nèi)免疫細胞和腫瘤免疫微環(huán)境的影響有待進一步在體內(nèi)實驗中驗證。(2)本研究僅對部分主要免疫細胞進行檢測，沒有納入所有的免疫細胞進行檢測。(3)本研究對免疫細胞觀察的時間有限，無法獲得GO-C18對免疫細胞的長期影響。

綜上所述，動脈栓塞用GO-C18對巨噬細胞功能與活化以及T細胞、B細胞的活化無顯著不良影響，可以作為一種潛在的納米載體，為肝癌的介入治療提供新的栓塞材料選擇。