張軼斌，劉 鵬，紀(jì)海玉，賈曉昱，田 凌4,

（1.天津現(xiàn)代職業(yè)技術(shù)學(xué)院生物工程學(xué)院，天津 300451；2.天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院，天津 300457；3.天津市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，農(nóng)產(chǎn)品保鮮與加工技術(shù)研究所，天津 300384；4.唐山市盛川農(nóng)產(chǎn)品股份有限公司，河北唐山 064105）

我國是綠茶生產(chǎn)大國，2020 年產(chǎn)量達(dá)184 萬噸，占全國茶產(chǎn)量的60%。茶因其優(yōu)良的抗氧化、抗癌、抗炎、免疫調(diào)節(jié)和降糖功效等健康促進(jìn)作用而越來越受歡迎。茶多糖因其優(yōu)異的生物活性而備受關(guān)注。早期研究表明，茶多糖具有降低血糖和膽固醇水平、調(diào)節(jié)免疫、提高抗氧化能力、抗疲勞能力、調(diào)節(jié)腸道微生物等作用。近年來，植物多糖的提取受到越來越多的關(guān)注，水提法、超聲提取法、酶提取法、有機(jī)溶劑提取、微波等。其中熱水浸提法技術(shù)成熟，成本低，安全性較高且無污染，而超聲提取可能改變多糖的分子量，酶解提取對設(shè)備的pH 和溫度控制要求較高，微波提取設(shè)備存在輻射風(fēng)險等。多糖的結(jié)構(gòu)決定其生物活性，其生物活性受不同提取工藝的影響。熱水浸提法中提取的液料比、溫度、時間和次數(shù)等關(guān)鍵參數(shù)均是影響多糖產(chǎn)率的重要因素。不同產(chǎn)地的綠茶的抗氧化活性也不同，如免疫調(diào)節(jié)、抗疲勞、抗氧化、降血糖等。

氧化代謝過程中不斷產(chǎn)生活性氧（ROS），包括超氧化物、氧離子和氧自由基。ROS 在機(jī)體細(xì)胞中均可產(chǎn)生，并可參與多種生化過程。然而，ROS 在不受控制的情況下會積累并誘發(fā)多種身體疾病，過量的ROS 可通過酶（相關(guān)酶）和非酶抗氧化（非酶化合物）系統(tǒng)消除。目前已開發(fā)出多種抗氧化劑，如多酚、黃酮、多糖等，以清除自由基，減少體內(nèi)氧化損傷。茶多糖的抗氧化等生物活性與多糖分子量大小、糖醛酸含量、單糖比例和化學(xué)成分有關(guān)，另外，茶多糖與無機(jī)元素和蛋白質(zhì)結(jié)合可增強(qiáng)其生物活性，低分子量多糖因可以較容易的進(jìn)出細(xì)胞而表現(xiàn)出較好的抗氧化活性。因此，研究茶多糖的結(jié)構(gòu)和抗氧化活性，對于進(jìn)一步從天然資源中開發(fā)新型抗氧化劑是十分必要的。

目前，綠茶醇溶多糖的提取技術(shù)尚不成熟，結(jié)構(gòu)、功能和生物活性有待進(jìn)一步明確，本文優(yōu)化水提法工藝，結(jié)合光譜技術(shù)表征茶多糖的結(jié)構(gòu)和抗氧化活性，為綠茶行業(yè)新產(chǎn)品研制，行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)展提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

綠茶 日照2020 年新茶，采購自天津市正興德茶葉有限公司；抗氧化活性檢測試劑盒、DPPH（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl）、ABTS（2,2-azinobis-（3-ethylbenzthiazoline-6–sulfonate）、OH 自由基 南京建成生物工程研究所；無水乙醇 天津市江天化工技術(shù)有限公司；葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品、單糖標(biāo)準(zhǔn)品 北京索萊寶科技有限公司；其他試劑 均為分析純。

SHZ-D 循環(huán)水真空泵 上海保玲儀器有限公司；HH-W600 電熱恒溫水浴鍋 上海島韓實業(yè)有限公司；Instron3369 萬能材料試驗機(jī) 美國英斯特朗公司；721G-100 紫外分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司；VECTOR-22 傅里葉變換紅外光譜儀Bruker；1200 高效液相色譜儀 安捷倫科技（中國）有限公司；TSK-gel G4000PWxL 液相色譜柱（7.8 mm×300 mm）、GC-2010 Pro 氣相色譜儀、HP-5 氣相色譜柱 日本島津公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 綠茶粗多糖的提取工藝 綠茶原料篩選→清洗→打漿→熱水浸提→離心→濃縮→澄清→離心→80%乙醇處理→離心→上清液→濃縮→透析→粗多糖。

操作要點：將綠茶干燥至恒重，粉碎成粗粉，得到均勻的粉樣。每個預(yù)處理樣品（5.0 g）用蒸餾水在指定的液料比、提取溫度、提取時間和次數(shù)下提取。提取后，用60 ℃真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器濃縮上清，4 ℃下加入80%乙醇過夜沉淀，去除沉淀，去除乙醇收集上清。最后將溶液透析（截留分子量，600 Da），并凍干得到綠茶粗多糖（GTP）。

GTP 的得率（%）計算如下：

GTP 得率（%）=GTP 重量（g）∕預(yù)處理粉末重量（g）×100

1.2.2 單因素實驗 采用單因素實驗設(shè)計，考察了液料比、提取溫度、提取時間和提取次數(shù)對GTP 得率的影響。對每個單一因素進(jìn)行優(yōu)化，每個實驗重復(fù)3 次，實驗設(shè)計如表1。

表1 單因素水平設(shè)計Table 1 Single factor level

1.2.3 響應(yīng)面試驗 基于單因素實驗，采用3 個因素、3 個水平進(jìn)行提取優(yōu)化實驗，即液料比、提取溫度、提取時間，響應(yīng)值選擇多糖得率。各因子水平的范圍以初步實驗結(jié)果為依據(jù)，因素與水平設(shè)計見表2。

表2 響應(yīng)面試驗因素水平設(shè)計Table 2 Factors and levels of response surface test

1.2.4 多糖的結(jié)構(gòu)鑒定

1.2.4.1 多糖化學(xué)組成測定 以葡萄糖為標(biāo)準(zhǔn)品，用苯酚-硫酸法測定綠茶醇溶多糖中的總糖含量（y=0.9948x+0.0018，=0.9997）；以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，用考馬斯亮藍(lán)法定量測定多糖中蛋白質(zhì)含量（y=1.0598x-0.0048，=0.9998）。以葡萄糖醛酸為標(biāo)準(zhǔn)品，用咔唑-硫酸法測定糖醛酸含量（y=1.2543x-0.0092，=0.9984）。

1.2.4.2 平均分子量測定 采用高效液相色譜儀對多糖的平均分子量分布情況進(jìn)行檢測。以葡聚糖T-1（1×10Da）、T-3（3×10Da）、T-10（1×10Da）、T-40（4×10Da）、T-70（7×10Da）、T-110（1.1×10Da）為分子量標(biāo)準(zhǔn)品，以超純水為溶劑，將各個樣品和標(biāo)準(zhǔn)品配制成1.5 mg/mL 的溶液備用。采用配備液相色譜柱的高效液相色譜儀對本文中的樣品和標(biāo)準(zhǔn)品分子量進(jìn)行分析，其具體參數(shù)及設(shè)備配置如下：流動相為超純水，檢測器為示差檢測器，檢測器溫度為35 ℃，上樣量為20 μL，柱溫為30 ℃，洗脫流速為0.8 mL/min。最后以標(biāo)準(zhǔn)品的分子量對數(shù)值（lg M）為縱坐標(biāo)，出峰時間R為橫坐標(biāo)，建立相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后將多糖的出峰時間代入標(biāo)曲內(nèi)，得出其平均分子量的數(shù)值。

1.2.4.3 單糖組成分析 采用氣相色譜儀對本文中純化所得的綠茶醇溶多糖的單糖組成進(jìn)行分析。將凍干后的GTP 用2 mL 三氟乙酸（TFA）（2 mol/L）在密閉的試管中以110 ℃油浴水解4 h，去除多余的TFA 后，將水解產(chǎn)物乙酰化進(jìn)行GC 分析。以六乙酸肌醇為內(nèi)標(biāo)物（Inositol），D-葡萄糖（D-Glc）、L-鼠李糖（L-Rha）、D-半乳糖（D-Gal）、D-甘露糖（DMan）、D-阿拉伯糖（D-Ara）和D-木糖（D-Xyl）的衍生物為標(biāo)準(zhǔn)品。

1.2.4.4 主要官能團(tuán)檢測 綠茶醇溶多糖的官能團(tuán)性質(zhì)由傅里葉變換紅外光譜儀在紅外區(qū)間4000～400 cm測得。稱取0.7 mg 的多糖樣品和150 mg的溴化鉀粉末，快速混合后研磨成細(xì)粒度很高的粉末，并壓制成KBr 壓片上機(jī)進(jìn)行紅外光譜分析。

1.2.5 綠茶多糖的抗氧化活性測定

1.2.5.1 ABTS自由基清除能力 根據(jù)查學(xué)強(qiáng)等的方法并做了一定修改，稱取0.0384 g ABTS，過硫酸鉀0.0134 g，蒸餾水定容至20 mL，避光室溫過夜得ABTS 母液。以1:40 加入蒸餾水，在室溫，=734 nm條件下，將吸光值調(diào)節(jié)在0.7 備用。稱取粗多糖配制成2.5 mg/mL 溶液，再依次稀釋為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL。測定過程準(zhǔn)備多糖溶液0.2 mL，ABTS稀釋液3.0 mL，避光反應(yīng)10 min，測定其在734 nm吸光值。對照組使用蒸餾水，選用V溶液為陽性比對液。

式中：A多糖溶液的吸光值；A表示對照組吸光值；A表示蒸餾水代替ABTS 吸光值。

1.2.5.2 DPPH 自由基清除率 根據(jù)孫玉姣等的方法。稱取粗多糖配制成2.5 mg/mL 溶液，再依次稀釋為0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL，隨后再分別放進(jìn)0.004% DPPH 配制的甲醇溶液3 mL，搖勻，遮光擱置20 min，選用甲醇液為空白比對液，在517 nm 處檢測吸光度值，選用蒸餾水為陰性比對液，選用V溶液為陽性比對液。

式中：A蒸餾水代替待測液加入DPPH 溶液的吸光值；A待測液加入DPPH 溶液的吸光值；A待測液不加入DPPH 溶液的吸光值。

1.2.5.3 羥基自由基（OH·）清除率 根據(jù)Tao 等的方法，稱取多糖粗樣品和精制樣品液1 mL，加入1.5 mL 反應(yīng)液（含0.1 mmol/L 的EDTA、0.1 mmol/L FeCl和2.8 mmol/L DR 的磷酸鹽緩沖液（pH7.4）和0.35 mL HO（20 mmol/L），在37 ℃水浴下反應(yīng)40 min 后停止，在532 nm 處檢測吸光度值，選用蒸餾水為陰性對比值，V為陽性對比。抑制率（%）=（1-A/A）×100（式中：A為樣品吸光度；A為蒸餾水吸光度）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

響應(yīng)面設(shè)計軟件采用Design Expert 11，作圖軟件采用Origin 2017，顯著性分析采用SPSS 26.0，不同處理間差異顯著用＜0.05 表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 液料比對多糖得率的影響 對提高GTP 得率的4 個關(guān)鍵參數(shù)進(jìn)行了優(yōu)化研究。如圖1A 所示，隨著液料比從10:1 增大到30:1 mL/g，GTP 的得率提高，超過30:1 時，得率開始降低。推測較大的液料比有利于目標(biāo)組分的浸出，從而提高萃取得率。但過量的萃取溶劑會造成多糖的損失和溶劑的浪費。因此，選擇30:1 mL/g 的液料比進(jìn)行進(jìn)一步研究。

2.1.2 提取溫度對多糖得率的影響 提取溫度是影響多糖得率的重要因素之一。因此，在30～70 ℃條件下，液料比為30:1 mL/g，提取時間為3 h，提取次數(shù)為2，考察提取溫度對GTP 得率的影響。圖1B表示從30 到60 ℃，隨著萃取溫度的升高，GTP 的得率迅速上升，而超過60 ℃，GTP 得率開始下降。相關(guān)研究已經(jīng)證明高萃取溫度可以提高多糖的溶解度和提高水溶性多糖，而高溫可能導(dǎo)致的氧化和熱降解多糖。因此，后續(xù)實驗認(rèn)為提取溫度為60 ℃為最佳。

圖1 單因素實驗結(jié)果Fig.1 Single factor experimental results

2.1.3 提取時間對多糖得率的影響 提取時間是影響多糖提取率的另一個因素。從圖1C 中可以看出，GTP 的得率在70 min 達(dá)到峰值，然后隨著提取時間的延長而降低。推測提取時間過長會導(dǎo)致多糖的水解，從而降低多糖的得率。因此，選擇70 min 作為GTP 后續(xù)優(yōu)化的最佳提取時間。為考察提取次數(shù)對GTP 得率的影響，試驗1～5 次不同的提取次數(shù)，從圖1D 可以看出，隨著提取次數(shù)增加到2 次，GTP 得率急劇上升，然后逐漸平穩(wěn)?？紤]萃取率和損失考慮到提取頻率為2 次。

2.2 響應(yīng)面試驗優(yōu)化結(jié)果

由單因素實驗，確定了液料比、提取溫度和提取時間為響應(yīng)面因素，響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計如表3所示。

由表3 和表4 可知，響應(yīng)面試驗結(jié)果最佳工藝參數(shù)為：液料比30:1 mL/g，提取溫度60 ℃，提取時間70 min。應(yīng)用響應(yīng)曲軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合分析（采用編碼數(shù)據(jù)），可以獲得多元二次回歸方程模型。

表3 響應(yīng)面試驗優(yōu)化提取工藝結(jié)果Table 3 Extraction process results optimized by response surface

表4 響應(yīng)曲面優(yōu)化方差分析Table 4 Analysis of variance for response surface optimization

從方差分析表中可以看出，響應(yīng)面回歸模型極顯著（＜0.01）；回歸模型決定系數(shù)為0.9696，反映該線性回歸模型能在96.96%程度上解釋反應(yīng)變量Y 的變異性。由顯著性水平檢驗可知，B、AB、A2、B2、C2項對響應(yīng)值影響極顯著（＜0.01），A、C 項對響應(yīng)值影響顯著（＜0.05），AC、BC項對響應(yīng)值影響不顯著，表明實驗因素對綜合得分的影響不是簡單線性關(guān)系。實驗因素交互作用對綜合得分影響的3D 曲面圖和等高線圖如圖2。各因素之間的交互作用與響應(yīng)面曲線的陡峭程度有關(guān)，陡峭度越大，越顯著，通過陡峭程度分析發(fā)現(xiàn)，提取溫度對多糖得率影響最顯著，其次是液料比和提取時間，而且液料比和提取溫度的交互作用顯著。

圖2 因素交互作用影響的3D 響應(yīng)曲面圖和等高線圖Fig.2 3D response surface diagrams and contour diagrams of factors interaction

2.3 驗證結(jié)果

通過響應(yīng)面軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步的擬合分析，得出最佳提取條件為液料比30.48:1 mL/g、提取溫度61.29 ℃、提取時間71.21 min，此時，多糖得率達(dá)到10.61%。經(jīng)實驗驗證，設(shè)定液料比30:1 mL/g、提取溫度60 ℃、提取時間70 min，結(jié)果顯示該條件下綠茶得率為10.56%±0.18%，與理論值接近，說明模型擬合度良好，可靠性強(qiáng)。

2.4 綠茶多糖（GTP）的理化特性

純化后，GTP 中總糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸的比例分別為90.75%±3.69%、0.92%±0.09%和0.82%±0.07%，表明其是幾乎不含蛋白質(zhì)和糖醛酸的中性多糖。圖3 顯示GTP 的HPGPC 結(jié)果表明，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線（y=8.6977-0.385x，=0.9932）（y 表示分子量的自然對數(shù)，而x 表示相應(yīng)的保留時間），GTP 的平均分子量約為7.3 kDa。圖4 通過GC 分析確定GTP 主要由葡萄糖和半乳糖組成，摩爾比為1.00:0.13。

圖3 HPGPC 光譜分析結(jié)果Fig.3 HPGPC spectrum of GTP

圖4 單糖標(biāo)準(zhǔn)品（a）和GTP 單糖組成（b）檢測結(jié)果Fig.4 Test results of standard monosaccharides (a) and monosaccharide compositions of GTP (b)

2.5 綠茶多糖（GTP）的紅外光譜結(jié)果分析

由圖5 可知，綠茶多糖在3423.63、2918.78、1624.97、1431.66、1256.63、1080.02、533.89 cm等處均有吸收峰。其中，3423.63 cm處的譜峰代表O-H 基團(tuán)的伸縮振動，2918.78 cm代表C-H 伸縮振動和彎曲振動，1431.66 和1256.63 cm（C-H彎曲振動）等多處強(qiáng)吸收峰代表了多糖的特征峰。1624.97 cm的吸收峰表示結(jié)合水的存在，在1200～1000 cm范圍內(nèi)的峰為多糖中C-O-H 側(cè)基和C-O-C 糖苷鍵的特征。533.89 cm表明含有吡喃環(huán)，紅外光譜結(jié)果印證了上述數(shù)據(jù)。

圖5 綠茶多糖主要官能團(tuán)檢測結(jié)果Fig.5 Main functional groups detection results of GTP

由此可見，本文中從綠茶醇溶上清中分離得到的多糖GTP 是一種低分子量的含吡喃糖環(huán)的中性多糖，主要由葡萄糖和半乳糖組成。據(jù)報道，多糖的分子量會顯著影響其溶解度和生物活性，隨著乙醇濃度的增加，高分子量的多糖更難溶解。與高分子量的多糖相比，低分子量的多糖具有較高的溶解性和滲透性，因此更易表現(xiàn)出較強(qiáng)的生物活性。此外，目前關(guān)于綠茶多糖的提取普遍采用的水溶醇沉法，而上清液多被舍棄，造成能源和資源的浪費。因此本文從綠茶水提醇沉后的上清液中分離得到一種低分子量的多糖，進(jìn)而初步研究其抗氧化活性，為其后續(xù)的研究和實際應(yīng)用提供理論和數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

2.6 綠茶多糖的抗氧化活性分析

2.6.1 綠茶多糖對ABTS自由基清除能力 ABTS法常用于測定樣品的總抗氧化能力，隨著濃度的增大，多糖的ABTS自由基的清除能力逐漸增加，2.0和2.5 mg/mL GTP 對ABTS自由基的清除率分別為39.8%和42.5%，圖6 顯示，此時以V為陽性對照的ABTS自由基清除分別為71.4%和81.2%，表面綠茶多糖具有一定的清除ABTS自由基能力，具有較好的體外抗氧化活性，但低于V。

圖6 綠茶多糖的清除ABTS+自由基能力Fig.6 Scavenging ability of GTP on ABTS+ free radical

2.6.2 綠茶多糖對DPPH 自由基的清除能力 DPPH是一個穩(wěn)定的基團(tuán)，廣泛用于評價抗氧化劑對自由基的清除活性，能夠較好的反映溶液的抗氧化活性。在DPPH 測定中，抗氧化劑清除DPPH 自由基的作用歸因于它們的供氫能力，圖7 為綠茶多糖對DPPH自由基的清除活性，隨著多糖濃度的增加，DPPH 自由基清除率逐漸增強(qiáng)，當(dāng)多糖濃度提高到2.0 mg/L時，其清除率高達(dá)72.2%，而陽性對照V為85.1%，說明綠茶多糖具有較好的清除DPPH 自由基能力。

圖7 綠茶多糖的清除DPPH 自由基能力Fig.7 Scavenging ability of GTP on DPPH free radical

2.6.3 綠茶多糖對羥基自由基（OH·）的清除能力OH·是生物體內(nèi)最具活性的自由基，幾乎所有類型的大分子，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、碳水化合物和核酸，都可能被羥基自由基破壞，從而導(dǎo)致生物體老化。對比分析了醇沉和殼聚糖澄清兩種工藝條件對清除羥自由基能力的差異，如圖8，在0.5～2.5 mg/L 范圍內(nèi)均具有較好的羥基自由基清除能力，當(dāng)多糖濃度為2.0 mg/L 時，其對羥基自由基的清除能力已達(dá)到32.5%。當(dāng)多糖濃度為2.5 mg/L 時，其對羥基自由基的清除能力達(dá)39.2%。

圖8 綠茶多糖的清除羥基自由基能力Fig.8 Scavenging ability of GTP on OH free radical

3 結(jié)論

本研究通過單因素實驗和響應(yīng)面優(yōu)化了綠茶多糖的提取工藝，并對其初步結(jié)構(gòu)特性和體外抗氧化活性進(jìn)行研究。結(jié)果表明綠茶多糖的最佳工藝條件為：液料比30:1 mL/g，提取溫度60 ℃，提取時間70 min，在此條件下，實驗得到的GTP 產(chǎn)率為10.56%。多糖結(jié)構(gòu)和抗氧化分析結(jié)果表明，GTP 中總糖、蛋白質(zhì)和糖醛酸的比例分別為90.75%±3.69%、0.92%±0.09%和0.82%±0.07%，分子量約為7.3 kDa，主要由葡萄糖和半乳糖組成（摩爾比1.00:0.13），且在2 mg/mL濃度下其對ABTS自由基、DPPH 自由基和羥基自由基（OH·）清除率分別為39.8%、72.2%和32.5%。本研究所得綠茶多糖得率高，分子量低，且具有較高的抗氧化活性，為其在抗氧化功能性食品工業(yè)中的實際應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。