汪祺，楊建波a，王瑩，李妍怡，2，文海若*，馬雙成*

1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；

2.北京中醫(yī)藥大學，北京 100029

何首烏是蓼科植物何首烏Polygonum multijiorumThunb.的干燥塊根。近年來，隨著何首烏及其制劑的廣泛應用，其臨床不良反應報道逐漸增多，其中以何首烏致肝損傷問題較為常見[1-2]。統(tǒng)計發(fā)現，何首烏致肝損傷的臨床表現多以膽汁淤積及高膽紅素為主[3-4]。由于膽紅素和膽汁酸等的代謝轉運均與肝臟上的攝取和外排轉運體相關，因此推測這些轉運體功能出現障礙可能是何首烏致肝毒性的機制。

研究表明，有機陰離子轉運多肽（OATPs）可介導藥物及內源性物質如膽紅素和膽汁酸的跨膜轉運，其中OATP1a1和OATP1b2在肝臟中高表達，位于肝細胞的基底側，對膽紅素和膽汁酸的攝取起著至關重要的作用[5]。而多藥耐藥相關蛋白2（MRP2）和MRP3 在體內主要負責對膽酸鹽的排泄，同時介導膽紅素及其葡萄糖醛酸結合物排入膽汁，兩者高表達于肝臟、腸及腎臟組織[6]。研究表明，MRP2、MRP3 蛋白功能受到影響時，肝臟表現出不同程度的膽汁酸或膽紅素淤積，繼而產生毒性反應[7]。此外，外排轉運體如P-糖蛋白（P-gp）和乳腺癌耐藥蛋白（BCRP）也在膽紅素及膽汁酸代謝循環(huán)中起著重要的作用。膽汁酸也可經Na+-牛磺膽酸共轉運多肽（NTCP）攝取進入肝細胞，再由肝細胞膽管側的膽鹽外排泵（BSEP）外排至膽汁[8-10]。由此可見，上述轉運體被抑制可導致膽紅素、膽汁酸代謝異常，從而產生肝毒性[11-12]。

因此，本研究以何首烏醇提物（PME）和何首烏水提物（PMW）為研究對象，考察大鼠長期灌胃PMW 和PME 后的毒性表現，同時測定給藥后膽汁酸、膽紅素代謝相關轉運體（OATP1a1、OATP1b2、MRP2、MRP3、BSEP、NTCP、BCRP、P-gp）的表達變化，從而初探何首烏致肝損傷的可能機制，為何首烏的臨床安全用藥提供依據。

1 材料

1.1 實驗動物

無特定病原體（SPF）級Sprague-Dawley（SD）雄性大鼠40 只，體質量（200±20）g，購于斯貝福（北京）實驗動物科技有限公司，實驗動物生產許可證號：SCXK-2011-0004。標準動物房中飼養(yǎng)，室溫22～24 ℃，相對濕度55%～60%，光照12 h 明暗交替，以SPF 級標準飼料喂養(yǎng)。動物實驗由中國醫(yī)學科學院藥物研究所倫理委員會審批，審批號為00003037。

1.2 儀器

Multiskan MK3 型酶標儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）；HH.S4型恒溫孵育器（上海浦東榮豐科學儀器有限公司）；DKZ-450B 型電熱恒溫振蕩水槽（上海森信實驗儀器有限公司）；TU-1901 型紫外-可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；TGL20M 型高速冷凍離心機（長沙湘智離心機儀器有限公司）；VORTEX GENIVS 3 型漩渦混勻儀（美國Scientific Industries 公司）；iQ5 型聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Bio-Rad公司）。

1.3 試藥

何首烏藥材（北京本草方源藥業(yè)有限公司，批號：20160414）；異硫氰酸1-萘酯（ANIT，瑪雅試劑有限公司，批號：MAYA-CR-5311）；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試劑盒（批號：20170413）、天冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒（批號：20170417）、總膽汁酸（TBA）試劑盒（批號：20161025）、堿性磷酸酶（ALP）試劑盒（批號：20170414）、總膽紅素（TBIL）試劑盒（批號：20170421）均購于南京建成生物工程研究所；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，美國Sigma 公司，純度：99.0%）；烏拉坦（純度：99.0%）、蘇木素（純度：99.0%）均購于德國Merck公司；其他試劑均為分析純。

2 方法

2.1 溶液的制備

2.1.1何首烏提取物的制備 取何首烏藥材5 kg，用10 倍量70%乙醇加熱回流提取2 次，提取時間分別為2.0、1.5 h，合并提取液，濃縮、干燥，得PWE 粉末，得率為20%。取何首烏藥材5 kg，用10倍量蒸餾水加熱回流提取2 次，提取時間分別為2.0、1.5 h，合并提取液，濃縮、干燥，得PMW 粉末，得率為25%。精密稱取PMW 和PWE 適量，加0.5%的CMC-Na溶液混懸并定容，制成質量濃度為0.6 g·mL-1的PME 混懸液和0.75 g·mL-1的PMW 混懸液（相當于何首烏生藥質量濃度為3 g·mL-1），置于4 ℃，備用。

2.1.2ANIT 儲備液的配制 精密稱取ANIT 適量，加花生油溶解并定容，制成質量濃度為20 mg·mL-1的ANIT儲備液，置于4 ℃，備用。

2.2 實驗分組及給藥

將SD 大鼠隨機分為4 組，分別為PMW 組（灌胃給予PMW 15 g·kg-1，20 mL·kg-1，相當于60 g·kg-1生藥量，約為臨床最大量的110倍）、PME組（灌胃給予PME 12 g·kg-1，20 mL·kg-1，相當于60 g·kg-1生藥量，約為臨床最大量的110倍）、對照組（灌胃給予同體積0.5%的CMC-Na 溶液）及陽性對照ANIT 組（灌胃給予同體積0.5%CMC-Na溶液，第40天灌胃給予ANIT 儲備液100 mg·kg-1，5 mL·kg-1）。每組10只，共40只，連續(xù)給藥42 d。期間大鼠飲食自由，并觀察大鼠的行為活動、外觀體征、尿液和糞便形態(tài)等。

2.3 生物樣品收集

給藥結束后，大鼠禁食24 h，分別腹腔注射25%烏拉坦麻醉，由腹主動脈取血，并置于離心管中，待有少量血清析出時，以3000 r·min-1離心10 min（離心半徑為8 cm），取血清存于-20 ℃，待測。并立即處死大鼠，取肝臟，切成2 mm×2 mm 的塊狀，置于10%中性甲醛固定液中固定72 h。

2.4 生物樣品處理

2.4.1血清生化指標的測定 取各組大鼠血清樣品，根據試劑盒說明書進行操作，采用Multiskan MK3 型酶標儀測定血清生化指標TBIL 和TBA；采用TU-1901 型紫外-可見分光光度計測定血清生化指標AST、ALT 和ALP，并將所測定的結果與對照組進行比較分析。

2.4.2病理檢測 大鼠肝臟分離后使用10%中性甲醛固定組織標本。固定后的組織經過修塊取材后采用乙醇逐級脫水，再由石蠟包埋，采用滑動切片機切片（厚約3 μm）。最終標本經蘇木素-伊紅（HE）染色后在光鏡下進行組織病理學檢查[13]。

2.5 轉運體mRAN表達的檢測

精密稱取大鼠肝臟組織100 mg，剪碎，經RNA提取，RNA 濃度、純度及完整性的測定，反轉錄，PCR 擴增等過程。用PCR 儀自帶軟件進行熒光定量分析，得出循環(huán)數閾值（Ct），待測樣本目的基因表達數的計算方法用2-ΔΔCt法計算目標基因表達的相對水平[14]。OATP1a1、OATP1b2、MRP2、MRP3、BSEP、P-gp、NTCP mRNA 的引物序列見表1。通過實時熒光定量PCR（qRT-PCR）評估相對基因表達，并使用iQ5光學軟件標準化為GAPDH水平。

表1 qRT-PCR引物序列

2.6 數據處理

實驗數據均采用SAS 9.4統(tǒng)計軟件處理，統(tǒng)計檢驗采用單因素方差分析，數據以（）表示，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 大鼠體征變化

與對照組大鼠比較，ANIT組大鼠呈現明顯的膽汁淤積樣癥狀，毛發(fā)明顯變黃，四肢、耳和尾部等毛發(fā)較少的地方可見明顯變黃，與文獻報道一致[15]。與對照組大鼠比較，PMW 和PME 組大鼠毛發(fā)變黃而粗糙，且PME 組大鼠四肢、耳和尾部等毛發(fā)較少的地方可見明顯變黃，呈現出黃疸癥狀，但癥狀輕于ANIT組。此外，PMW 和PME組大鼠尿液均呈黃紅色，糞便為稀便。

3.2 大鼠灌胃何首烏后血清生化指標的變化

各組大鼠血清生化指標ALT、AST、TBA、ALP 和TBIL 水平見表2。與對照組比較，ANIT 組大鼠的5 項血清生化指標水平均顯著升高（P＜0.01），說明該檢測方法具有可靠性；PMW 組大鼠血清中AST 水平顯著降低（P＜0.05），ALT、ALP水平顯著升高（P＜0.05），TBIL、TBA 水平差異無統(tǒng)計學意義，說明大鼠已經出現肝細胞損傷，但TBIL、TBA水平仍未發(fā)生明顯變化；PME組大鼠血清中AST 水平顯著降低（P＜0.05），ALT、ALP、TBA 水平顯著性升高（P＜0.01），TBIL 水平差異無統(tǒng)計學意義，說明大鼠肝細胞損傷出現的同時已經表現出膽汁酸代謝異常，提示有發(fā)生膽汁淤積的趨勢。

表2 PMW和PME對大鼠血清生化指標的影響（, n=10）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 大鼠肝臟組織的病理變化

各組大鼠肝臟染色結果見圖1。與對照組比較，PME 組和PMW 組大鼠肝臟均可見膽管增生及炎性細胞浸潤，提示2 組大鼠經42 d 誘導后均存在不同程度的肝損傷。其中PME 組大鼠灶性壞死及炎性細胞浸潤發(fā)生率分別為5/10 和6/10，均高于PMW 組（分別為2/10 和3/10），提示PME 導致的肝臟病變較重。

圖1 PMW和PME對大鼠肝臟組織病理學的影響（HE）

3.4 大鼠肝臟轉運體mRNA表達變化

大鼠肝臟轉運體OATP1a1、OATP1b2、MRP2、MRP3、BSEP、NTCP、BCRP、P-gp 的mRNA 表達結果見圖2。結果顯示，與對照組比較，PME 組大鼠肝臟組織中MRP2、BSEP、NTCP、BCRP、P-gp mRNA 表達水平均顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），OATP1b2、MRP3 mRNA 表達水平升高但差異無統(tǒng)計學意義，OATP1a1 mRNA 表達水平顯著升高（P＜0.05）。PMW組大鼠肝臟組織中OATP1a1、OATP1b2、BSEP、NTCP、P-gp mRNA 水平顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），MRP2、BCRP mRNA 水平均顯著降低（P＜0.05），MRP3 mRNA水平差異無統(tǒng)計學意義。

圖2 PMW和PME對大鼠大鼠肝臟內轉運體mRNA表達的影響（, n=10）

由結果可知PMW 和PME 給藥組均可顯著降低外排轉運體MRP2、BCRP mRNA表達水平，升高攝取轉運體OATP1a1、OATP1b2 mRNA 表達水平。對于其他轉運體的影響，2 個給藥組存在差異，PME可顯著降低外排轉運體BSEP、P-gp mRNA 的表達水平，下調攝取轉運體NTCP的表達。而PMW 可顯著升高NTCP、BSEP、P-gp，對MRP3 影響不大。與PMW 組比較，PME 給藥組表現出更明顯的大鼠肝損傷癥狀，并伴有膽紅素代謝異常及膽汁淤積，可能與促進膽紅素、膽汁酸攝取轉運而抑制其代謝物外排有關。

4 結論與討論

ANIT是用于制備膽汁淤積模型的典型藥物，可誘導肝損傷，致使肝細胞變性、壞死，同時還導致膽管上皮細胞腫脹壞死，造成膽管阻塞，產生顯著的高膽紅素血癥和膽汁淤積，最終導致一系列血清生化指標發(fā)生明顯變化[15]。由于其致肝損傷作用顯著，因此本研究選取其作為血清生化的陽性對照，于PME 和PMW 組給藥第40 天開始給藥，持續(xù)到第42 天。ALT 與AST 主要分布在肝臟的肝細胞內，肝細胞壞死時ALT 和AST 水平升高，其升高的程度與肝細胞受損的程度相一致，因此是目前最常用的肝功能指標[16]。ALP 是一種磷酸單酯酶，正常情況下，體內ALP 來源于肝臟和骨組織，主要作為阻塞性黃疸、肝癌、膽汁淤積性肝炎等的檢查指標，阻塞性黃疸、原發(fā)性肝癌、繼發(fā)性肝癌、膽汁淤積性肝炎都會使ALP 水平偏高[17]。因而臨床上常用這3 個指標作為判斷肝損傷及肝損傷類型的標準。當患者出現膽汁淤積時，不僅上述3 個血清生化指標會發(fā)生變化，TBA 和TBIL 也會發(fā)生明顯的變化。TBA 是結合型膽汁酸，健康人的周圍血液中含量極微，當肝細胞損害或肝內、外阻塞時，TBA 就會升高，是一項比較敏感和有效的肝功能試驗之一[18]。TBIL 是直接膽紅素和間接膽紅素的總和，TBIL 的升高即是黃疸，主要用來診斷肝臟疾病或膽道異常[19-20]。

本研究發(fā)現，PMW 和PME 給藥后，PMW 組大鼠血清中僅ALT 和ALP 水平顯著升高（P＜0.05），而PME組大鼠血清中ALT、TBA和ALP水平均顯著升高（P＜0.01），說明何首烏的2種提取物均對大鼠產生了一定的肝損傷作用，并且PME 組大鼠可能發(fā)生了膽汁淤積。有文獻報道，王濤等[21]證明高劑量PMW 可導致大鼠ALP 和TBA 水平明顯升高，同時可見肝細胞小灶性壞死，認為在不誘發(fā)嚴重肝損傷的前提下PMW 即可引起大鼠膽汁淤積，這與本研究結論相一致。此外，LPS 誘導后的大鼠給予PME后TBIL水平明顯降低，ALP水平明顯升高[22]。TBIL作為膽紅素異常的判斷標準，在本研究中并未觀察到明顯變化，推測這可能與本研究中正常大鼠給藥后機體的代償調節(jié)作用有關，使得這一指標的變化在短時期內未能顯現出來。另有研究人員發(fā)現，PME 給藥可使大鼠出現輕微肝細胞變性，但經過LPS 誘導后的大鼠則表現為肝臟嚴重局灶壞死[22]。本研究病理結果顯示，2 種何首烏提取物都會不同程度地引發(fā)肝損傷，并且PME 組表現得更為嚴重，這與文獻報道相符。

本研究中轉運體mRNA 表達結果顯示，PME 對肝臟外排型轉運體（MRP2、BSEP、BCRP 和P-gp）mRNA 的表達水平均具有下調作用，對攝取型轉運體（OATP1a1 和OATP1b2）及肝血竇側的外排型轉運體（MRP3）mRNA 的表達水平具有上調作用（圖3）。因此推測，PME 長期給藥后可能會導致膽紅素和膽汁酸等內源性小分子在肝內發(fā)生蓄積，引起肝損傷。PMW 對肝臟外排型轉運體的基因表達既有上調也有下調作用，對攝取型轉運體及肝血竇側的外排型轉運體的基因表達具有上調或不變的作用（圖3），這與王濤等[23]的研究結果相一致，雖然PMW 對肝臟上的轉運體有不同程度的調控作用，但其抑制或激活作用無明顯的傾向性。

圖3 PME和PMW對轉運體的影響

因此，經過長期誘導后，2 種提取物均可導致大鼠發(fā)生肝損傷，其作用機制與影響膽紅素和膽汁酸相關轉運體相關，PME 和PMW 引發(fā)肝損傷程度存在差異，原因可能是對具體轉運蛋白的作用不同所致。本研究初步推測了PME 和PMW 引發(fā)肝損傷的作用機制，為臨床安全用藥提供了數據支撐。