薛靜，瞿晶田，韓真真，孫瑜，孫精通

（1．天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥學(xué)部，天津 300381；2．天津中醫(yī)藥大學(xué)附屬?？滇t(yī)院藥劑科，天津 300381）

室性早搏（VPB），又稱為室性期前收縮，屬于一種比較常見的心律失常。目前西醫(yī)對于VPB的治療，多采用鉀通道阻滯劑、鈉通道阻滯劑、β受體拮抗劑、鈣通道阻滯劑等4類常用的抗心律失常藥物，還可采取射頻消融手術(shù)治療[1]。中醫(yī)將VPB歸屬為“心悸”的范疇，認(rèn)為病位主要在心，總結(jié)的病機(jī)特點(diǎn)主要為本虛標(biāo)實(shí)。通過對古代醫(yī)籍文獻(xiàn)的研究和臨床實(shí)踐，不同醫(yī)家提出了許多治療方法，比如從心氣不足，心陽不振論治，也可從脾血不統(tǒng)，心陰不足之心脾論治，也有從痰濁水飲，血絡(luò)瘀阻論治等等[2-6]。VPB的中醫(yī)證型有多種，加之中醫(yī)注重個(gè)體化治療，這就導(dǎo)致臨床用藥繁雜多樣。因此，利用數(shù)據(jù)分析技術(shù)對中醫(yī)臨床治療VPB的用藥規(guī)律的提取整理十分必要，通過數(shù)據(jù)挖掘出有效的藥物配伍，以期更好的服務(wù)指導(dǎo)臨床實(shí)踐。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來源 進(jìn)入中國知網(wǎng)（CNKI）的高級檢索界面，以主題關(guān)鍵詞為“室性早搏＋中醫(yī)＋臨床”，全文關(guān)鍵詞為“中藥”并且篇名中不含“進(jìn)展”。時(shí)間選擇為1979年1月1日—2020年3月1日。共檢索到273篇文獻(xiàn)。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 納入臨床病例文獻(xiàn)，排除實(shí)驗(yàn)研究類，綜述類等文獻(xiàn)；納入病例中應(yīng)有明確診斷為“室性早搏”并有“心悸”等中醫(yī)病名表述；納入有具體中藥的組方，排除加減方和重復(fù)處方；納入文獻(xiàn)明確表明中藥的臨床效果較好，排除中藥為輔的臨床治療。

1.3 數(shù)據(jù)處理 參照中國藥典2015年版[7]和中藥學(xué)[8]標(biāo)準(zhǔn)，將數(shù)據(jù)庫中的110味中藥的名稱、功效、性味歸經(jīng)等規(guī)范化處理，對于中藥有別稱或簡稱的，進(jìn)行統(tǒng)一名稱，如“云苓”統(tǒng)稱為“茯苓”，“焦三仙”規(guī)范錄入“焦山楂，焦神曲，焦麥芽”。有些中藥炮制后性味歸經(jīng)有所改變，如“生甘草，炙甘草”則分別統(tǒng)計(jì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法 將上述所有中藥統(tǒng)一錄入Excel 2010，建立數(shù)據(jù)庫。對納入的所有中藥品種進(jìn)行分類排序分析，采用SPSSClementine12、SPSSS tatistics20數(shù)據(jù)處理軟件對中藥數(shù)據(jù)進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則、因子分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。

1.5 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析 使用BATMAN-TCM系統(tǒng)預(yù)測關(guān)鍵中藥所含化學(xué)成分，并獲取對應(yīng)靶點(diǎn)；把這些靶點(diǎn)與Genecard數(shù)據(jù)庫中檢索到的室性早搏相關(guān)靶點(diǎn)相映射并取交集，將其作為治療室性早搏的潛在作用靶點(diǎn)；將上述靶點(diǎn)上傳至DAVID 6．8數(shù)據(jù)庫進(jìn)行KEGG通路和GO生物過程富集分析，利用 Cytoscape 3．2．1 構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-通路等多層次網(wǎng)絡(luò)圖，分析預(yù)測關(guān)鍵藥物發(fā)揮藥理作用主要成分、靶點(diǎn)以及重要的信號通路。

2 結(jié)果及分析

2.1 單味中藥使用情況 最終從篩選的273篇文獻(xiàn)資料中，納入符合數(shù)據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)的文獻(xiàn)102篇，共102首中藥組方，含中藥110味，累積頻率965次，前20味中藥，累計(jì)頻次562次，占總頻率的53．20%。使用頻次最高的前3位中藥品種分別是炙甘草（49 次，48．04%）、酸棗仁（43次，42．16%）、丹參（42 次，41．18%）結(jié)果見表1。

表1 高頻中藥（頻次前20）統(tǒng)計(jì)分析Tab.1 Statistical analysis of high frequency traditional Chinese medicine（top 20 frequencies）

2.2 高頻中藥性味統(tǒng)計(jì) 參照《中國藥典》2015年版和《中藥學(xué)》標(biāo)準(zhǔn)分類，將20味高頻中藥的性味進(jìn)行規(guī)范的分類統(tǒng)計(jì)。高頻中藥的藥性統(tǒng)計(jì)最高者為溫（6次，30．00%）；五味統(tǒng)計(jì)最高者為甘（13次，43．33%）。結(jié)果見圖1。

圖1 高頻中藥性味統(tǒng)計(jì)分析Fig.1 Statistical analysis of high frequency Chinese medicine flavor

2.3 高頻中藥歸經(jīng)統(tǒng)計(jì) 依據(jù)《中國藥典》2015年版標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行性味歸經(jīng)的統(tǒng)計(jì)校對，累計(jì)統(tǒng)計(jì)頻率為64次。高頻中藥歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)最高者為心經(jīng)（14次，22．88%）結(jié)果見圖2。

圖2 高頻中藥歸經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析Fig.2 Statistical analysis of meridian attribution of high frequency traditional Chinese medicine

2.4 高頻中藥功效統(tǒng)計(jì) 以《中藥學(xué)》為標(biāo)準(zhǔn)，對高頻中藥的功效進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，共有9類：使用最多的為補(bǔ)虛藥（7次，35%），結(jié)果見圖3。

圖3 高頻中藥功效統(tǒng)計(jì)分析Fig.3 Statistical analysis of efficacy of high frequency traditional Chinese medicine

2.5 高頻中藥關(guān)聯(lián)規(guī)則分析 使用SPSSClementine 12數(shù)據(jù)挖掘軟件對所選擇的高頻中藥（頻次前20）進(jìn)行關(guān)聯(lián)規(guī)則分析，使用Apriori建模進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析不同的中藥之間關(guān)聯(lián)配伍關(guān)系[9-10]。將支持度設(shè)置為15%，置信度設(shè)置為80%，最大前項(xiàng)數(shù)設(shè)置為5，提升≥1等條件，挖掘高頻中藥中的潛在藥物組合，通過分析，共獲得核心藥物組合6組。具體結(jié)果見表2。高頻中藥之間的關(guān)聯(lián)性分析的網(wǎng)絡(luò)化展示見圖4。

表2 高頻中藥關(guān)聯(lián)規(guī)則統(tǒng)計(jì)分析Tab.2 Statistical analysis of association rules of high frequency traditional Chinese medicine

圖4 高頻中藥關(guān)聯(lián)規(guī)則的網(wǎng)絡(luò)化展示Fig.4 Network display of high frequency association rules of traditional Chinese medicine

數(shù)據(jù)里中藥之間關(guān)聯(lián)規(guī)則的支持度和置信度越高，說明這兩種或幾種藥物的聯(lián)系越大越緊密，這種藥物聯(lián)系的核心組合，能直接反映出中藥治療VPB的核心對藥，這對分析方劑配伍規(guī)律是十分有幫助的[11-12]。筆者提取了支持度大于15%的6組組合藥物，從結(jié)果可以看出，1組和4組提取出的核心藥對配伍是“當(dāng)歸-黃芪-酸棗仁-炙甘草”，當(dāng)歸甘溫質(zhì)潤，長于補(bǔ)血，為補(bǔ)血圣藥，黃芪甘溫，為補(bǔ)氣要藥，兩者合用，氣血雙補(bǔ)，酸棗仁養(yǎng)心陰，益肝血而安神，配合補(bǔ)益心脾的炙甘草，4味藥組成藥對，主要針對氣血虧虛之驚悸不安有很好的治療作用；2組和3組提取出的核心藥對是“麥冬-生地黃”和“生地黃-炙甘草”，生地黃清熱滋陰涼血 有清有補(bǔ)，治陰虛血熱之心神煩亂，麥冬養(yǎng)陰生津，潤肺清心，炙甘草藥性微溫，增強(qiáng)了補(bǔ)益心脾的作用，“生地黃-麥冬-炙甘草”3藥形成藥對滋心陰，清心火，益心脾，這也是“炙甘草湯”中的核心藥物；5組提取出的是核心藥對“生龍骨-生牡蠣”，龍骨牡蠣重鎮(zhèn)安神，平肝鎮(zhèn)驚，是治療心神不寧等疾病的常用藥對；6組提取出的核心藥對為“酸棗仁-遠(yuǎn)志-炙甘草”酸棗仁入心肝經(jīng)，能養(yǎng)心陰，益肝血而安神，遠(yuǎn)志性善宣泄通達(dá)，既能開心氣而寧心安神，又能通腎氣而強(qiáng)志不忘，為交通心腎，安神定志之佳品，加之補(bǔ)益心脾，調(diào)和藥性的炙甘草。3藥組成藥對，主要針對心悸怔忡，失眠多夢等癥狀而治療。

2.6 高頻中藥因子分析 藥物之間的關(guān)聯(lián)規(guī)則分析解釋的主要是藥物之間的聯(lián)系疏密程度歸類與展示，一定程度上能代表用藥組合的使用規(guī)律，但是并不能展示整體數(shù)據(jù)中貢獻(xiàn)最大的藥物組成[13-14]。因此，筆者利用SPSS Statistics 20統(tǒng)計(jì)軟件的因子分析工具，通過提取共性因子，將具有相同本質(zhì)的變量歸入一個(gè)因子，并對各變量之間的關(guān)系進(jìn)行分類，找出貢獻(xiàn)率最大的因子。在統(tǒng)計(jì)前完成KMO和Bartlett的球形度檢驗(yàn)，KMO 值為 0．584＞0．5，Bartlett的球形度檢驗(yàn)的近似卡方值為532．548，顯著性檢驗(yàn) 0．000，P＜0．001 符合要求，可以進(jìn)行因子分析。通過旋轉(zhuǎn)成分矩陣分析，參考碎石圖，提取了貢獻(xiàn)率排名前6的因子，累積方差貢獻(xiàn)率58．816%，對照6個(gè)因子中，貢獻(xiàn)率較大的中藥成分進(jìn)行提取分析。高頻中藥旋轉(zhuǎn)成分矩陣中貢獻(xiàn)率較大的中藥組成及因子方差百分比見表3，高頻中藥旋轉(zhuǎn)空間成分分析見圖5。

表3 因子中高度相關(guān)的中藥組成Tab.3 Highly correlated traditional Chinese medicine composition among factors

圖5 高頻中藥旋轉(zhuǎn)空間成分圖Fig.5 Rotational spatial component map of high frequency traditional Chinese medicine

通過成分旋轉(zhuǎn)矩陣，發(fā)現(xiàn)因子1高度相關(guān)的中藥組成為“酸棗仁、當(dāng)歸、甘松、黃芪”，該組成包含了關(guān)聯(lián)規(guī)則分析提取的編號1的中藥組合的全部品種，并加入了甘松，甘松味辛、甘，性溫，具有理氣止痛、開郁醒脾的作用。因子方差百分比可知，因子1貢獻(xiàn)率最高，可知該藥物組分為整體方劑數(shù)據(jù)中采用的最廣泛的治療思路，總結(jié)為氣血雙補(bǔ)，兼養(yǎng)心陰，益肝血而安神，同時(shí)加入理氣醒脾之甘松，使補(bǔ)而不滯；因子2高度相關(guān)的中藥組成為“炙甘草、桂枝、生地黃”，桂枝能溫經(jīng)通陽，化氣行水，炙甘草溫陽益氣養(yǎng)心，加入了清熱滋陰涼血的生地黃，從因子2的用藥組成來看，總結(jié)治療思路為溫經(jīng)通陽、益氣的同時(shí)，滋陰涼血也同樣重要；因子3高度相關(guān)的中藥組成為“生龍骨、生牡蠣”，龍骨牡蠣重鎮(zhèn)安神，平肝鎮(zhèn)驚，是治療心神不寧等疾病的常用藥對，其治療思路為鎮(zhèn)驚安神；因子4高度相關(guān)的中藥組成為“麥冬、五味子”，麥冬養(yǎng)陰生津，潤肺清心，五味子益氣生津，補(bǔ)腎寧心，該因子治療思路著重于滋陰，補(bǔ)腎寧心；因子5高度相關(guān)的中藥組成為“川芎、白芍”，川芎辛溫，功能活血行氣，可補(bǔ)肝之氣，為血中之氣藥，可疏通臟腑經(jīng)絡(luò)之氣，調(diào)節(jié)氣血運(yùn)行，白芍養(yǎng)肝血，斂肝陰，養(yǎng)肝之本，因此該因子治療思路主要為補(bǔ)肝氣，養(yǎng)肝血，疏肝氣，肝為心之母，此為子病求母之思路；因子6高度相關(guān)的中藥組成為“人參”，人參，甘，微溫，有健脾養(yǎng)心，安神益智，另有大補(bǔ)元?dú)庵?。綜合6個(gè)因子的高度相關(guān)中藥組成分析，治療VPB的最普遍的中醫(yī)思路主要為氣血雙補(bǔ)，兼養(yǎng)心陰，同時(shí)注重溫經(jīng)通陽益氣，適當(dāng)佐以補(bǔ)肝疏肝活血之品，同時(shí)兼入理氣醒脾之藥，使之補(bǔ)而不滯。

2.7 關(guān)鍵藥物酸棗仁靶點(diǎn)預(yù)測和室性早搏相關(guān)靶點(diǎn)檢索 數(shù)據(jù)挖掘顯示，使用頻次最高的前3味中藥為“炙甘草、酸棗仁、丹參”，關(guān)聯(lián)分析中支持度最高的藥物為“當(dāng)歸、黃芪、酸棗仁”，因子分析中貢獻(xiàn)度最高的藥物為“酸棗仁、當(dāng)歸、甘松、黃芪”，通過以上數(shù)據(jù)綜合分析，提取出關(guān)鍵藥物“酸棗仁”進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析，在BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫（http：//bionet．ncpsb．org/batman-tcm/）中以“suan zao ren ”為關(guān)鍵詞，“Score cutoff”設(shè)置為 30，“Ad-justed P-value”設(shè)置為0．05，檢索出酸棗仁主要化合物21種，分別編號S1-S21，包括BetulinicAcid，Acetyljujuboside B，Sylvestrene，Jujuboside A1，Betulin 等，同時(shí)獲取這些化合物對應(yīng)靶點(diǎn)131個(gè)[15]。以“ventricular premature beats”為關(guān)鍵詞，在Genecard數(shù)據(jù)庫（http：//www．genecards．org/）中檢索室性早搏的相關(guān)靶點(diǎn)，與BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫獲得的成分預(yù)測靶點(diǎn)相對比并取交集，共獲得酸棗仁治療室性早搏的共同靶點(diǎn)59個(gè)[16]。

2.8 GO功能富集和KEGG信號通路分析 采用DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david．ncifcrf．gov/）進(jìn)行基因本體（GO）的生物過程富集分析，以 P＜0．01 對相關(guān)靶基因進(jìn)行篩選，納入前20個(gè)最重要的條目，其中包擴(kuò)11個(gè)與生物過程（GOTERM_BP_DIRECT）相關(guān)條目，主要涉及腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號通路，正性血管收縮調(diào)節(jié)，心臟傳導(dǎo)調(diào)節(jié)心率等方面；4個(gè)與細(xì)胞組分（GOTERM_CC_DIRECT）相關(guān)條目，主要涉及質(zhì)膜，控鉀通道復(fù)合體等；4個(gè)與分子功能（GOTERM_MF_DIRECT）相關(guān)條目，主要涉及降低鉀通道活性，類固醇物質(zhì)結(jié)合等條目。將數(shù)據(jù)通過 http：//www．bioinformatics．com．cn/平臺進(jìn)行可視化處理，結(jié)果見圖6。圖中圓點(diǎn)越大，表明通路富集到的基因數(shù)目越多，圓點(diǎn)的顏色越紅，表明P值越小。

圖6 GO功能富集分析Fig.6 GO function enrichment analysis

通過 DAVID 數(shù)據(jù)庫（https：//david．ncifcrf．gov/）進(jìn)行京都基因和基因組百科全書（KEGG）的信號通路的富集分析，以P＜0．01對相關(guān)靶基因通路進(jìn)行篩選，得到11條重要通路，包括神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路，鈣信號通路，cGMP-PKG信號通路，心肌細(xì)胞腎上腺素能信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等。將數(shù)據(jù)通過http：//www．bioinformatics．com．cn/平臺對通路富集分析的結(jié)果進(jìn)行可視化處理[17]。結(jié)果見圖7，圖中圓點(diǎn)越大，表明通路富集到的基因數(shù)目越多，圓點(diǎn)的顏色越紅，表明P值越小。

圖7 KEGG富集分析Fig.7 Enrichment analysis of KEGG

2.9 “成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路”可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析 通過Cytoscape3．2．1軟件，將“酸棗仁所含活性成分（S1-S21）”“酸棗仁治療室性早搏的59個(gè)共同靶點(diǎn)”“KEGG富集分析的11條關(guān)鍵通路（P1-P11）”進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，構(gòu)建成分-靶點(diǎn)-關(guān)鍵通路結(jié)合的多層次網(wǎng)絡(luò)圖。采用Cytoscape中的NetworkAnalyzer功能對所有的網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)拓?fù)鋵W(xué)特征進(jìn)行分析，分析的特征值包括自由度、介數(shù)中心性及平均最短路徑長度等數(shù)據(jù)。以度值作為主要的評價(jià)指標(biāo)[18]，度值越大，該節(jié)點(diǎn)的面積就越大，結(jié)果見圖8。

圖8 成分-靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)（圓形-活性成分，菱形-靶點(diǎn)，正方形-通路）Fig.8 Network of traditional Chinese medicine-components-targets-pathways（circular-active component，diamond-target，square-pathway）

從網(wǎng)絡(luò)圖中發(fā)現(xiàn)，酸棗仁中對于治療室性早搏重要的活性成分為Betulin、BetulinicAcid、Dauricine等，重要的基因靶點(diǎn)包括ATPA1，PTGS2，PTGS1，TYR，CYP3A4等。重要的信號通路為：神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路，鈣信號通路，cGMP-PKG信號通路，cAMP信號通路。表明酸棗仁可能主要通過這些通路來發(fā)揮治療室性早搏的作用。

3 討論

VPB可見于伴有心臟器質(zhì)性病變的患者，也可見于正常人[19]。中醫(yī)藥治療VPB時(shí)注重辨證論治，從人體整體角度進(jìn)行調(diào)節(jié)，探索了多種途徑對該病進(jìn)行治療。VPB中醫(yī)歸于心悸的范疇，通過分析，其病機(jī)多錯(cuò)綜復(fù)雜，歷史上各個(gè)醫(yī)家對VPB的認(rèn)識也各有不同。通過對中醫(yī)治療VPB的文獻(xiàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，初步篩選探討了其臨床用藥規(guī)律，以進(jìn)一步挖掘潛在的治療VPB有效的中藥、藥對或組方。結(jié)果表明，中醫(yī)對于VPB的臨床治療以補(bǔ)虛藥、安神藥、清熱藥較為常用，多選擇藥性偏溫、平、微寒，藥味偏甘，歸心、肝、脾經(jīng)的中藥。臨床用藥時(shí)可著重參考當(dāng)歸、甘松、黃芪、酸棗仁、炙甘草、桂枝、生地黃、生龍骨、生牡蠣、麥冬、五味子、川芎、白芍、人參等中藥進(jìn)行配伍使用。通過數(shù)據(jù)挖掘分析，提取了關(guān)鍵中藥“酸棗仁”并通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析酸棗仁治療VPB的潛在作用機(jī)制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酸棗仁治療VPB涉及多通路、多靶點(diǎn)。涉及到的重要通路有神經(jīng)活性配體-受體相互作用通路，鈣信號通路，cGMP-PKG信號通路cAMP信號通路。重要的基因靶點(diǎn)包括 ATPA1，PTGS2，PTGS1，TYR，CYP3A4 等。已知的研究證實(shí)，早搏大鼠的L型鈣通道（LCCs）mRNA水平和Ca2+-ATP酶基因的表達(dá)水平下降，說明早搏的發(fā)生與鈣信號通路和Ca2+-ATP酶的表達(dá)關(guān)系密切[20]。此外，有研究顯示酸棗仁皂苷A具有明顯的鈣通道阻滯作用。鄧偉等[21]結(jié)果顯示，酸棗仁皂苷A對L型鈣通道電流（Ica-L），有明顯影響，且呈現(xiàn)濃度依賴關(guān)系，通過抑制L型鈣通道，降低心率失常的發(fā)生，緩解心率失常等心血管系統(tǒng)類疾病。Coben等[22]研究發(fā)現(xiàn)，有些抗生素是強(qiáng)力CYP3A4、CYP2C9抑制劑，可對心律產(chǎn)生明顯的影響，這與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測的關(guān)鍵靶點(diǎn)也相吻合。

綜上所述，本研究采用數(shù)據(jù)挖掘結(jié)合網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的相關(guān)方法對中藥治療VPB的用藥規(guī)律及關(guān)鍵藥物酸棗仁治療VPB的潛在作用機(jī)制進(jìn)行了多角度的探析，預(yù)測的通路和靶點(diǎn)與已知文獻(xiàn)報(bào)道的酸棗仁治療VPB的作用基本吻合，體現(xiàn)了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)預(yù)測分析的準(zhǔn)確性，同時(shí)揭示了酸棗仁多成分、多靶點(diǎn)、多途徑作用的特點(diǎn)。由于數(shù)據(jù)庫的局限和信息收集的不完善以及化合物之間的相互作用的復(fù)雜性，故研究預(yù)測的結(jié)果具有一定的局限性，需要構(gòu)建復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。