童 凡，黃家琪，范堅(jiān)強(qiáng)，黃仕新，龍 騰，吳 鵬，何 偉,，鄧小華，陳善義，唐 旭

（1.福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，福建廈門 361021；2.自然資源部第三海洋研究所，福建廈門 361005）

-淀粉酶（-amy1ase，EC.3.2.1.1）是參與食物中糖類物質(zhì)分解代謝的一種糖苷酶，能夠水解淀粉、糖原或多糖的中的-1,4-糖苷鍵，生成麥芽糖、短鏈糊精和少量葡萄糖等產(chǎn)物，是一種內(nèi)切型液化酶，廣泛應(yīng)用于烘焙、釀造、食品、飼料、醫(yī)藥等工業(yè)。-淀粉酶主要來(lái)自微生物和動(dòng)植物，而微生物所產(chǎn)淀粉酶因工藝簡(jiǎn)單、生產(chǎn)成本低而被大范圍開(kāi)發(fā)與應(yīng)用到工業(yè)生產(chǎn)中。同時(shí)隨著工業(yè)的大規(guī)模生產(chǎn)，篩選出活力高且穩(wěn)定的淀粉酶是酶制劑工業(yè)關(guān)注的焦點(diǎn)。

常壓室溫等離子體（atmospheric and room temperature plasma，ARTP）誘變技術(shù)相對(duì)于傳統(tǒng)的誘變技術(shù)具有操作簡(jiǎn)易、條件溫和、安全可靠等優(yōu)勢(shì)，現(xiàn)已成為誘變領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。王興吉等利用ARTP 誘變技術(shù)對(duì)中溫淀粉酶進(jìn)行誘變處理，篩選出誘變菌株BS-12，比原始菌株酶活提高了32.2%；林楊等在ARTP 技術(shù)下篩選得到一株蛋白酶酶活提高64.5%的乳酸菌；Wang 等對(duì)節(jié)桿菌進(jìn)行ARTP誘變處理，篩選得到了酶活提升30%的產(chǎn)葡聚糖酶菌株。

目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)菌株產(chǎn)淀粉酶及產(chǎn)酶條件優(yōu)化的研究較多，但關(guān)于利用ARTP 技術(shù)在提高淀粉酶酶活產(chǎn)量等性能的菌株誘變選育應(yīng)用中報(bào)道比較少。因此本研究利用ARTP 技術(shù)誘變處理從煙葉原位篩選得到的產(chǎn)淀粉酶菌株，進(jìn)一步提高其酶活產(chǎn)量，獲得遺傳穩(wěn)定的誘變菌株，為進(jìn)一步的深入研究及工業(yè)化生產(chǎn)和開(kāi)發(fā)酶制劑打下理論基礎(chǔ)并提供穩(wěn)定高效的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株FS-1 本實(shí)驗(yàn)室保藏菌種，經(jīng)16S rDNA測(cè)序鑒定為韓國(guó)芽孢桿菌（）；胰蛋白胨、酵母提取物、蛋白胨、牛肉膏、瓊脂等 均為分析純，生工生物工程（上海）股份有限公司；其余試劑 均為國(guó)產(chǎn)分析純；LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、酵母提取物5 g、NaCl 10 g、瓊脂18 g（固體）、蒸餾水1000 mL、pH7.2；發(fā)酵培養(yǎng)基：蛋白胨10 g、牛肉膏3 g、可溶性淀粉2 g、NaCl 5 g、CaCl0.5 g、蒸餾水1000 mL、pH7.0，以上培養(yǎng)基均在121 ℃下高溫滅菌20 min；DNS 試劑：結(jié)晶苯酚6.9 g、NaSO6.9 g、酒石酸鉀鈉225 g、1%的3,5-二硝基水楊酸溶液880 mL、10%的NaOH 溶液315.2 mL。

BP-10 pH 計(jì) 德國(guó)Sartorius 有限公司；GR60DF全自動(dòng)立式高壓滅菌鍋 廈門致微儀器有限公司；SW-CJ-IFD 超凈工作臺(tái) 蘇州凈化有限公司；生化培養(yǎng)箱 寧波萊?？萍加邢薰?；MQT-60R 振蕩培養(yǎng)箱 上海旻泉儀器有限公司；3K15 Sigma 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī) Sigma 離心機(jī)有限公司；ARTP-M 誘變育種儀 無(wú)錫源清天木生物科技有限公司；EQU312藍(lán)光切膠儀 生工生物工程（上海）股份有限公司；M5多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices 有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株活化 取保藏于-80 ℃冰箱的FS-1 接于LB 液體培養(yǎng)基，于37 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min 振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后，將富集菌液涂布至LB 固體培養(yǎng)基，置于37 ℃生化培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后得到純化菌株。

1.2.2 ARTP 誘變菌株篩選及遺傳穩(wěn)定性 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的FS-1 菌液10 μL，用涂布棒均勻涂布在滅菌載片表面，將載片放置ARTP 操作臺(tái)凹槽中，調(diào)節(jié)氣流量至10 L/ min，電源功率設(shè)為120 W，操作溫度為20 ℃，發(fā)射源與菌懸液的工作距離為2 mm，誘變處理時(shí)間設(shè)為0、10、20、30、40、60、80、100 s，通過(guò)計(jì)算菌株致死率，繪制出致死率曲線。ARTP 誘變后菌株致死率計(jì)算公式為：

致死率（%）=（1-m）/n×100

式中，m 為ARTP 誘變處理后平均菌落數(shù)；n 為未經(jīng)ARTP 誘變處理后平板菌落數(shù)。

對(duì)菌株FS-1 進(jìn)行ARTP 誘變處理后，將挑選出的誘變菌株在LB 固體培養(yǎng)基上進(jìn)行10 代接種劃線，每代一測(cè)酶活，以驗(yàn)證誘變菌株的產(chǎn)酶能力是否穩(wěn)定地遺傳至下一代。

1.2.3 誘變前后菌株生物量及酶活測(cè)定 將誘變前后純化單菌落接種至LB 液體培養(yǎng)基中，于37 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min 振蕩培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h 后得種子液。將種子液以1%接種量接至發(fā)酵培養(yǎng)基中，于37 ℃、轉(zhuǎn)速180 r/min 振蕩培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔12 h 取發(fā)酵液，測(cè)其生物量OD，直至96 h，同時(shí)將發(fā)酵液12000 r/min 離心3 min 后取上清為粗酶液，測(cè)定淀粉酶活力。

淀粉酶酶活測(cè)定采用DNS法，略有改動(dòng)。比色管中加入1.0 mL 酶液，加入1.0 mL 1.5%可溶性淀粉溶液混勻后，60 ℃水浴恒溫反應(yīng)10 min 后立即加入2.5 mL DNS 試劑混勻后終止反應(yīng)，后沸水浴10 min，冷卻后加水定容至25 mL，充分搖勻。另取1.0 mL 經(jīng)沸水浴滅活10 min 的酶液與1.5%可溶性淀粉溶液作為空白，按上述相同步驟，用空白調(diào)零點(diǎn)，于540 nm 測(cè)吸光度值。淀粉酶酶活計(jì)算公式如下：酶活采用國(guó)際單位，每分鐘水解淀粉產(chǎn)生1 μg 的還原糖所需的酶量為一個(gè)酶活單位（U）。

酶活力（U/mL）=（N×N×G×10×1.0×10）/10×1

式中：N為粗酶液稀釋倍數(shù)；N為比色反應(yīng)稀釋倍數(shù)；G 為葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線查得的葡萄糖濃度；10為mg 與g 的轉(zhuǎn)換；1.0 標(biāo)準(zhǔn)曲線葡萄糖溶液的體積；10為mol 轉(zhuǎn)化為μmol 的系數(shù)；10 為酶水解反應(yīng)時(shí)間，min；1 為酶活測(cè)定時(shí)粗酶液的體積，mL。

1.2.4 誘變前后菌株酶學(xué)特性研究

1.2.4.1 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性測(cè)定 將菌株誘變前后所得酶液分別與1.5%可溶性淀粉溶液（pH5.5）混勻后置于40、50、60、70 ℃條件下測(cè)定酶活力。以最適溫度下酶活性為100%，計(jì)算其它溫度下相對(duì)酶活，確定誘變前后該淀粉酶反應(yīng)的最適溫度。

將菌株誘變前后所得酶液分別與1.5%可溶性淀粉溶液（pH5.5）混勻后置于40、50、60、70 ℃條件下處理30、60、90 min 后測(cè)定酶活力，計(jì)算其相對(duì)酶活。

1.2.4.2 最適反應(yīng)pH 及酸堿耐受性測(cè)定 在菌株誘變前后所得酶液中分別加入1.5%可溶性淀粉溶液（pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0），最適溫度下測(cè)定酶活力。以最適pH 條件下酶活性為100%，計(jì)算其它pH 下相對(duì)酶活，確定誘變前后該淀粉酶反應(yīng)的最適pH。

將菌株誘變前后所得酶液中分別加入1.5%可溶性淀粉溶液（pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0）在4 ℃下冰浴30、60、90 min 后測(cè)定酶活力，計(jì)算其相對(duì)酶活。

1.2.4.3 金屬離子對(duì)淀粉酶活力的影響 將菌株誘變前后所得酶液中分別加入終濃度為1 mmol/L 的Ca、Na、Mg、Mn金屬離子溶液，測(cè)定此條件下的淀粉酶活力，同時(shí)都以未加金屬離子的反應(yīng)體系作為對(duì)照（相對(duì)酶活100%），分析不同金屬離子對(duì)該淀粉酶活力的影響。

1.2.4.4 紫外光對(duì)淀粉酶活力的影響 為研究紫外光對(duì)淀粉酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的影響，在4 ℃保持不失酶活前提下將菌株誘變前后所得酶液分別置于波長(zhǎng)440～485 nm、功率120 W 的紫外光下進(jìn)行照射，每隔1 h取樣測(cè)定淀粉酶活力，直至6 h，分析紫外光照射時(shí)間對(duì)所產(chǎn)淀粉酶活力的影響。以未經(jīng)紫外光照射的反應(yīng)體系作為對(duì)照（相對(duì)酶活為100%）。

1.3 數(shù)據(jù)處理

本文中所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置三次重復(fù)，所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。本文圖表數(shù)據(jù)處理采用Excel 2007 及Origin 軟件進(jìn)行分析與制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 ARTP 誘變致死率曲線的測(cè)定

按1.2.2 中菌株誘變致死率公式計(jì)算，獲得野生型菌株FS-1 的致死率結(jié)果如圖1 所示。致死率隨誘變時(shí)間增加而增加，誘變時(shí)間在0～30 s 時(shí)，致死率幾乎呈大斜率線性增長(zhǎng)，說(shuō)明該菌株對(duì)ARTP 誘變射線十分敏感；誘變時(shí)間在30 s 時(shí)，致死率達(dá)到95.9%；誘變時(shí)間大于30 s 后，隨時(shí)間增加，致死率呈近似水平線；誘變時(shí)間大于60 s，致死率大于98%。綜上，0～30 s 之間，菌株細(xì)胞死亡殆盡，之后的時(shí)間內(nèi)，菌株只剩下較少的細(xì)胞存活，基于菌株誘變死亡率＞95%時(shí)正突變率最高，因此在誘變處理時(shí)間選擇大于30 s。

圖1 誘變致死率Fig.1 Mutagenic lethality rate

2.2 誘變菌株的篩選及遺傳穩(wěn)定性

通過(guò)對(duì)比不同誘變時(shí)間菌株發(fā)酵后的酶活高低，從中挑選出4 株酶活較野生型FS-1 提高20%以上的誘變菌株，編號(hào)為FS-103、FS-115、FS-141、FS-144，酶活分別提高了39%、25%、78%、50%，具體結(jié)果如表1 所示。對(duì)以上誘變菌株進(jìn)行10 次傳代培養(yǎng)，每代測(cè)一次酶活，只有FS-103 的酶活相對(duì)于FS-1 能穩(wěn)定地保持在20%以上增長(zhǎng)率，這表明菌株FS-103 產(chǎn)淀粉酶能力也具有良好的遺傳穩(wěn)定性。而其余三株FS-115、FS-141 和FS-144 均沒(méi)有保持良好的遺傳性狀，在傳代過(guò)程中酶活有所下降，并未達(dá)到20%的增長(zhǎng)。結(jié)果如圖2～圖5 所示，因此后續(xù)研究選取FS-103 進(jìn)行試驗(yàn)。

圖2 菌株FS-103 的連續(xù)傳代穩(wěn)定性Fig.2 Stability of strain FS-103 in continuous passage

圖3 菌株FS-115 的連續(xù)傳代穩(wěn)定性Fig.3 Stability of strain FS-115 in continuous passage

圖4 菌株FS-141 的連續(xù)傳代穩(wěn)定性Fig.4 Stability of strain FS-141 in continuous passage

圖5 菌株FS-144 的連續(xù)傳代穩(wěn)定性Fig.5 Stability of strain FS-144 in continuous passage

表1 誘變菌株篩選結(jié)果Table 1 Enzyme activity of mutagenic strain

2.3 菌株生物量與酶活曲線

野生菌株FS-1 與誘變菌株FS-103 在發(fā)酵培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)情況及淀粉酶積累情況如圖6 所示?？傮w來(lái)看，誘變前后菌株的生長(zhǎng)曲線與酶活曲線的變化趨勢(shì)是相同的。在發(fā)酵培養(yǎng)中，F(xiàn)S-1（圖6a）的生物量在12～24 h 逐漸增加，在24～60 h 進(jìn)入平衡期前期，60～96 h 進(jìn)入衰退期。相比之下FS-103（圖6b）的生物量在12～36 h 逐漸增加，在36 h 生物量達(dá)到最高，60～96 h 進(jìn)入衰退期。FS-1 與FS-103 所產(chǎn)生的淀粉酶在12～84 h 快速積累，60～84 h 積累淀粉酶維持在較高水平，其中FS-1 在發(fā)酵84 h 酶活達(dá)到最高值7028.26 U/mL，F(xiàn)S-103 在發(fā)酵84 h 酶活達(dá)到最高值9050 U/mL。此外，發(fā)酵時(shí)長(zhǎng)大于12 h 的FS-103 酶活比FS-1 平均提高了45%左右，當(dāng)發(fā)酵36 h 酶活提高大于90%。由此可見(jiàn)，經(jīng)過(guò)ARTP 誘變后篩選得到的FS-103 產(chǎn)淀粉酶能力遠(yuǎn)高于野生型菌株FS-1。

圖6 菌株生物量與酶活Fig.6 Strain biomass and enzyme activity

2.4 誘變前后菌株酶學(xué)特性

2.4.1 最適反應(yīng)溫度及熱穩(wěn)定性分析 溫度對(duì)酶活影響較大，一方面溫度升高有利于酶促反應(yīng)的進(jìn)行，另一方面，大多數(shù)酶屬于蛋白質(zhì)，溫度過(guò)高會(huì)導(dǎo)致其結(jié)構(gòu)破壞從而降低酶活。由圖7 可知，隨著溫度的升高，酶活先升高后降低，40～60 ℃間，野生型FS-1 與誘變菌株FS-103 的酶活均能維持在80%左右，F(xiàn)S-103 的最適溫度為60 ℃，比FS-1 的50 ℃提升了10 ℃，不僅高于曹慧等篩選菌株XC2 的最適反應(yīng)溫度50 ℃，且當(dāng)溫度提升至70 ℃時(shí)，F(xiàn)S-103相對(duì)于FS-1 仍保留70%左右的酶活，而菌株XC2在60～70 ℃時(shí)相對(duì)酶活迅速下降。由此看出，誘變后菌株的耐熱性提高。

圖7 不同溫度對(duì)酶活的影響Fig.7 Effects of different temperatures on enzyme activity

由于酶的結(jié)構(gòu)受溫度影響較大，因此其熱穩(wěn)定性對(duì)于酶制劑的保存和使用具有重要意義。由圖8可知，40 ℃保存90 min 后FS-1（圖8a）與FS-103（圖8b）酶活為85%、90%，誘變型高于野生型；50～60 ℃野生型酶活下降速度快于誘變型；70 ℃保存90 min 后的FS-103 酶活仍以25%的高于野生型的20%。由此說(shuō)明誘變菌株不僅耐熱性優(yōu)于野生型，且熱穩(wěn)定性高于野生型。

圖8 不同溫度對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響Fig.8 Effects of different temperatures on the stability of enzyme activity

2.4.2 最適反應(yīng)pH 及酸堿耐受性分析 pH 不僅會(huì)影響酶分子構(gòu)象的穩(wěn)定、酶分子極性基團(tuán)的解離狀態(tài)同時(shí)也會(huì)影響到反應(yīng)底物的解離或使反應(yīng)底物不能與酶結(jié)合，最終影響酶的催化效果。由圖9 可知，野生型FS-1 與誘變菌株FS-103 酶活先是隨著pH 升高而逐步提升，在pH 為5.5 時(shí)酶活達(dá)到最高，然后開(kāi)始下降。誘變并未改變最適產(chǎn)酶pH，該酶在中性條件下能夠發(fā)揮較高的酶活力。

圖9 不同pH 對(duì)酶活的影響Fig.9 Effects of different pH on enzyme activity

由于酶的結(jié)構(gòu)受pH 影響較大，因此其酸堿穩(wěn)定性對(duì)于酶制劑的使用具有重要意義。由圖10 可知，野生型FS-1（圖10a）與誘變菌株FS-103（圖10b）在pH 大于4.0，4 ℃條件下保存90 min 后二者酶活力均保持在65%以上，而在pH 小于4.0 下酶活隨保存時(shí)間越長(zhǎng)而降低。這與杜東曉等篩選到的巨大芽孢桿菌（）XT 的酸堿耐受性不同，XT 在中性和弱堿性條件下穩(wěn)定性較好，而在工業(yè)應(yīng)用中，耐酸性則是更為重要的條件，研究表明菌株FS-103 所產(chǎn)淀粉酶可以在中性和弱酸性條件下應(yīng)用，更利于工業(yè)的大規(guī)模開(kāi)展。

圖10 不同pH 對(duì)酶活穩(wěn)定性的影響Fig.10 Effects of different pH on the stability of enzyme activity

2.4.3 金屬離子對(duì)酶活的影響 不同金屬離子對(duì)酶活力主要有激活和抑制作用的影響。由表2 可知誘變菌株FS-103 相對(duì)于野生型FS-1 對(duì)金屬Ca、Na、Mg依賴性降低，但Mn對(duì)酶活的抑制作用較為顯著，這與淀粉酶的晶體結(jié)構(gòu)研究結(jié)論具有共同之處。

表2 金屬離子對(duì)酶活的影響Table 2 Effects of metal ions on enzyme activity

2.4.4 紫外光對(duì)酶活的影響 紫外線（ultraviolet，UV）可穿透細(xì)菌細(xì)胞直接作用于DNA，使得堿基無(wú)法正常配對(duì)，造成基因突變從而影響酶活。由圖11 可知，野生型FS-1 與誘變菌株FS-103 在照射的前3 h對(duì)酶活影響并不明顯，但照射達(dá)6 h 后，F(xiàn)S-103 相對(duì)酶活剩余50%，而FS-1 相對(duì)酶活剩余21%，這說(shuō)明長(zhǎng)時(shí)間的紫外光照射，對(duì)淀粉酶的結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了一定的破壞作用，從而影響了酶活高低。通過(guò)對(duì)比FS-1 與FS-103 的紫外光照射結(jié)果，發(fā)現(xiàn)紫外照射較誘變型而言反而提高了菌株產(chǎn)淀粉酶的活力。

圖11 紫外光對(duì)酶活的影響Fig.11 Effects of UV light on enzyme activity

3 結(jié)論

本文通過(guò)ARTP 技術(shù)對(duì)來(lái)自云南馬龍C3F-2016煙葉表面原位篩選到的產(chǎn)淀粉酶菌株FS-1 進(jìn)行誘變，獲得一株酶活穩(wěn)定提高20%以上的誘變株FS-103。相比野生型菌株，F(xiàn)S-103 在搖瓶培養(yǎng)36 h 條件下酶活達(dá)到最高值9050 U/mL，其酶活提高了90%；通過(guò)對(duì)誘變前后菌株酶學(xué)特性展開(kāi)研究發(fā)現(xiàn)，誘變后菌株最適反應(yīng)溫度提升10 ℃，耐熱且更為穩(wěn)定，最適pH 與酸堿耐受性變化不大，所產(chǎn)淀粉酶偏中性與弱酸性酶，較能滿足工業(yè)生產(chǎn)中對(duì)使用耐酸性中溫淀粉酶越來(lái)越大的需求，對(duì)金屬Ca、Na、Mg的依賴性降低，淀粉酶酶活力受紫外線影響降低。并通過(guò)傳代試驗(yàn)驗(yàn)證該誘變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性，一方面為工業(yè)化生產(chǎn)淀粉酶提供了優(yōu)良菌株和育種的科學(xué)依據(jù)，為工業(yè)中選育其他產(chǎn)淀粉酶菌株提供參考方法；另一方面為研究產(chǎn)酶菌株的性能改良提供了一條新途徑，為芽孢桿菌在食品加工、生物轉(zhuǎn)化等工業(yè)領(lǐng)域的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。