崔芬，戎萍，王林

（天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院，天津 300381）

癲癇是由遺傳、代謝、結構、免疫等不同原因所導致的一種具有持久性的產(chǎn)生癲癇發(fā)作傾向為特征的慢性腦部疾病，臨床上主要以腦神經(jīng)元異常放電引起反復癇性發(fā)作為主要特征。癲癇是一種常見疾病，發(fā)病率為 0．4%～0．8%，其中約有 30%患有耐藥性癲癇（DRE）[1]。國際抗癲癇聯(lián)盟（ILAE）將DRE定義為：按標準化治療，應用兩種或兩種以上抗癲癇藥物（AEDs）治療（不論是單藥還是多藥），12個月內(nèi)仍有癲癇發(fā)作[2]。DRE主要由于其耐藥性發(fā)生機制涉及多種學說，其中多藥轉運蛋白學說認為藥物轉運體的過多表達與癲癇的耐藥機制密切相關，有研究認為多藥轉運蛋白P-gp參與了抗癲癇藥物的跨膜轉運。有學者提出DRE與生活質(zhì)量差和不明原因的猝死風險增加有關，也有學者提出DRE與自主神經(jīng)系統(tǒng)和時間生物學有關，自主生物反饋可作為DRE的潛在治療靶標。癲癇猝死（SUDEP）是癲癇死亡的重要原因，DRE患者SUDEP的發(fā)生率在不斷增加[3]。西醫(yī)治療主要包括藥物治療、手術治療、生酮飲食、干細胞治療。目前DRE的治療存在許多困難，針對這些困難，首先要了解其耐藥機制才能制定個體化方案。DRE屬中醫(yī)學“癲疾”“癇病”范疇，最早見于《黃帝內(nèi)經(jīng)》，中藥在治療癇病上具有獨特優(yōu)勢。諸多醫(yī)家認為癇病是由風、火、痰、瘀相互搏結上犯腦竅引起的神志疾病，病理性質(zhì)本虛標實，中藥治療上常見寒熱并用、攻補兼施、升降相因、散收結合等配伍[4]。

DRE是近年癲癇研究鄰域中治療的難點，而《幼幼集成》中記載抗癇藥“疏散外感，開通經(jīng)絡，庶后藥得以流通故耳”為中藥治療DRE提供思路。馬融教授[5]認為要根據(jù)患兒癥狀、體征、體質(zhì)綜合分析，不拘泥于鎮(zhèn)靜、息風等藥物，辨證論治，類似銀翹散、沙參麥冬湯也可治療DRE。藥理學研究表明銀翹散具有抗炎作用，炎癥反應與DRE多藥耐藥相關，從而推測銀翹散治療DRE的機制可能與控制炎癥反應、阻斷海馬神經(jīng)元細胞的脫失和小膠質(zhì)的活化，阻斷耐藥P糖蛋白的過度表達，增強機體對某些抗癇西藥耐藥的敏感性，增強與西藥聯(lián)合的協(xié)同作用有關[6]。疏風止痙方是馬融教授由吳鞠通《溫病條辨》銀翹散化裁而來，在原方基礎上加金果欖、全蝎組成，銀翹散其藥性輕，具有疏風解表、開通經(jīng)絡之功，方中加入金果欖清熱利咽，并以蟲類藥全蝎加強通絡止痙的功效，全方共奏疏風止痙、清熱通絡之效，突破傳統(tǒng)的重鎮(zhèn)豁痰息風治癇之法，改從外感風熱入手治療DRE。疏風止痙方在疏風清熱銀翹散基礎上，加金果欖、全蝎加強清熱通絡止痙之效，全方具有疏風止痙、清熱通絡的功效。相關動物實驗研究表明，疏風止痙方聯(lián)合抗癇藥物可提高腦內(nèi)抗癇藥物濃度，減少癲癇發(fā)作次數(shù)，還能減輕發(fā)作級別，其作用機制是疏風止痙方可以下調(diào) NF-κB 通路上下游細胞因子 IL-1β、TNF-α、Cox-2的水平，抑制NF-κB的激活與表達，進一步降低P-gp的表達與轉運功能[7-8]。馬茗晗等[9]通過馬融教授運用疏風止痙方治療DRE驗案表明該方具有使癲癇發(fā)作次數(shù)明顯減少的臨床療效。

網(wǎng)絡藥理學是系統(tǒng)網(wǎng)絡分析與藥理學相結合的一種新方法。網(wǎng)絡藥理學以生物網(wǎng)絡為靶點，分析這些網(wǎng)絡中藥物、靶點、疾病和途徑之間復雜多樣的聯(lián)系[10]。中藥復方化學成分復雜，主要是通過多種成分與多個靶點之間相互協(xié)同作用來發(fā)揮藥效，通過分子對接驗證其結合活性。本研究旨在通過網(wǎng)絡藥理學及分子對接的方法，分析疏風止痙方治療DRE的潛在作用機制。

1 材料與方法

1.1 篩選活性成分及對應靶點 基于中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP，http：//tcmspw．com/tcmsp．php）以疏風止痙方12味中藥為關鍵詞分別進行檢索，并以生物利用度（OB）≥30%和類藥性（DL）≥0．18為篩選條件進行篩選，得到疏風止痙方的活性成分及對應靶點。OB是指藥物口服后被吸收進入人體循環(huán)的速度與程度，DL指化合物與已知藥物的相似性，滿足兩者條件的化合物定為活性成分。

1.2 篩選疾病相關靶點 運用“Drug-resistant epilepsy”為關鍵詞，在預測人類基因的數(shù)據(jù)庫（GeneCards，https：//www．genecards．org/）和收錄人類孟德爾疾病信息的數(shù)據(jù)庫（OMIM，https：//www．omim．org/）檢索，得到與DRE相關的靶點。

1.3 篩選靶點并構建PPI網(wǎng)絡 運用R 4．0．0語言VennDiagram數(shù)據(jù)包篩選疏風止痙方潛在靶點和疾病相關靶點的交集，將交集靶點上傳至String數(shù)據(jù)庫（https：//string-db．org/）中構建 PPI圖。

1.4 中藥-化學成分-疾病靶點的構建 將中藥、化學成分和疾病靶點上傳至Cytoscape 3．7．2軟件生成中藥-化學成分-疾病靶點網(wǎng)絡圖，并通過Network Analyzer工具進行網(wǎng)絡分析得出關鍵化學成分和關鍵靶點。

1.5 基因本體（GO）功能和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 在R4．0．0語言中安裝Bioconductor包，將基因名稱轉換為基因id，再進行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析，運行R4．0．0語言得出前20條GO功能富集分析柱狀圖及前20條KEGG通路富集分析高級氣泡圖，并構建KEGG關系網(wǎng)絡。

1.6 活性成分-靶點分子對接 選取“中藥-化學成分-疾病靶點”所得度值較高的活性成分，在PubChem數(shù)據(jù)庫（http：//pubchem．ncbi．nlm．nih．gov/）中尋找其2D結構，利用ChemOffice繪制出3D結構，并對其結構優(yōu)化，以SDF格式導出。先在Uniprot數(shù)據(jù)庫（https：//www．uniprot．org/）找到靶點蛋白的 id，再在PDB 數(shù)據(jù)庫（https：//www．rcsb．org/）中尋找靶點蛋白晶體結構并將其導出，利用Pymol 2．4．0將靶點蛋白晶體結構進行刪除水分子和小分子配體處理，以pdb格式導出，將靶點蛋白和活性成分均導入AutoDockTools 1．5．6，準備 PDBQT 文件和確定活性口袋，最后利用AutoDock Vina進行分子對接。

2 結果

2.1 篩選活性成分及對應靶點 在TCMSP數(shù)據(jù)庫檢索金銀花、連翹、荊芥穗、淡豆豉、桔梗、牛蒡子、淡竹葉、生甘草、薄荷、蘆根、金果欖、全蝎12味中藥的化學成分，共得到1 196個化學成分，閾值設定OB≥30%、DL≥0．18，共篩選出180個化學成分，其中金銀花23個、連翹23個、荊芥穗8個、淡豆豉2個、桔梗7個、牛蒡子8個、甘草92個、薄荷10個、蘆根1個、金果欖6個，在TCMSP數(shù)據(jù)庫上搜集到化學成分對應靶點3 392個，見表1。映射到Uniprot數(shù)據(jù)庫進行蛋白標準化命名，去重后最終得到255個靶蛋白。

表1 疏風止痙方活性成分基本信息Tab.1 Shufeng Zhijing Prescription active ingredient basic information

2.2 篩選疾病相關靶點 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫搜集到DRE的疾病靶點4 018個，在線人類孟德爾遺傳OMIM數(shù)據(jù)庫搜集到疾病靶點569個，去重后共計4 471個。

2.3 篩選靶點并構建PPI網(wǎng)絡 運用R 4．0．0語言VennDiagram數(shù)據(jù)包篩選出疏風止痙方潛在靶點和疾病相關靶點交集165個，將這些交集靶點上傳至String 數(shù)據(jù)庫（https：//string-db．org/）中進行靶點間蛋白互作分析，選定物種為“homo sapiens”，并設定置信度大于0．9，構建PPI圖，見圖1。圖1包含165個節(jié)點，639條邊，其中節(jié)點表示蛋白，節(jié)點的大小與節(jié)點度值呈正比關系，每條邊則表示蛋白與蛋白之間的相互作用關系，線條越多表示關聯(lián)度越大，靶蛋白平均節(jié)點度值為7．75，將前30個度值由高到低排序，如圖2所示。其中STAT3、MAPK1、AKT1、MAPK3、JUN的度值排名較靠前。

圖1 PPI蛋白互作網(wǎng)絡Fig.1 PPI protein interaction network

圖2 蛋白互作網(wǎng)絡節(jié)點度值排序Fig.2 Protein interaction network node degree value

2.4 中藥-化學成分-疾病靶點的構建 利用Cytoscape3．7．2 軟件構建中藥-化學成分-疾病靶點網(wǎng)絡圖，見圖3，該網(wǎng)絡包含302個節(jié)點（128個化學成分節(jié)點，9個中藥節(jié)點，165個疾病靶點節(jié)點）和1 699條邊，每條邊表示化學成分與靶點之間的相互作用關系。圖3中紅色代表中藥，綠色代表中藥化學成分，天藍色代表疾病靶點。圖3表明疏風止痙方具有多種化學成分，同一化學成分可以作用于多個靶點，同一靶點也可以對應多個化學成分，體現(xiàn)了復方多成分、多靶點的作用特點。通過Cytoscape 3．7．2 軟件中的 NetworkAnalyzer工具進行網(wǎng)絡分析得出各節(jié)點Degree值，得出Degree值排名前5的化學成分為：槲皮素（quercetin）、木犀草素（luteolin）、山奈酚（kaempferol）、漢黃芩素（wogonin）、柚皮素（naringenin）。Degree值排名前5的靶點為：前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2（PTGS2）、熱休克蛋白90α家族 A 類成員 1（HSP90AA1）、鈣調(diào)蛋白 1（CALM1）、雌激素受體 1（ESR1）、雄激素受體（AR）。

圖3 中藥-化學成分-疾病靶點網(wǎng)絡Fig.3 Chinese medicine-chemical-disease target network

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析 將上述165個靶點基因名稱轉換為基因id，在R語言中安裝Bioconductor包，進行GO功能富集分析，共獲得2 584條 GO 功能條目（P＜0．05），包括對金屬離子的反應、對脂多糖的反應、對細菌源分子的反應等2 235條生物過程（BP），膜筏、膜微域、膜區(qū)等117條細胞組成（CC），泛素樣蛋白連接酶結合、磷酸酶結合、蛋白磷酸酶結合等196條分子功能（MF），分別繪制出前20條GO富集分析柱狀圖，見圖4、圖5、圖6。圖中縱坐標代表GO名稱，橫坐標代表富集在每個GO上的基因數(shù)目，柱子越長，代表富集在該GO上的基因數(shù)目越多，顏色越紅代表富集的顯著性越高。

圖4 疏風止痙方靶點的GO生物過程富集分析Fig.4 Shufeng Zhijing Prescription targets GO biological enrichment analysis process

圖5 疏風止痙方靶點的GO細胞組成富集分析Fig.5 Shufeng Zhijing Prescription targets GO cells enrichment analysis

圖6 疏風止痙方靶點的GO分子功能富集分析Fig.6 Shufeng Zhijing Prescription party GO enrichment of molecular function analysis of targets

KEGG通路富集分析共獲得171條信號通路（P＜0．05），包括 AGE-RAGE 信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、卡波西肉瘤相關皰疹病毒感染、前列腺癌、人巨細胞病毒感染等通路。繪制出前20條KEGG通路富集分析高級氣泡圖，見圖7。圖中縱坐標代表KEGG通路名稱，橫坐標代表基因的比例，圓圈大小代表富集在每條通路上基因的數(shù)目，顏色代表富集顯著性，顏色越紅代表富集的顯著性越高。KEGG關系網(wǎng)絡是由前20條通路和富集在這些通路上的基因構建，如圖8所示，該網(wǎng)絡包含103個節(jié)點（20條通路和83個基因）和464條邊。橙色長方形表示基因，紅色V形表示KEGG通路，圖形大小代表鄰接節(jié)點的數(shù)目，數(shù)目越多則圖形越大。KEGG關系網(wǎng)絡中顯示MAPK1、MAPK3、AKT1的鄰接節(jié)點的數(shù)目最多，可能是疏風止痙方治療DRE的主要目標基因群體。

圖7 疏風止痙方靶點的KEGG通路富集分析Fig.7 Shufeng Zhijing Prescription targets KEGG pathway enrichment analysis

圖8 KEGG關系網(wǎng)絡Fig.8 KEGG relation network

2.6 活性成分-靶點分子對接結果 將疏風止痙方主要活性成分與核心靶點進行分子對接驗證，一般認為活性化合物和靶點蛋白受體間的結合能小于-5 kcal/mol具有較好結合活性，小于-7 kcal/mol具有強烈結合活性。結果提示疏風止痙方核心活性化合物和PTGS2、HSP90AA1、ESR1、AR、MAPK1、AKT1、MAPK3核心靶點之間具有良好的結合活性。見表2和圖9。

表2 分子對接結果Tab.2 Molecular docking results

圖9 分子對接模式圖Fig.9 Molecular docking model

3 討論

眾所周知，癲癇是大腦神經(jīng)元的異常放電引發(fā)大腦功能障礙的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，許多研究證實，受損神經(jīng)元組織中炎癥細胞浸潤和分子調(diào)節(jié)機制紊亂是癲癇發(fā)生的主要因素[11]。中醫(yī)藥治療DRE具有獨特優(yōu)勢，許多中藥在臨床實踐中具有較好的抗癇作用，現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)其作用與調(diào)控炎性因子的表達、調(diào)節(jié)興奮性或抑制性神經(jīng)遞質(zhì)、離子通道、抗氧化反應等密切相關[12]。馬融教授團隊通過動物實驗及臨床診療證明疏風止痙方治療DRE有療效，具體表現(xiàn)在減少癲癇發(fā)作次數(shù)及減輕發(fā)作級別。

本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法對疏風止痙方中12味中藥的有效成分進行分析，再結合分子對接技術將主要活性化合物與關鍵靶點進行分子對接驗證。疏風止痙方的主要活性成分為槲皮素、木犀草素、山奈酚、漢黃芩素、柚皮素。它們均是黃酮類化合物，均具有抗炎、抗氧化等多種生物活性作用。其主要通過調(diào)節(jié)氧化應激、抑制炎癥反應、神經(jīng)保護等治療DRE。劉萍等[13]發(fā)現(xiàn)，槲皮素可介導TLR4/NF-κB通路，調(diào)節(jié)NO釋放，進而降低TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子的分泌，從而起到抗炎作用。Akyuz E等[14]研究證據(jù)證明了槲皮素具有抗癲癇作用，主要是由于槲皮素對癲癇發(fā)作的神經(jīng)保護作用，槲皮素可能是一種潛在的抗癲癇藥物。木犀草素通過抑制NF-κB通路的激活，在許多疾病中顯示其抗炎活性。木犀草素還可以通過下調(diào)MMP 9的表達水平，激活PI3K/Akt信號通路，提高細胞活力，下調(diào)細胞凋亡，從而具有神經(jīng)保護作用[15]。在急性戊四唑（PTZ）模型中研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素具有抗驚厥作用，對氧化應激有抑制作用，其可能成為治療癲癇的潛在分子[16]。El-Kott等[17]實驗研究表明山奈酚通過增加SIRT1活性和抑制PARP1活性來改善CdCl2誘導的記憶缺陷和海馬氧化應激、炎癥和細胞凋亡。Guo等[18]研究表明漢黃芩素對紅藻氨酸誘導的顳葉癲癇（TLE）大鼠具有明顯的神經(jīng)保護作用。柚皮素具有神經(jīng)保護作用，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中運用廣泛。馮祝婷等[19]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)柚皮素對新生大鼠缺血缺氧性腦損傷有保護作用，其作用機制可能與柚皮素下調(diào) NOD2、RIP2、NF-κB蛋白的表達，并減少TNF-α、IL-1β的分泌有關。有研究表明在小鼠癲癇模型中，山萘酚和柚皮素表現(xiàn)出良好的抗癲癇活性，可用于治療全身性肌陣攣、陣攣和強直性癲癇，特別是治療耐藥局灶性癲癇[20]。綜上，疏風止痙方的主要活性化合物均具有抗癲癇活性。

綜合交集靶點的PPI網(wǎng)絡、中藥-化學成分-疾病靶點網(wǎng)絡和KEGG網(wǎng)絡，筆者推測疏風止痙方治療 DRE 的關鍵靶點是：PTGS2、HSP90AA1、ESR1、AR、MAPK1、AKT1、MAPK3。通過皮爾森相關系數(shù)分析發(fā)現(xiàn)PTGS2基因是神經(jīng)系統(tǒng)疾病中分子機制的重要靶點[21]。有研究報道表明HSP90AA1在子癇前期婦女（PE）和正常血壓婦女之間存在差異甲基化，可能在妊娠期應激反應中起調(diào)節(jié)作用，并可能是PE的一種生理病理機制[22]。ESR1通過介導雌激素在胎盤形成、胚胎著床等妊娠生理過程中發(fā)揮重要作用。楊洋等[23]實驗研究表明ESR1是雌激素功能實現(xiàn)的核心，可能通過對雌激素的介導作用而參與了PE的發(fā)生、發(fā)展。近來越來越多研究提出雄激素對大腦的保護作用，雄激素發(fā)揮作用需要依賴AR[24]。研究發(fā)現(xiàn)PE的發(fā)病機制可能與MAPK1通過調(diào)控SRF從而導致中性粒細胞過度活化釋放NE有關[25]。AKT1基因編碼一種絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt1），該激酶參與多種神經(jīng)發(fā)育功能，如神經(jīng)元遷移、依賴生長因子的神經(jīng)元存活、軸突生長和分支以及胎盤功能過程[26]。MAPK1與MAPK3均屬于絲裂原活化蛋白激酶，該類激酶在腦缺血再灌注損傷中被激活，并在缺血性神經(jīng)元損傷中發(fā)揮重要作用[27]。綜上，疏風止痙方的核心靶點對大腦神經(jīng)具有保護作用。

GO富集分析顯示潛在靶點富集的生物學功能主要涉及對金屬離子、脂多糖、細菌源分子、抗生素、活性氧的反應等，而細胞組分富集分析顯示它們主要分布在細胞的膜筏、膜微域、膜區(qū)、胞質(zhì)小泡腔等，分子功能富集分析顯示這些重要靶點主要與泛素樣蛋白連接酶、磷酸酶、蛋白磷酸酶、細胞因子受體結合和蛋白絲氨酸激酶活性等有關。臨床研究發(fā)現(xiàn)小膠質(zhì)細胞還可通過激活Toll樣受體（TLR）促進炎性因子產(chǎn)生[28]。在缺氧、缺血、腦外傷及驚厥等神經(jīng)病理條件下，絲氨酸激酶迅速被激活，調(diào)控多種細胞因子和炎性介質(zhì)的表達及分泌，使多種底物發(fā)生磷酸化反應，進一步調(diào)控基因的轉錄，從而細胞增殖、分化、轉化及凋亡的過程中發(fā)揮關鍵作用[29]。KEGG富集分析中靶點通路主要涉及AGERAGE信號通路、流體剪應力與動脈粥樣硬化、乙型肝炎、人巨細胞病毒感染等通路。AGE-RAGE信號通路的糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）主要起促炎性介質(zhì)作用，而AGEs是RAGE的重要配體，可激活轉錄因子NF-κB引起炎癥和氧化應激反應，從而損害大腦神經(jīng)元和海馬的結構及功能[30-31]。流體剪切應力與動脈粥樣硬化信號通路通過誘導內(nèi)皮細胞Fractalkine mRNA的表達增高，使血管硬化產(chǎn)生斑塊從而影響血流動力學引發(fā)心腦血管疾病[32]。乙型肝炎通路參與多種功能，并調(diào)節(jié)轉錄、細胞信號級聯(lián)、增殖、分化和凋亡[33]。人巨細胞病毒（HCMV）是引起先天性腦發(fā)育障礙及免疫缺陷人群腦功能損害的最常見病原體，腦組織是HCMV感染的主要靶器官之一，感染造成的中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害尤為嚴重[34]。綜上，疏風止痙方可能通過炎癥、病毒等通路的調(diào)節(jié)，發(fā)揮治療DRE作用。

分子對接結果顯示，疏風止痙方中主要活性化合物與核心靶點蛋白 PTGS2、HSP90AA1、ESR1、AR、MAPK1、AKT1、MAPK3 能夠穩(wěn)定的結合，初步表明疏風止痙方可能作用于 PTGS2、HSP90AA1、ESR1、AR、MAPK1、AKT1、MAPK3 等靶點，通過調(diào)控細胞增殖和凋亡發(fā)揮抗病毒作用，抑制炎癥反應，對大腦神經(jīng)具有保護作用，從而治療DRE。

綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡藥理學方法探討疏風止痙方治療DRE的作用機制，并通過分子對接技術，初步驗證疏風止痙方具有抗病毒、抑制炎癥反應、神經(jīng)保護等多重功效，

通過多成分、多靶點、多通路發(fā)揮抗病毒、抑制炎癥、神經(jīng)保護等協(xié)同作用治療DRE，從而減少癲癇發(fā)病次數(shù)。