劉丹丹，朱俊松，張雪莉，陳 敏，郭怡廷,2，馬海樂,2,

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；2.江蘇大學(xué)食品物理加工研究院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；3.江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

炎癥是機(jī)體對損傷、感染等刺激發(fā)出的一種防御反應(yīng)，包括急性炎癥和慢性炎癥。急性炎癥是人體組織對有害刺激的最初反應(yīng)，主要涉及局部血管系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)及受傷組織內(nèi)的各種細(xì)胞。慢性炎癥主要導(dǎo)致炎癥部位細(xì)胞類型的逐步轉(zhuǎn)變，其特征在于炎癥過程中組織同時(shí)破壞和愈合。慢性炎癥會損害人體正常組織，削弱免疫耐受反應(yīng)，從而發(fā)展出自身免疫性疾病，代謝紊亂和進(jìn)行性疾病。炎癥性腸病（Inflammatory Bowel Disease，IBD）是一種典型的慢性炎癥疾病，其主要包括克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎，主要是遺傳易感性、免疫學(xué)、腸道微生物和外部環(huán)境之間復(fù)雜的相互作用所致。IBD 在全球范圍內(nèi)蔓延，其發(fā)病率與流行率逐年攀升，已成為一種嚴(yán)重危害人類健康的疾病。預(yù)計(jì)到2025 年，中國的IBD患病人數(shù)將超過150 萬人。

IBD 的治療主要是控制炎癥和免疫反應(yīng)，通常是長期服用非甾體類抗炎藥和皮質(zhì)類固醇。長期服用這些藥物有一定的副作用，對人體健康存在潛在的風(fēng)險(xiǎn)。因此，越來越多的研究開始關(guān)注食源性生物活性物質(zhì)對IBD 的預(yù)防及治療作用。Alberto 等從黑加侖中提取多酚并進(jìn)行體外模擬消化，消化物能夠抑制白介素-1（Interleukin-1，IL-1）誘導(dǎo)的Caco-2 細(xì)胞中白介素-6（Interleukin-6，IL-6）和腫瘤壞死因子-（Ttumor necrosis factor alpha，TNF-）的分泌，顯著下調(diào)環(huán)氧合酶2（Cyclooxygenase 2，COX-2）和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（Inducible nitric oxide synthase，iNOS）的mRNA 表達(dá)，從而表現(xiàn)出良好的抗炎作用。Liang 等研究了玉米多肽的消化產(chǎn)物對結(jié)腸炎的抗炎活性，發(fā)現(xiàn)玉米多肽的消化物可以顯著降低TNF-誘導(dǎo)的Caco-2 細(xì)胞中COX-2、iNOS 和白介素-8（Interleukin-8，IL-8）的表達(dá)，同時(shí)對葡聚糖硫酸鈉（Dextran sodium sulfate，DSS）誘導(dǎo)的小鼠結(jié)腸炎也具有預(yù)防和緩解作用。Huang 等研究發(fā)現(xiàn)雞蛋卵轉(zhuǎn)鐵蛋白中分離出來的三肽IRW 可以通過抑制p50 和p65 的核轉(zhuǎn)位的NF-B 信號通路介導(dǎo)來顯著降低TNF-誘導(dǎo)的人血管內(nèi)皮細(xì)胞粘附分子ICAM-1 和VCAM-1 的上調(diào)，從而抑制血管炎癥。對食源性活性物質(zhì)，尤其是食源性生物活性肽的抗炎效果雖不及藥物顯著，但是也可以顯著抑制炎癥因子的活性，對部分炎癥可以起到預(yù)防作用。

核桃（L.）是一種營養(yǎng)豐富的堅(jiān)果，在東亞、北美和歐洲東南部廣泛種植。據(jù)聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織（FAOSTAT）統(tǒng)計(jì)，2019 年中國的核桃種植面積達(dá)631330 公頃，核桃（含殼）年產(chǎn)量為2521504 噸，居世界首位。除了少部分核桃簡單加工后直接食用，大部分核桃用于榨取核桃油，因此產(chǎn)生了大量高蛋白含量的核桃粕副產(chǎn)物。核桃粕經(jīng)過簡單的脫脂處理后，即為核桃蛋白（蛋白含量≥75%）。核桃蛋白作為一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白資源，具有較高的消化率，易被人體胃腸消化道中的消化酶水解成小分子肽段或氨基酸。本課題組之前的研究發(fā)現(xiàn)，核桃蛋白經(jīng)過胃蛋白酶與胰酶的體外模擬胃腸消化后，可以被分解成分子量較小的多肽和氨基酸，直接食用核桃蛋白即可發(fā)揮良好的降血壓與抗氧化活性。因此，本文通過核桃蛋白的氨基酸組成與含量，評價(jià)了核桃蛋白的營養(yǎng)價(jià)值和消化性能，并通過DSS 誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎小鼠模型，研究了核桃蛋白經(jīng)過小鼠胃腸道消化后的抗結(jié)腸炎活性，并與堿性蛋白酶酶解制備的核桃蛋白酶解物作比較。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

核桃蛋白 遼寧長白仙子生物科技有限公司；堿性蛋白酶（350507 U·g） 南京誠納化工有限公司；DSS MP Biomedicals 公司；SPF 級雌性Balb/c小鼠（6～8 周齡，體重20±2 g） 江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2018-0012，合格證編號：201 918521；IL-1試劑盒RGB-60013M、IL-6試劑盒RGB-60023M 和TNF-試劑盒RGB-60080M北京瑞格博科技發(fā)展有限公司；髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）試劑盒A044-1-1 南京建成生物工程研究所；蘇木精-伊紅染色試劑盒G1120北京索萊寶科技有限公司。

DF-101S 集熱式磁力攪拌器 江蘇金壇西城新瑞儀器廠；TGL-16 高速臺式冷凍離心機(jī) 上海滬粵明儀器公司；Tecan Infinite PRO TWIN 200 多功能酶標(biāo)儀 瑞士帝肯（TECAN）集團(tuán)公司；PHS-25 型數(shù)顯式pH 計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司；S433D 氨基酸分析儀 德國卡塞姆有限公司；FreeZone 12plus真空冷凍干燥機(jī) 美國Labconco 公司；Leica 6500光學(xué)顯微鏡 德國徠卡。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 核桃蛋白氨基酸組成分析 根據(jù)Ketnawa 等的方法測定核桃蛋白的氨基酸組成及含量。準(zhǔn)確稱取一定量的蛋白粉置于密閉水解管中，加入6 mol/L HCl（含0.1%苯酚，v/v）在110 ℃下水解24 h，冷卻后過濾，定容，取1 mL 濾液在離心濃縮儀上濃縮揮發(fā)掉剩余的HCl。濃縮后的樣品稀釋20 倍后，取1 mL 使用自動氨基酸分析儀上機(jī)檢測。

1.2.2 核桃蛋白營養(yǎng)價(jià)值評價(jià) 以氨基酸組成為基礎(chǔ)，參照鄒平的方法，進(jìn)行核桃蛋白的營養(yǎng)價(jià)值分析，主要包括以下幾項(xiàng)指標(biāo)：

必需氨基酸（E）與總氨基酸（T）之比，即E/T%，是表征八種必需氨基酸占全部氨基酸的比重，并與FAO/WHO 推薦的模式標(biāo)準(zhǔn)比較，以此檢驗(yàn)核桃蛋白氨基酸組成的平衡性。

蛋白質(zhì)的功效比值（Protein efficiency ratio，PER）預(yù)測值，根據(jù)以下回歸方程計(jì)算：

蛋白質(zhì)的生物價(jià)（Biological value，BV）預(yù)測值，根據(jù)回歸方程計(jì)算：

用a代表蛋白質(zhì)中每種必需氨基酸含量與必需氨基酸總量的比值。當(dāng)a≤a時(shí)，q=a/a參考值；當(dāng)a≥a時(shí)，q=a/a。

1.2.3 核桃蛋白酶解物的制備 參照Liu 等的方法，制備物料濃度為5%（w/v）的核桃蛋白懸濁液，充分?jǐn)嚢韬笥诤銣厮″佒蓄A(yù)熱至50 ℃，用4 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)至9.0，然后加入7000 U/g（E/S）的堿性蛋白酶開始酶解。在酶解過程中使用0.5 mol/L NaOH 維持反應(yīng)體系pH 恒定，當(dāng)水解度到達(dá)8%時(shí)結(jié)束酶解反應(yīng)，沸水浴滅酶10 min 后，冷卻，調(diào)至pH7.0，得到滅酶和中和后的酶解液，并進(jìn)行下一步操作。

1.2.4 動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)遵守動物福利3R 原則、符合國際實(shí)驗(yàn)動物倫理學(xué)要求，并獲江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理與動物福利委員會（UJS IACUC）的審查批準(zhǔn)。參照梁秋芳的方法，將50 只SPF 級雌性Balb/c 小鼠（6～8 周齡），體重20±2 g，飼養(yǎng)于江蘇大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心的屏障系統(tǒng)內(nèi)。飼養(yǎng)環(huán)境晝夜各半，溫度20～26 ℃，濕度40%～70%，自由進(jìn)食飲水。適應(yīng)環(huán)境一周后，稱重并隨機(jī)分為5 組，每組10 只，分別為對照組、模型組、核桃蛋白酶解物組、核桃蛋白低劑量組和核桃蛋白高劑量組。

每天記錄小鼠體重，觀察急性結(jié)腸炎臨床癥狀。14 d 后，摘眼球取血，分離血清。脫頸處死小鼠，取結(jié)腸，將血清與結(jié)腸-80 ℃凍存，用于下一步分析檢測實(shí)驗(yàn)。具體實(shí)驗(yàn)流程如圖1 所示。

圖1 動物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)流程圖Fig.1 Flow chart of animal experiment design

1.2.5 疾病活動指數(shù)（DAI）評分 小鼠每天稱重并記錄體重；每天檢查糞便情況，肛周出血情況以及外觀表現(xiàn)情況，并參照Wirtz 等的方法進(jìn)行DAI 評分。具體評分標(biāo)準(zhǔn)如下：糞便評分：0=正常；1=濕/粘糞便；2=軟糞便；3=腹瀉。血便：0=無血；1=糞便或肛周有血；2=嚴(yán)重出血。外觀表現(xiàn)：0=正常；1=皮毛褶皺或步態(tài)改變；2=嗜睡或垂死狀態(tài)。

1.2.6 血清中IL-1、IL-6、TNF-以及MPO 濃度檢測 收集小鼠血液后，在室溫下靜置2 h，待分層后于4 ℃下3000 r/min 離心10 min，分離小鼠血清。將血清稀釋2 倍后，使用酶標(biāo)儀及酶聯(lián)免疫試劑盒測定小鼠血清中IL-1、IL-6、TNF-以及MPO 濃度。

1.2.7 組織切片染色 取小鼠的部分結(jié)腸組織，使用4%甲醛浸泡固定后，進(jìn)行石蠟包埋。組織切片機(jī)切片、蘇木精和伊紅（H&E）染色，在光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析使用軟件SPSS 19.0 進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果以平均值（n=3）±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，采用檢驗(yàn)分析組間數(shù)據(jù)差異性，不同字母代表差異顯著（＜0.05）；**代表差異極顯著（＜0.01）。圖表采用OriginPro8 繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃蛋白的氨基酸組成分析

核桃蛋白的氨基酸組成及含量如表1 所示，結(jié)果顯示，在核桃蛋白中，谷氨酸含量最高（23.74%），其次是精氨酸（14.27%）和天冬氨酸（9.92%），與毛曉英的研究結(jié)果相似。表2 的必需氨基酸評分顯示，與WHO/FAO推薦的氨基酸模式相比，核桃蛋白的大多數(shù)必需氨基酸含量高于成年人日常所需的標(biāo)準(zhǔn)值，其中，賴氨酸是第一限制性氨基酸，蛋氨酸是第二限制性氨基酸，這一結(jié)果與已報(bào)道的研究相似。根據(jù)表3，核桃蛋白中，必需氨基酸占總氨基酸的26.98%，氨基酸組成合理。因此，核桃蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白。與此同時(shí)，核桃蛋白中疏水性氨基酸（27.18%）與酸性氨基酸（33.66%）含量豐富，這導(dǎo)致了核桃蛋白的溶解度較低。

表1 核桃蛋白的氨基酸組成及含量Table 1 Amino acid composition and content of walnut protein

表2 核桃蛋白的必需氨基酸評分Table 2 Essential amino acid score of walnut protein

表3 核桃蛋白必需氨基酸及氨基酸殘基分布Table 3 Amino acid residues distribution and essential amino acids of walnut protein

蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值和消化特性很大程度上取決于蛋白質(zhì)的氨基酸組成。從Liu 等的研究可以發(fā)現(xiàn)，腰果蛋白與核桃蛋白的氨基酸組成相似，都具有高含量的谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸，都具有必需氨基酸含量（29.92%）高，疏水性氨基酸（39.37%）和酸性氨基酸（29.04%）含量豐富的特點(diǎn)。研究表明，腰果蛋白具有很高的體外消化率。其他具有高消化率的優(yōu)質(zhì)蛋白，如花生蛋白和杏仁蛋白的氨基酸組成也與核桃蛋白相似。這是由于胃蛋白酶主要分解酸性氨基酸羧基端的肽鍵，尤其是羧基為芳香族氨基酸（苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸等）的肽鍵。胰蛋白酶會特異性地切割堿性氨基酸（精氨酸或賴氨酸）的羧基端肽鍵，而胰凝乳蛋白酶特異性切割芳香族氨基酸或大型疏水性氨基酸殘基旁邊的肽鍵。堅(jiān)果蛋白的高消化率得益于蛋白中酸性氨基酸、疏水性氨基酸和精氨酸含量高。綜上氨基酸分析的結(jié)果表明，核桃蛋白是一種氨基酸組成合理，消化率高的優(yōu)質(zhì)植物蛋白。

2.2 核桃蛋白的營養(yǎng)價(jià)值分析

核桃蛋白的營養(yǎng)價(jià)值分析結(jié)果如表4 所示。PER是衡量蛋白質(zhì)利用率的指標(biāo)之一，優(yōu)質(zhì)蛋白的PER標(biāo)準(zhǔn)為2.0。本研究中使用的核桃蛋白粉的PER I、II 預(yù)測值分別為1.55 和1.58，高于其他蛋白，如菜粕蛋白，說明核桃蛋白的利用率高。BV 主要反映食物中的蛋白質(zhì)被機(jī)體消化吸收后，機(jī)體能夠利用的程度。由于色氨酸為未檢測氨基酸，在本研究中式（3）的最后一項(xiàng)計(jì)為1。經(jīng)過計(jì)算得出的核桃蛋白BV預(yù)測值為87.96，低于其他研究中體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的實(shí)測值（98.77%），預(yù)測值與實(shí)際值有一定的差異。但總體來說，核桃蛋白是一種易于被機(jī)體消化吸收的優(yōu)質(zhì)蛋白。

表4 核桃蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價(jià)值分析結(jié)果Table 4 Nutrition value of walnut protein

2.3 核桃蛋白及其酶解物對急性結(jié)腸炎小鼠臨床癥狀的影響

2.3.1 體重變化 DSS 可以破壞小鼠結(jié)腸上皮細(xì)胞，破壞腸道屏障的完整性，激活促炎細(xì)胞因子的分泌和基因表達(dá)，并導(dǎo)致嚴(yán)重的結(jié)腸炎，是常用的結(jié)腸炎動物模型造模劑。本研究使用DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型評價(jià)核桃蛋白及核桃蛋白酶解物的體內(nèi)抗炎作用。灌胃核桃蛋白及其酶解物對結(jié)腸炎小鼠體重變化的影響如圖2 所示。結(jié)果顯示：在實(shí)驗(yàn)的前7 d，小鼠體重均沒有顯著下降（＞0.05），說明灌胃核桃蛋白與核桃蛋白酶解物對小鼠體重沒有顯著影響。在飲用水中添加DSS 的第4 d 起，與對照組相比，模型組與灌胃核桃蛋白與核桃蛋白酶解物的治療組的小鼠體重均顯著下降（＜0.05），第5 d 起，治療組小鼠體重的下降幅度顯著低于模型組（＜0.05）。實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，模型組小鼠體重下降嚴(yán)重，部分小鼠出現(xiàn)死亡，而治療組的體重下降幅度顯著低于模型組（＜0.05）。低劑量、高劑量的核桃蛋白及核桃蛋白酶解物之間沒有顯著差異（＞0.05）。結(jié)果表明，灌胃核桃蛋白及核桃蛋白酶解物均可以顯著抑制DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的體重減輕。Fujun 等也同樣報(bào)道，核桃油對DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠也有類似的效果。

圖2 核桃蛋白及其酶解物對DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠體重變化的影響Fig.2 Effect of walnut protein and its hydrolysate on the body weight loss of DSS-induced colitis mice

2.3.2 DAI 評分 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行的14 d 內(nèi)，小鼠DAI 評分如圖3 所示。結(jié)果顯示：在引用水中添加DSS 后的第2 d 起，與對照組相比，模型組與治療組的部分小鼠開始出現(xiàn)糞便濕軟的狀況，隨著實(shí)驗(yàn)進(jìn)行，結(jié)腸炎癥狀加重，小鼠進(jìn)一步出現(xiàn)腹瀉，肛周出血，便血，嗜睡，皮毛無光澤等癥狀。然而，與模型組相比，治療組小鼠的癥狀出現(xiàn)時(shí)間較晚，臨床癥狀有所改善。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，治療組小鼠DAI 評分顯著低于模型組（＜0.05），在治療組中，核桃蛋白酶解物組＜核桃蛋白低劑量組組＜核桃蛋白高劑量組（＜0.05）。結(jié)果表明，灌胃核桃蛋白及其酶解物能顯著緩解DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的臨床癥狀，如腹瀉、便血、嗜睡等，且核桃蛋白酶解物優(yōu)于高劑量核桃蛋白優(yōu)于低劑量核桃蛋白。

圖3 核桃蛋白及其酶解物對DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠疾病活動指數(shù)（DAI）的影響Fig.3 Effect of walnut protein and its hydrolysate on disease activity index of DSS-induced colitis mice

2.3.3 結(jié)腸長度 由DSS 引起的小鼠結(jié)腸長度變化如圖4 所示。結(jié)果顯示，與對照組相比，在飲用水中添加DSS 的模型組以及治療組的小鼠結(jié)腸顯著縮短（＜0.01），但灌胃核桃蛋白及核桃蛋白酶解物并未顯著緩解急性結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸縮短的狀況（＞0.05）。急性結(jié)腸炎發(fā)病迅速，灌胃功能性食品的治療只能延緩發(fā)病時(shí)間，減輕發(fā)病癥狀，并不能抑制炎癥發(fā)作，因此并沒有顯著緩解結(jié)腸炎引起的小鼠結(jié)腸縮短狀況。

圖4 核桃蛋白及其酶解物對DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸長度的影響Fig.4 Effect of walnut protein and its hydrolysate on the colonic length of DSS-induced colitis mice

2.4 核桃蛋白及其酶解物對急性結(jié)腸炎小鼠血清炎癥因子的影響

細(xì)胞因子在IBD 的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，其可以激活巨噬細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞和T 細(xì)胞，引起免疫反應(yīng)失調(diào)和慢性炎癥。灌胃核桃蛋白及核桃蛋白酶解物對DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠血清中IL-1含量的影響如圖5 所示。模型組小鼠血清IL-1含量為11.92 ng/L，極顯著高于對照組（＜0.01），造模成功。與模型組相比，灌胃低劑量、高劑量的核桃蛋白及核桃蛋白酶解物均可以顯著降低小鼠血清中的IL-1含量（＜0.01）。IL-1是結(jié)腸組織釋放的主要促炎細(xì)胞因子之一，在IBD 的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，可以觸發(fā)和放大炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致促炎趨化因子和趨化因子水平升高。結(jié)果表明，核桃蛋白及酶解物經(jīng)過小鼠的體內(nèi)消化后，產(chǎn)生的小分子肽類及氨基酸被小腸吸收后，可以有效緩解結(jié)腸炎引起的血清IL-1含量升高，對炎癥的預(yù)防及治療有一定效果。

圖5 核桃蛋白及其酶解物對DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠血清中IL-1β 含量的影響Fig.5 Effect of walnut protein and its hydrolysate on IL-1β content in the serum of the DSS-induced colitis mice

灌胃核桃蛋白及核桃蛋白酶解物對DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠血清中IL-6 含量的影響如圖6 所示。與對照組相比，DSS 組小鼠血清中IL-6 的含量（74.18 ng/L）顯著升高（＜0.01），模型建立成功。與模型組相比，核桃蛋白低劑量組、核桃蛋白高劑量組以及核桃蛋白酶解物組的小鼠血清IL-6 含量分別為44.25、42.72 和40.04 ng/L，顯著低于模型組（＜0.01），并與對照組沒有顯著性差異（＞0.05）。IL-6 是研究最深入的細(xì)胞因子，是治療慢性炎癥的藥物靶標(biāo)，可刺激黏附分子的產(chǎn)生和內(nèi)皮活化，以及多形核細(xì)胞和單核細(xì)胞對炎癥灶的結(jié)合和募集。IL-6 的選擇性抑制劑可以有效抑制IBD。因此，在本研究中核桃蛋白及其酶解物通過降低IL-6 的含量來有效減輕結(jié)腸炎癥狀。

圖6 核桃蛋白及其酶解物對DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠血清中IL-6 含量的影響Fig.6 Effect of walnut protein and its hydrolysate on IL-6 content in the serum of the DSS-induced colitis mice

核桃蛋白及核桃蛋白酶解物對DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠血清中TNF-含量的影響如圖7 所示。結(jié)果顯示，與對照組相比，模型組小鼠血清中TNF-的含量高達(dá)120.53 ng/L，是對照組的3.48 倍（＜0.01）。灌胃核桃蛋白及核桃蛋白酶解物后，核桃蛋白低劑量組、高劑量組以及核桃蛋白酶解物組小鼠血清的TNF-含量分別為64.54、62.72 和61.39 ng/L，顯著高于對照組（＜0.05），且極顯著低于模型組（＜0.01）。TNF-是由巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞產(chǎn)生的一種促炎細(xì)胞因子，在急性炎癥反應(yīng)和其他促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生中起重要作用。灌胃核桃蛋白和核桃蛋白酶解物能顯著抑制DSS 引起的小鼠血清中TNF-含量升高，減緩結(jié)腸炎發(fā)病時(shí)間，減輕炎癥反應(yīng)。

圖7 核桃蛋白及其酶解物對DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠血清中TNF-α 含量的影響Fig.7 Effect of walnut protein and its hydrolysate on TNF-α content in the serum of the DSS-induced colitis mice

2.5 核桃蛋白及其酶解物對結(jié)腸炎小鼠血清MPO 酶活性的影響

核桃蛋白及核桃蛋白酶解物對DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠血清中MPO 酶活的影響如圖8 所示。結(jié)果顯示，在引用水中添加DSS 后，與對照組相比，模型組小鼠血清中MPO 酶的活力顯著增加（＜0.01），結(jié)腸炎模型建造成功。核桃蛋白低劑量組、核桃蛋白高劑量組和核桃蛋白酶解物組小鼠血清中的MPO酶活力略高于對照組但極顯著低于模型組（＜0.01）。MPO 是中性粒細(xì)胞的一種酶，是中性粒細(xì)胞浸潤的一個(gè)重要指標(biāo)，在腸道發(fā)炎組織中MPO 酶活性升高，生成有害的次氯酸，從而加劇炎癥反應(yīng)。核桃蛋白及其酶解物進(jìn)入小鼠的胃腸道后，經(jīng)過胃腸道消化酶的消化后，生成分子量較小的小肽及氨基酸，這些小分子物質(zhì)在小腸末端被吸收后，降低了結(jié)腸炎小鼠血清中MPO 酶的活性，從而減輕結(jié)腸炎反應(yīng)。

圖8 核桃蛋白及其酶解物對DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠血清MPO 酶活力的影響Fig.8 Effect of walnut protein and its hydrolysate on MPO activity in the serum of the DSS-induced colitis mice

2.6 核桃蛋白及其酶解物對結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織的形態(tài)學(xué)影響

通過分析結(jié)腸的組織學(xué)和形態(tài)學(xué)變化評估了核桃蛋白及其酶解物給藥對組織損傷嚴(yán)重程度的影響。DSS 處理會引起的粘膜屏障功能的物理破壞，通常在DSS 處理的小鼠中會觀察到與病理學(xué)改變相關(guān)的炎癥的組織學(xué)現(xiàn)象，包括炎癥細(xì)胞浸潤，胎盤侵蝕和結(jié)腸潰瘍等。該研究中小鼠結(jié)腸組織形態(tài)如圖9 所示，結(jié)果顯示，對照組的結(jié)腸切片顯示出正常腺體的典型特征，上皮中的杯狀細(xì)胞豐富，無粘膜增生，浸潤的免疫細(xì)胞較少（圖9a）。相比之下，經(jīng)DSS 處理的模型組結(jié)腸粘膜結(jié)構(gòu)喪失，炎性細(xì)胞浸入粘膜和粘膜下層，并且結(jié)腸組織的各層均出現(xiàn)較強(qiáng)的細(xì)胞炎癥（圖9b）。在治療組中，低劑量與高劑量核桃蛋白組（圖9c、圖9d）的結(jié)腸組織中存在一定量的炎癥細(xì)胞，但炎癥細(xì)胞的數(shù)量少于模型組，組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整。核桃蛋白酶解物組（圖9e）仍然可見少量炎癥細(xì)胞浸潤到粘膜和粘膜下層，但組織的細(xì)胞結(jié)構(gòu)基本完整，形態(tài)接近對照組。灌胃核桃蛋白及核桃蛋白酶解物對DSS 誘導(dǎo)的細(xì)胞形成和多灶性黏膜潰瘍均顯示出明顯的預(yù)防和緩解作用。根據(jù)組織學(xué)分析，灌胃核桃蛋白及核桃蛋白酶解物均可改善DSS 誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸炎癥。

圖9 核桃蛋白及其酶解物對DSS 誘導(dǎo)結(jié)腸炎小鼠的結(jié)腸組織形態(tài)影響（H&E 染色）Fig.9 Photomicrographs of H&E-stained colon sections from walnut protein and its hydrolysate administered DSS-induced mice

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，核桃蛋白在胃腸道消化酶的作用下，可以形成具有抗結(jié)腸炎活性的小分子肽段，與商業(yè)蛋白酶體外酶解得到的核桃蛋白酶解物相似。在一定濃度的條件下，經(jīng)過胃腸消化后的核桃蛋白及核桃蛋白酶解物可以通過抑制促炎細(xì)胞因子分泌，促進(jìn)抗炎因子產(chǎn)生以及保護(hù)腸道上皮屏障的完整性來改善DSS 誘導(dǎo)的急性結(jié)腸炎小鼠的癥狀，對結(jié)腸炎的急性發(fā)病階段具有較好的保護(hù)作用，這與皮蛋蛋白的胃腸消化物、大豆衍生肽、蛋清卵轉(zhuǎn)鐵蛋白的抗炎活性研究結(jié)果相似。

3 結(jié)論

本研究通過氨基酸組成評價(jià)了核桃蛋白的營養(yǎng)與消化特性，并通過DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型探究了核桃蛋白與核桃蛋白酶解物的抗炎效果。結(jié)果顯示，核桃蛋白是一種高消化率的優(yōu)質(zhì)植物蛋白，經(jīng)過胃腸消化后可以緩解DSS 誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠的臨床癥狀，減緩結(jié)腸炎導(dǎo)致的小鼠體重下降，抑制促炎細(xì)胞因子的分泌，改善結(jié)腸炎小鼠的形態(tài)學(xué)特征，減輕結(jié)腸組織損傷。核桃蛋白的直接利用不僅避免了過度加工引起的資源浪費(fèi)，而且為預(yù)防結(jié)腸炎的發(fā)生和發(fā)展的功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。