劉 娜，范明君，安曉萍，王 園，齊景偉,

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)草食家畜飼料工程技術(shù)研究中心，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018）

麩皮是小麥加工的主要副產(chǎn)物，含有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，包括多糖、淀粉、蛋白質(zhì)、酚類物質(zhì)和其他組分。麩皮中的非淀粉多糖含量較高，不利于被機(jī)體消化吸收，活性物質(zhì)利用率低，在一定程度上造成了資源的浪費(fèi)。大量研究報(bào)告顯示，利用微生物發(fā)酵可以降解麩皮中的非淀粉多糖和抗?fàn)I養(yǎng)因子含量，釋放多種活性物質(zhì)，如酚酸類物質(zhì)、多糖、蛋白質(zhì)等，對(duì)動(dòng)物提高抗氧化水平、增強(qiáng)機(jī)體免疫力起到促進(jìn)作用，從而大幅提高其應(yīng)用價(jià)值。

近幾年，天然抗氧化劑由于能抑制有害活性氧的生成和清除體內(nèi)存在的活性氧而成為國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。過量的氧自由基可以誘導(dǎo)細(xì)胞損傷，并促使各種疾病，如癌癥、肝硬化、糖尿病發(fā)生。抗氧化劑是抑制或延緩氧化的物質(zhì)，具有保護(hù)生物系統(tǒng)免受過度氧化的作用，可通過提高機(jī)體的抗氧化能力來預(yù)防多種疾病。抗氧化劑分為天然抗氧化劑和合成抗氧化劑。據(jù)報(bào)道，使用合成抗氧化劑可能存在細(xì)胞毒性和致癌潛能。因此，天然抗氧化劑的開發(fā)引起了食品和醫(yī)藥行業(yè)從事者的廣泛關(guān)注。

多糖是麩皮中重要的活性物質(zhì)，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和益生的作用。通過微生物發(fā)酵提取麩皮中的多糖有望開發(fā)為天然的抗氧化劑使用。史俊祥采用釀酒酵母菌和枯草芽孢桿菌發(fā)酵麩皮，發(fā)酵后多糖含量提高3.8 倍，用發(fā)酵麩皮多糖灌胃大鼠，結(jié)果表明發(fā)酵麩皮多糖有明顯的抗氧化活性。目前微生物發(fā)酵麩皮的菌種大多采用芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌和霉菌，鮮少有利用靈芝菌發(fā)酵提取麩皮多糖的研究。靈芝是一種大型食藥用真菌，具有抗氧化、抗腫瘤、提高免疫力等生理活性。人工培育靈芝子實(shí)體所需成本高、耗時(shí)長、且會(huì)對(duì)自然資源及環(huán)境造成負(fù)面影響。靈芝菌絲體液態(tài)發(fā)酵具有生產(chǎn)周期短、生長狀況穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)。靈芝液態(tài)發(fā)酵過程中能分泌豐富的纖維素和半纖維素降解酶系，還能產(chǎn)生靈芝多糖、三萜、酚酸等活性物質(zhì)。因此，本研究采用靈芝液態(tài)發(fā)酵的方法提取麩皮中的多糖，探討發(fā)酵前后麩皮粗多糖抗氧化活性及組分變化，初探靈芝發(fā)酵麩皮粗多糖的單糖組成、分子量和紅外光譜表征，為靈芝發(fā)酵麩皮粗多糖天然抗氧化劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

靈芝菌（CGMCC 5.616） 購自中國普通微生物菌種寶藏管理中心；麩皮 購買于市場(chǎng)；麩皮固體培養(yǎng)基（g/L）：麩皮100 g、麥芽糖10 g、蛋白胨2 g、蔗糖10 g、過磷酸鈣1 g、磷酸二氫鉀1 g、七水合硫酸鎂0.5 g、瓊脂30 g，自然pH，120 ℃高壓滅菌20 min。麩皮液體培養(yǎng)基（g/L）：麩皮100 g、麥芽糖10 g、蛋白胨2 g、蔗糖10 g、過磷酸鈣1 g、磷酸二氫鉀1 g、七水合硫酸鎂0.5 g，自然pH，120 ℃高壓滅菌20 min；乙腈（HPLC 級(jí)）、單糖標(biāo)準(zhǔn)品 均購自圣路易斯化工公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮（PMP） 北京化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、六氰合鐵酸鉀、二氯乙酸、氯化鐵、丁基羥基茴香醚（BHA）、維生素C、1,1-2 二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、硫酸亞鐵、水楊酸乙醇、HO等 均為分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

TG16-WS 臺(tái)式高速離心機(jī) 湖南湘儀儀器開發(fā)有限公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋 中國鄄城華魯電熱電器有限公司；DGX-9053B-1 電熱鼓風(fēng)干燥箱上海一恒科學(xué)儀器有限公司;TP214 分析天平梅特勒-托利多儀器有限公司；VFD-1000 冷凍干燥機(jī) 上海榮威儀器有限公司；RE-201D 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上?？婆d儀器有限公司；Nicolet iS5N 傅里葉變換紅外光譜儀 Thermo 公司；1200 高效液相色譜儀安捷倫科技有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 靈芝發(fā)酵麩皮的條件 將購買的靈芝菌種接種到麩皮固體培養(yǎng)基中進(jìn)行活化，30 ℃培養(yǎng)6～10 d，挑取約1 cm大小的菌塊接入到麩皮固體培養(yǎng)基中進(jìn)行第二次活化，30 ℃培養(yǎng)6～10 d，靈芝菌絲體長滿平板。從麩皮平板培養(yǎng)基中挑取3 塊1 cm的菌絲塊接種到麩皮液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min培養(yǎng)3 d 后得到一代靈芝發(fā)酵液，將一代發(fā)酵液按10%的接種量再接種到麩皮液體培養(yǎng)基中，30 ℃、150 r/min 培養(yǎng)5 d，得到靈芝麩皮發(fā)酵液。

1.2.2 發(fā)酵前后麩皮粗多糖的提取 將靈芝麩皮發(fā)酵液和麩皮液體培養(yǎng)基分別離心20 min（5000 r/min），沉淀物用3 倍體積的沸水浸提4 h，水提物旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)冷凍干燥后置于4 倍體積的90%乙醇溶液中，4 ℃沉淀過夜，收集沉淀，冷凍干燥。采用Sevage 結(jié)合酶法去蛋白，將沉淀樣品配制成4%的溶液，加入0.2%的中性蛋白酶，在40 ℃水浴鍋中繼續(xù)攪拌酶解1.5 h 后沸水浴10 min，冷卻后離心（5000 r/min，15 min），取上清液加入Sevage 試劑（三氯甲烷:正丁醇=4:1）3:1 混合，使用磁力攪拌器振蕩30 min，離心（5000 r/min，15 min），再取上清液再按3:1 與Sevage 試劑混合，離心，相同步驟重復(fù)兩次。收集最后一步的上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)冷凍干燥，最終得到靈芝發(fā)酵麩皮粗多糖（GWBP）和麩皮粗多糖（WBP）。

1.2.3 抗氧化活性指標(biāo)測(cè)定

1.2.3.1 DPPH 自由基清除率 吸取1 mL 不同濃度（0、0.5、1.0、2.0、4.0 g/L）粗多糖樣液，加1 mL DPPH 應(yīng)用液，混勻靜置30 min，在517 nm 處測(cè)定吸光度A；用蒸餾水代替樣液測(cè)定吸光度A；用95%乙醇代替DPPH 應(yīng)用液測(cè)定吸光度A。維生素C（V）和丁基羥基茴香醚（BHA）為陽性對(duì)照。

計(jì)算公式：

1.2.3.2 羥基自由基清除率 吸取1 mL 不同濃度（0、0.5、1.0、2.0、4.0 g/L）的樣液，加入0.5 mL 9 mmoL/L FeSO、8.8 mmoL/L HO反應(yīng)10 min 后，加入9 mmoL/L 水楊酸乙醇0.5 mL，反應(yīng)30 min，在510 nm 處測(cè)定吸光度。A：蒸溜水代替樣品吸光度；A：樣品吸光度；A：蒸餾水代替FeSO溶液吸光度。維生素C（V）和丁基羥基茴香醚（BHA）為陽性對(duì)照。

計(jì)算公式：

1.2.3.3 還原力的測(cè)定 吸取0.75 mL 不同濃度（0.5、1.0、2.0、4 g/L）的樣液，加入同體積0.2 moL/L磷酸緩沖液和1%六氰合鐵酸鉀，50 ℃反應(yīng)20 min，再加入同樣體積的10%三氯乙酸終止反應(yīng)，取1.5 mL反應(yīng)液加入1.5 mL 蒸餾水和400 μL 0.1% FeCl，室溫反應(yīng)10 min，700 nm 處測(cè)吸光度。維生素C（V）和丁基羥基茴香醚（BHA）為陽性對(duì)照。

1.2.4 發(fā)酵前后粗多糖組成分析 多糖的測(cè)定參照文獻(xiàn)[15]，多酚的測(cè)定參照文獻(xiàn)[16]，黃酮的測(cè)定參照文獻(xiàn)[17]，蛋白的測(cè)定參照文獻(xiàn)[13]。

1.2.5 靈芝發(fā)酵麩皮粗多糖單糖組成的測(cè)定 采用范明君的方法，分別稱取GWBP 和WBP 2 mg，加入0.5 mL 濃度為2 mol/L 三氟乙酸，120 ℃水解120 min，使用氮吹儀吹干。用單糖標(biāo)準(zhǔn)品配制成10 mg/mL 溶液，取5 μL 各個(gè)單糖標(biāo)品溶液，加入0.5 mL 濃度為2 mol/L 三氟乙酸中，與樣品同時(shí)在120 ℃下水解120 min，并使用氮吹儀吹干。向吹干后得到的樣品中加入0.5 mL 甲醇溶液（0.5 mol/L）和0.5 mL NaOH 溶液（0.3 mol/L），混勻后在70 ℃水浴條件下反應(yīng)30 min。冷卻至室溫，加入0.3 mol/L鹽酸0.5 mL 中和。用0.5 mL 氯仿反復(fù)萃取3 次，5000 r/min 離心5 min，取上清液，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾后待HPLC 分析。

HPLC 條件：SHISEIDO C色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動(dòng)相A 為0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液（pH7.0）；流動(dòng)相B 為乙腈水溶液（82:18，v/v）；流速為1.0 mL/min；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量10 μL；采用VWD 檢測(cè)器在245 nm 處檢測(cè)。

1.2.6 分子量測(cè)定 色譜柱：PL gel 色譜柱（300 mm×7.5 mm MIXED-BLS）；洗脫液：TCB+0.5 mg/L BHT；流速：1 mL/min；樣品濃度：2.0 mg/mL；進(jìn)樣量：100 μL；溫度：150 ℃；檢測(cè)器：示差檢測(cè)器（RI）、90°角光散射檢測(cè)器（RALS）、7°角光散射檢測(cè)器（LALS）和粘度檢測(cè)器。

1.2.7 紅外光譜分析 稱取GWBP 1 mg，與KBr 混合后研磨至粉末狀，采用紅外光譜儀掃描分析，于500～4000 cm波長范圍，觀察其吸收峰，確定其苷鍵類型，進(jìn)行紅外光譜分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2016 和SAS 9.2 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、繪圖和顯著性分析（ANOVA，＜0.05），試驗(yàn)結(jié)果除有特殊說明外，均為三次實(shí)驗(yàn)平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。

2 結(jié)果與分析

2.1 靈芝發(fā)酵麩皮粗多糖的抗氧化活性

2.1.1 DPPH 自由基清除率 由圖1 可知，GWBP 和WBP 的DPPH 自由基清除率隨著樣品濃度的增加而增高。GWBP 的DPPH 清除率在濃度0.5～4.0 g/L的范圍內(nèi)顯著高于WBP 組（＜0.05）。在濃度4 g/L時(shí)，GWBP 組對(duì)DPPH 自由基的清除率為91.37%，顯著高于BHA 組（86.81%）和WBP 組（75.15%），接近V組（95.44%）。說明靈芝發(fā)酵可以提高麩皮粗多糖的DPPH 自由基清除率。

圖1 不同濃度粗多糖的DPPH 自由基清除率Fig.1 DPPH radical scavenging rate of crude polysaccharides with different concentrations

2.1.2 羥基自由基清除率測(cè)定 由圖2 可知，GWBP和WBP 的羥基自由基清除率隨著樣品濃度的增加而增高。GWBP 的羥基自由基清除率在濃度0.5～4.0 g/L 的范圍內(nèi)顯著高于WBP 組（＜0.05）。在濃度4 g/L 時(shí)，GWBP 組的羥基自由基清除率為95.74%，顯著高于BHA 組（63.70%）和WBP 組（67.96%），接近V組（99.9%）。說明靈芝發(fā)酵可以提高麩皮粗多糖的羥基自由基清除率。

圖2 不同濃度粗多糖的羥基自由基清除率Fig.2 Hydroxyl radical scavenging rate of crude polysaccharides with different concentrations

2.1.3 還原力測(cè)定 由圖3 可知，GWBP 和WBP 的還原力隨著樣品濃度的增加而增高。在樣品濃度為0.5～4.0 g/L 的范圍內(nèi)，各組還原力由大到小的順序?yàn)椋篤＞BHA＞GWBP＞W(wǎng)BP；其中，GWBP 組的還原力顯著高于WBP 組（＜0.05）。當(dāng)樣品濃度為4.0 g/L時(shí)，GWBP 組的還原力為0.92，顯著高于WBP 組（0.83），接近BHA 組（0.97）和V組（0.98）（＜0.05）。說明靈芝發(fā)酵可以提高麩皮粗多糖的還原力。

圖3 不同濃度粗多糖的還原力Fig.3 Reducing power of crude polysaccharides with different concentrations

2.2 靈芝發(fā)酵麩皮粗多糖組分

對(duì)比發(fā)酵前后麩皮粗多糖的組成（見表1）。由表可知，GWBP 組中的黃酮、多酚和蛋白含量分別為5.41、12.74 和206.41 mg/g，顯著高于WBP 組（＜0.05）。GWBP 中的多糖含量與WBP 組相比則顯著降低（＜0.05）。說明靈芝發(fā)酵后麩皮粗多糖中的黃酮、多酚和蛋白含量顯著提高（＜0.05）。多酚作為一類具有多羥基化合物的次生代謝產(chǎn)物，能與蛋白質(zhì)、多糖等大分子相結(jié)合，清除并抑制自由基的生成，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗氧化功能。靈芝發(fā)酵麩皮粗多糖自由基清除率和還原力提升的原因可能與多糖組分中黃酮、多酚、蛋白含量的增加有關(guān)。

表1 發(fā)酵前后麩皮粗多糖組成（，n=3）Table 1 Composition analysis of wheat bran crude polysaccharide before and after fermentation (,n=3)

2.3 靈芝發(fā)酵麩皮的粗多糖結(jié)構(gòu)

2.3.1 單糖組成分析 初探靈芝發(fā)酵麩皮粗多糖的結(jié)構(gòu)表征。表2 為靈芝發(fā)酵麩皮粗多糖的單糖組成。由表2 可知，GWBP 的單糖組成為葡萄糖:木糖:核糖:阿拉伯糖:半乳糖:甘露糖:鼠李糖29.95:28.47:28.47:8.26:1.65:2.98:0.23。GWBP 組分主要以葡萄糖、木糖和核糖為主，三者的摩爾百分比達(dá)86.89%，還有少量的阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖和鼠李糖。杜涓用復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵麩皮，得到的糖蛋白單糖組成為甘露糖:核糖:鼠李糖:葡萄糖醛酸:半乳糖醛酸:葡萄糖:半乳糖:木糖:阿拉伯糖:巖藻糖

表2 靈芝發(fā)酵麩皮粗多糖的單糖組成Table 2 Monosaccharide composition of crude polysaccharide from Ganoderma lucidum fermented wheat bran

4.18 :0.57:0.28:0.21:007:33.33:4.59:31.29:25.31:0.16，以葡萄糖、木糖、阿拉伯糖為主，三者的摩爾百分比為89.93%。與本實(shí)驗(yàn)中的單糖組成結(jié)果不一致，原因可能是不同的發(fā)酵方式、菌種對(duì)麩皮粗多糖的單糖組成有不同的影響。

2.3.2 分子量分析 由圖4、表3 可以看出，粗多糖分子量分布系數(shù)可由Mw/Mn 的比值顯示，當(dāng)Mw/Mn值為1，說明粗多糖是由鏈長均相等的單分散聚合物組成，比值越大，分子量分布就越寬即分散度就越大。GWBP 的Mw/Mn 比值為1.170，結(jié)合GPC 譜圖可以看出，GWBP 分布較為集中。分子量測(cè)定結(jié)果顯示，GWBP 的分子量為4.172×10Da。

表3 靈芝麩皮粗多糖的分子量Table 3 Molecular weight of crude polysaccharide from Ganoderma lucidum fermented wheat bran

圖4 靈芝發(fā)酵麩皮粗多糖的GPC 譜圖Fig.4 GPC chromatogram of crude polysaccharide from Ganoderma lucidum fermented wheat bran

2.3.3 紅外光譜分析 紅外光譜用于定性測(cè)定多糖中重要的有機(jī)官能團(tuán)，特別是O-H、C-H 和C=O 官能團(tuán)，它們是多糖的重要組成部分。從圖5 可以看出，GWBP 在3400 cm附近有較強(qiáng)的吸收峰，歸因于O-H 的拉伸振動(dòng)；在2920 cm附近的吸收峰是由于C-H 拉伸振動(dòng)引起的。在1660 和1412 cm處的吸收峰是COO-的特征峰，糖甙鍵C-O-C 出現(xiàn)在1152 和1077 cm附近的不對(duì)稱振動(dòng)，表明樣品中含有吡喃基糖環(huán)。紅外光譜結(jié)果顯示GWBP 是一種吡喃糖，在4000～500 cm范圍內(nèi)有多糖特征吸收峰。

圖5 GWBP 的紅外光譜圖Fig.5 Infrared spectra of the GWBP

3 討論

本文探討了靈芝液態(tài)發(fā)酵對(duì)麩皮粗多糖組成及抗氧化活性的影響。DPPH 自由基清除率是最常見的體外抗氧化活性指標(biāo)。羥基自由基主要導(dǎo)致相鄰生物分子的氧化損傷，被認(rèn)為是最有害的ROS。因此，清除羥自由基對(duì)細(xì)胞或食物系統(tǒng)的抗氧化防御具有重要意義。靈芝發(fā)酵麩皮粗多糖（GWBP）的DPPH、羥基自由基清除率和還原力在0.5～4.0 g/L的濃度范圍內(nèi)顯著高于未發(fā)酵麩皮粗多糖（WBP）（＜0.05）。GWBP 在濃度4 g/L 時(shí)的DPPH、羥基自由基清除率顯著高于丁基羥基茴香醚（BHA）組（＜0.05），接近V組。說明靈芝發(fā)酵可以顯著提高麩皮粗多糖的體外抗氧化活性，靈芝發(fā)酵麩皮粗多糖在一定濃度范圍內(nèi)可以替代合成的抗氧化劑BHA使用，清除DPPH 和羥基自由基。

對(duì)比靈芝發(fā)酵前后麩皮粗多糖的單糖組成，GWBP 組分中的黃酮、多酚和蛋白含量顯著高于WBP（＜0.05），多糖含量顯著下降（＜0.05），原因可能是靈芝生長代謝過程中產(chǎn)生的酶系降解了一部分麩皮中的非淀粉多糖，同時(shí)靈芝代謝產(chǎn)生的黃酮、多酚、小肽等物質(zhì)與大分子的多糖結(jié)合在一起導(dǎo)致了GWBP 組分的變化。杜涓等研究表明發(fā)酵麩皮多糖的抗氧化活性與其多糖組分中的多酚和蛋白含量存在顯著的正相關(guān)。本試驗(yàn)中GWBP 體外抗氧化活性升高的原因也可能與其多糖組分中的多酚和蛋白含量的增加有關(guān)。

初探GWBP 的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，GWBP 是一種吡喃糖，其單糖組成主要以葡萄糖、木糖和核糖為主，三者的摩爾百分比達(dá)86.89%。GWBP 的分子量為4.172×10Da，分布較為集中。杜涓用復(fù)合菌固態(tài)發(fā)酵麩皮，得到的糖蛋白單糖組成以葡萄糖、木糖、阿拉伯糖為主。這與本研究結(jié)果不同，原因可能是不同的發(fā)酵方式、發(fā)酵菌株對(duì)麩皮多糖的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了不同的影響。有研究報(bào)道稱由幾種單糖組成的異多糖和小分子量的多糖具有更高的生物活性。本實(shí)驗(yàn)中的靈芝發(fā)酵麩皮粗多糖單糖組成種類豐富，且分子量也較小。

本文采用靈芝液態(tài)發(fā)酵麩皮的方法提取麩皮粗多糖，對(duì)靈芝發(fā)酵麩皮粗多糖的體外抗氧化活性、組成變化及單糖組成、分子量、紅外光譜進(jìn)行了探索性研究，結(jié)果證明靈芝發(fā)酵麩皮粗多糖具有開發(fā)為天然抗氧化劑的潛力。

4 結(jié)論

本文采用靈芝液態(tài)發(fā)酵麩皮，通過熱水浸提、乙醇沉淀、Sevage 結(jié)合酶法去蛋白，提取出靈芝發(fā)酵麩皮粗多糖；對(duì)比了靈芝發(fā)酵前后麩皮粗多糖的體外抗氧化活性及組成變化，發(fā)現(xiàn)靈芝發(fā)酵麩皮粗多糖的體外抗氧化活性顯著提高（＜0.05），其組分中黃酮、多酚、蛋白含量的提高可能是其抗氧化活性增強(qiáng)的原因。靈芝發(fā)酵有利于麩皮的高值化、資源化利用。靈芝發(fā)酵麩皮粗多糖有望開發(fā)為一種天然抗氧化劑應(yīng)用在食品工業(yè)、保健品等領(lǐng)域。