王 敬，張海超，賈海濤，艾連峰

（石家莊海關(guān)技術(shù)中心，河北石家莊 050051）

蛋白同化激素是一類可以調(diào)節(jié)機體代謝，促進細胞的生長分化，進而增強食欲、促進發(fā)情、提高飼料轉(zhuǎn)化率的甾體激素，在畜牧養(yǎng)殖業(yè)應用廣泛。然而，濫用該類抗生素會造成其在動物組織不同程度的殘留，進而引起消費者內(nèi)分泌紊亂，導致兒童性早熟，甚至增加致癌、致畸等風險。因此世界各國均規(guī)定了動物源性食品中蛋白同化激素的最大殘留限量，歐盟、美國和日本等國家或組織就規(guī)定禁止將蛋白同化激素應用到食用型動物的飼養(yǎng)中。我國農(nóng)業(yè)部第250 號公告將群勃龍、甲睪酮、美侖孕酮等同化激素列為禁用獸藥；GB 31650-2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》要求苯丙酸諾龍和丙酸睪酮不得在動物性食品中檢出，同時世界反興奮劑機構(gòu)發(fā)布的《禁用清單國際標準》將蛋白同化劑列為禁止使用的興奮劑類藥物。

激素通過代謝殘留于動物體內(nèi)，含量非常低，大部分在μg/kg 水平，目前國內(nèi)外分析蛋白同化激素殘留的檢測方法主要有高效液相色譜法（HPLC）、氣質(zhì)聯(lián)用法（GC/MS）、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLCMS/MS）和高分辨線性離子阱法等。由于動物源性食品基質(zhì)的復雜性，HPLC 法和GC/MS 法由于干擾嚴重，檢出限高難以滿足要求；高分辨線性離子阱法由于設備昂貴，仍然難以大規(guī)模推廣使用；HPLC-MS/MS 法因其靈敏度高，選擇性強等特點應用廣泛；QuEChERS 是一種新的前處理技術(shù)，廣泛應用于動植物樣品中的農(nóng)獸藥殘留檢測，但采用QuEChERS 前處理方法同時測定動物源食品中蛋白同化激素殘留的研究尚未見報道。

目前針對動物源性食品中蛋白同化劑的檢測也有一些相關(guān)文獻報道，但檢測基質(zhì)僅局限于肌肉、牛奶和飼料等動物源性食品，未涉及調(diào)制肉制品。西方食用調(diào)制肉制品的人群較多，該類食物為動物源性食品的重要部分，其監(jiān)管絕對不能出現(xiàn)漏洞。因此，建立一種快速、準確的適用于動物源性食品中蛋白同化激素的檢測方法即可滿足當前食品安全檢測的需求，又能避免重大賽事中運動員因誤服誤用導致興奮劑陽性事件的發(fā)生。本文采用QuEChERS 前處理技術(shù)，通過優(yōu)化樣品前處理及色譜、質(zhì)譜分析條件，建立了同時測定肌肉組織（豬肉、牛肉、羊肉）、調(diào)制肉（火腿、牛肉餅、咖喱肉、羊肉串）、肝臟組織（豬肝、豬腎）、牛奶和雞蛋等基質(zhì)動物源食品中14 種蛋白同化激素殘留量的高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法。該方法快速準確、適用基質(zhì)范圍廣，能為打擊在動物源性食品中激素類藥物的違法使用提供強有力的技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

肌肉組織（豬肉、牛肉、羊肉）、調(diào)制肉（火腿、牛肉餅、咖喱肉、羊肉串）、肝臟組織（豬肝、豬腎）、牛奶和雞蛋等樣品 均購自當?shù)厥袌觯蝗翰垼═renbolone，CAS：1061-33-8）、勃地龍（Boldenone，CAS：846-48-0）、諾龍（Nandrolone，CAS：433-22-0）、睪酮（Testosterone，CAS：58-22-0）、美雄酮（Methandienone，CAS：72-63-9）、甲睪酮（17-methyltesterone，CAS：58-18-4）、脫氫表雄酮（Dehydroepiandrosterone，CAS：53-43-0）、丙酸諾龍（Nandrolone 17-propionate，CAS：7207-92-3）、丙酸睪酮（Testosterone propionate，CAS：57-85-2）、黃體酮（Progesterone，CAS：57-83-0）、雄諾龍（Stanolone，CAS：521-18-6）、司坦唑醇（Stanozolol，CAS：10418-03-8）、美替諾龍（Methenolone，CAS：153-00-4）、苯丙酸諾龍（Nandrolone phenylpropionate，CAS：62-90-8）等14 種蛋白同化激素 純度≥95%，德國Dr.Ehrenstorfer 公司；乙腈（色譜純）、甲酸（色譜純）、甲醇（色譜純）、正己烷（色譜純）、-葡萄糖醛酸酶及芳香基硫酸酯酶（-葡萄糖醛酸酶＞100000 Units/mL，芳香基硫酸酯酶＜20000 Units/mL）、QuEChERS 凈化管（300 mg 無水硫酸鎂、50 mg PSA、50 mg C、300 mg 中性氧化鋁）上海安譜實驗科技股份有限公司；乙酸、乙酸銨、氯化鈉 分析純，廣州化學試劑廠；實驗用水Milli-Q 超純水 美國Millipore 公司。

Waters Acquity UPLC/XEVOTQ-S 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜儀（配電噴霧離子源） 美國Waters 公司；VORTEX 2 渦旋振蕩器 德國Heidolph 公司；KQ-200 TDB 超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；ML 204/02 分析天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；CR22GIII 型高速冷凍離心機 日本HITACHI 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 標準溶液的配制 標準儲備液（1 mg/mL）配制：分別稱取14 種蛋白同化激素標準品10 mg（精確至0.1 mg）于10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，4 ℃避光保存。

混合標準中間液（1 μg/mL）配制：準確吸取標準儲備液各0.10 mL，置于100 mL 容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，配制成1 μg/mL 的混合標準中間液，4 ℃冷藏保存。

基質(zhì)匹配混合標準工作溶液配制：準確量取適量混合標準中間液，用50%乙腈溶液稀釋空白樣品基質(zhì)提取液，配制成濃度為0.1、0.2、0.5、1、5、10 ng/mL 的系列標準工作溶液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.2.2 樣品前處理 稱取5.0 g 樣品（精確至0.01 g）于50 mL 具塞塑料離心管中，加入10 mL 乙酸銨緩沖溶液（pH5.2），渦旋混勻，再加入-葡萄糖醛酸酶及芳香基硫酸酯酶溶液100 μL，于（37±1）℃振蕩酶解12 h，取出冷卻至室溫，加入20 mL 乙腈、5 g 氯化鈉，渦旋振蕩2 min，4000 r/min 離心5 min。移取10 mL 乙腈層至另一離心管中，加入10 mL 乙腈飽和正己烷，渦旋振蕩1 min 后棄去正己烷層，再加入10 mL 乙腈飽和正己烷重復操作一次。取上清液約5 mL 置于裝有300 mg 無水硫酸鎂、50 mg PSA、50 mg C和300 mg 中性氧化鋁的另一10 mL 離心管中，渦旋振蕩2 min，10000 r/min 高速離心5 min。準確移取4 mL 上清液于10 mL 離心管中，40 ℃氮吹至近干，用1 mL 50%乙腈溶液溶解殘渣。經(jīng)0.22 μm 濾膜過濾，用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。

1.2.3 儀器條件 色譜柱：Waters Acquity BEH C（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；進樣量：5 μL；柱溫：40 ℃；流動相：A 相為0.1%甲酸水溶液，B 相為乙腈；流速：350 μL/min；梯度洗脫程序如下：0～1.0 min，20%B；1.0～5.0 min，20%B～90%B；5.0～6.0 min，90%B～100%B；6.0～6.5 min，100%B～20%B；6.5～8.0 min，20%B。

電離方式：電噴霧正離子源（ESI）；檢測模式：多反應監(jiān)測（MRM）模式；毛細管電壓：3.5 kV；離子源溫度：150 ℃；去溶劑溫度：450 ℃；脫溶劑氣流量：1000 L/h；碰撞氣流量：0.17 mL/min。待測物的母離子、子離子、保留時間及碰撞能等參數(shù)見表1。

表1 14 種待測物的多反應監(jiān)測質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Multi-reaction monitoring mass spectrometry parameters of the target compounds

1.3 數(shù)據(jù)處理

在沃特世超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀上通過MassLynx 軟件獲取和分析數(shù)據(jù)，所有試驗數(shù)據(jù)均應用SPSS 19.0 統(tǒng)計學軟件進行處理，以平均數(shù)±標準差（X±S）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取溶劑的優(yōu)化

外源性同化激素在動物體內(nèi)的代謝情況比較復雜，目前沒有文獻明確指出14 種蛋白同化激素在動物體內(nèi)的代謝過程和代謝途徑。黃冬梅等報道蛋白同化激素多以葡萄糖醛酸結(jié)合形態(tài)存在，酶解可促進蛋白同化激素水解成游離態(tài)，從而提高樣品中激素的提取效率。14 種蛋白同化激素屬于脂溶性化合物，極性較弱，難溶于水，易溶于極性有機溶劑。蛋白同化激素常用的提取溶劑有叔丁基甲醚、乙酸乙酯、乙腈、甲醇等。通過待測物加標回收率，試驗考察了豬肉中甲醇、乙腈、乙酸乙酯和叔丁基甲醚四種溶劑的提取效果。由圖1 可知，同甲醇（回收率范圍：63%～94%）、乙酸乙酯（回收率范圍：52%～91%）、叔丁基甲醚（回收率范圍：45%～88%）相比，乙腈（回收率范圍：85%～108%）是最合適的提取溶劑。甲醇對勃地龍、諾龍、脫氫表雄酮、雄諾龍和丙酸諾龍的提取效果不理想，且甲醇提取樣品雜質(zhì)較多，基質(zhì)干擾嚴重；乙酸乙酯和叔丁基甲醚的乳化現(xiàn)象嚴重，常需要進行破乳。甲醇極性較強但樣品中的色素和脂肪等基質(zhì)干擾物較多，增加了后續(xù)凈化的難度；乙腈穿透力強具有較強的沉淀蛋白作用，提取效率高；考慮到動物源性食品中含有大量的蛋白質(zhì)，采用乙腈提取，既可以鹽析，又可以沉淀蛋白質(zhì)，一定程度上能夠減少基質(zhì)效應，有利于后續(xù)的凈化。

圖1 提取溶劑的種類對蛋白同化激素回收率的影響Fig.1 Different extraction solvents on the extraction rate for anabolic androgenic steroids

對比了10、20 和50 mL 目標物濃度為50 ng/mL的提取溶劑對回收率的影響，結(jié)果如圖2 顯示，當提取溶劑體積為10 mL 時，除諾龍、甲睪酮、丙酸睪酮和丙酸諾龍外，其他10 種蛋白同化激素的提取率在45%～70%之間；當提取溶劑體積為20 mL 時，回收率均能達到80%以上，最終用20 mL 乙腈提取。動物源性食品中含有大量的脂肪和蛋白質(zhì)，脂肪易被有機溶劑萃取，對分析造成嚴重的基質(zhì)干擾，試驗采用乙腈飽和的正己烷萃取可有效去除脂肪。

圖2 提取體積對蛋白同化激素回收率的影響Fig.2 Different extraction volume on the extraction rate for anabolic androgenic steroids

2.2 凈化劑的選擇與優(yōu)化

實驗選取了C、HLB、通過式PRiME HLB 固相萃取柱和QuEChERS 四種凈化方式進行了比較。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，C柱凈化效果較差，基質(zhì)效應明顯；HLB 和通過式PRiME HLB 固相萃取柱對目標物的保留性強，需要后續(xù)的乙腈進行洗脫，增加了基質(zhì)效應的影響，二者雖然結(jié)果重現(xiàn)性好，但存在操作繁瑣、處理時間長、成本高等問題。QuEChERS 方法常用的凈化劑有N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷（C）、石墨化炭黑（GCB）、中性氧化鋁等。PSA 可以去除乙腈提取液中的脂肪酸、糖類、酚類以及極性色素等成分；C能吸附基質(zhì)中部分非極性脂肪和脂溶性雜質(zhì)；中性氧化鋁具有良好的除脂能力；GCB 能夠去除色素和固醇類雜質(zhì)，但對苯環(huán)類平面結(jié)構(gòu)的藥物有一定的吸附，實驗最終選定PSA、C和中性氧化鋁作為樣品吸附劑?？疾炝瞬煌浔鹊腜SA、C和中性氧化鋁的凈化效果，結(jié)果如表2 所示。取5 mL 提取液，加入20 mg PSA 和100 mg 中性氧化鋁，分別比較C添加量為10、30、50、70 mg 時，14 種蛋白同化激素的回收率，發(fā)現(xiàn)C添加量為50 mg 時14 種蛋白同化激素的回收率最高；加入50 mg C和100 mg 中性氧化鋁，分別比較PSA 添加量為10、30、50、70 mg 時，14 種蛋白同化激素的回收率，發(fā)現(xiàn)PSA 添加量為50 mg時，14 種蛋白同化激素的回收率最高；中性氧化鋁對大部分目標物的吸附較少，加入50 mg C和50 mg PSA，分別比較中性氧化鋁添加量為100、200、300、400 mg 時，14 種蛋白同化激素的回收率，發(fā)現(xiàn)中性氧化鋁在加入300 mg 時凈化后的溶液較之前清澈透亮，基線較平整，當增加到400 mg 時，回收率會下降。因此，實驗最終選擇5 mL 提取液加入300 mg無水MgSO、50 mg C、50 mg PSA 和300 mg 中性氧化鋁作為凈化劑組合時，樣品可以獲得良好的凈化效果，基質(zhì)干擾小，且不會對目標物產(chǎn)生明顯吸附。

表2 不同條件凈化劑組合蛋白同化激素回收率Table 2 Recovery of anabolic hormones by combination of purifiers under different conditions

2.3 色譜條件的優(yōu)化

試驗選擇了Agilent Eclipse Plus C（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）、Waters Acquity BEH C（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）和Agilent Zobrax SB-C（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）三種色譜柱進行分離。試驗發(fā)現(xiàn)，由于蛋白同化激素屬于弱極性和中等極性化合物，普通的C柱均能保留目標物，但14 種物質(zhì)在Waters Acquity BEH C（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）柱上均能得到優(yōu)異的色譜峰形，重現(xiàn)性好，對不同極性的化合物均有合適的保留且質(zhì)譜檢測本底低。因此，試驗選擇Waters Acquity BEH C（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）柱。

2.4 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

蛋白同化激素屬于脂溶性化合物，弱極性或中等極性，以乙腈-水為基準流動相，采用“T”三通方式，對14 種目標物的質(zhì)譜條件進行優(yōu)化。在正離子和負離子模式下進行全掃描，以選擇適當?shù)姆肿与x子峰和電離方式。結(jié)果表明，在離子源ESI電離方式下，可以獲得較高豐度的[M+H]母離子。在確定目標物的母離子后，采用子離子掃描方式對子離子進行了選擇，通過優(yōu)化毛細管電壓、一級錐孔電壓、二級錐孔電壓、射頻透鏡電壓、碰撞能量以及質(zhì)譜分辨率等參數(shù)，使每種激素的分子離子與特征碎片離子產(chǎn)生的離子強度達到最大。將液相色譜與三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)機，對離子源溫度、去溶劑氣溫度及流量、錐孔氣流量進行優(yōu)化，使每種目標物的離子化效率達到最佳，14 種蛋白同化激素的質(zhì)譜分析參數(shù)見表1。圖3 為蛋白同化激素混合標準溶液的MRM 色譜圖。

圖3 蛋白同化激素標準溶液多反應監(jiān)測色譜圖（0.5 ng/mL）Fig.3 MRM chromatograms of anabolic androgenic steroids (0.5 ng/mL)

2.5 基質(zhì)效應

基質(zhì)效應（Matrix effects，ME）是指色譜分離時共洗脫的物質(zhì)改變了待測成分的離子化效應，所引起的信號的抑制或提高，是目標物和基質(zhì)成分相互競爭導致的結(jié)果。消除和補償基質(zhì)效應主要包括優(yōu)化色譜質(zhì)譜條件，優(yōu)化色譜分離條件，多步驟凈化措施，使用內(nèi)標物定量，采用基質(zhì)匹配標準曲線定量等。基質(zhì)效應（matrix effect,%）ME=（基質(zhì)匹配標準曲線的斜率/純?nèi)軇藴是€的斜率-1）×100?；|(zhì)效應為負值表示存在基質(zhì)抑制效應，為正值表示基質(zhì)增強；基質(zhì)效應在-15%～15%之間認為基質(zhì)效應不明顯；絕對值越大表示基質(zhì)效應越強。試驗比較了豬肉、豬肝、火腿、牛奶和雞蛋的基質(zhì)效應，圖4 發(fā)現(xiàn)不同的樣品基質(zhì)存在不同程度的影響，為消除基質(zhì)效應對待測物的定量準確度和精密度的影響，試驗采用基質(zhì)匹配標準曲線定量法基本減小或消除了基質(zhì)干擾對結(jié)果的影響。

圖4 14 種蛋白同化激素的空白樣品基質(zhì)效應結(jié)果Fig.4 Matrix effect of 14 anabolic androgenic steroids in different sample matrices

2.6 線性關(guān)系、檢出限和定量限

配制濃度為0.1、0.2、0.5、1、5 和10 ng/mL 的基質(zhì)匹配標準工作溶液進行測定，以定量離子的響應峰面積（Y 軸）對相應的質(zhì)量濃度（X 軸，ng/mL）作標準曲線，得到線性回歸方程，線性關(guān)系良好，其結(jié)果見表3。實驗以空白添加法，并根據(jù)前處理過程提取凈化過程以及進行測定時所受的干擾情況，確定14種蛋白同化激素的檢出限為0.3 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg。該方法檢出限和定量限低，能夠滿足動物源性食品中蛋白同化激素殘留檢測的要求。

表3 14 種蛋白同化激素的線性關(guān)系及相關(guān)系數(shù)Table 3 Linear relationship and correlation coefficient of 14 anabolic androgenic steroids

試驗考察了肌肉組織（豬肉、牛肉、羊肉）、調(diào)制肉（火腿、牛肉餅、咖喱肉、羊肉串）、肝臟組織（豬肝、豬腎）、牛奶和雞蛋等動物源性食品，涉及的基質(zhì)數(shù)目多數(shù)據(jù)量大，本文列舉了復雜且具有代表性的豬肉、豬肝和火腿的加標回收率范圍和精密度數(shù)據(jù)。試驗分別選取不含14 種蛋白同化激素的豬肉、豬肝和火腿3 種不同類型樣品為空白基質(zhì)，在1.0、2.0和10 μg/kg 添加水平進行添加回收率試驗，每個水平重復做六次，測得方法的平均回收率為75.7%～104.1%，精密度范圍為3.60%～12.1%，符合規(guī)定的要求，其檢測結(jié)果見表4。

表4 蛋白同化激素的回收率范圍及精密度（n=6）Table 4 Average recovery ranges and RSDs (n=6) of anabolic androgenic steroids

2.7 實際樣品的測定

分別對市售的16 批豬肉、10 批火腿、4 批牛肉餅、8 批羊肉串、7 批牛肉、5 批牛肝和24 批牛奶樣品進行了14 種蛋白同化激素的檢測，結(jié)果顯示，74 批動物源性食品中除了黃體酮外均未檢出其他13 種蛋白同化激素。牛奶中黃體酮的檢出含量為1.1～3.6 μg/kg，檢出率為10.2%。黃體酮是卵巢黃體分泌的一種天然內(nèi)源性孕激素，在體內(nèi)對雌激素激發(fā)過的子宮內(nèi)膜有顯著形態(tài)學影響，為維持妊娠所必須，因此在動物源性的食品中具有一定比例的檢出率。在世界反興奮劑機構(gòu)《2021 年禁用清單國際標準》中未涉及黃體酮，因此目前國內(nèi)外尚未有明確的限量規(guī)定。

3 結(jié)論

本實驗建立了分散固相萃取-液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定動物源性食品中14 種蛋白同化激素殘留量。酶解后的樣品經(jīng)乙腈提取，乙腈飽和正己烷脫脂后，采用分散固相萃取凈化結(jié)合基質(zhì)外標法校正。結(jié)果表明，該方法前處理提取率高，條件易于控制，方法靈敏度高，重復性好，可為動物源性食品中該類物質(zhì)的快速檢測提供一定的技術(shù)支持。