羅保發(fā)， 楊鎧文， 黃益龍， 朱紅麗， 高 超， 杞天付， 馬寄耀， 何 波

腰痛是肌肉骨骼系統(tǒng)常見疾病之一，也是全球致殘的主要原因［1］。39%～41%慢性腰痛患者被認為與椎間盤退變有關(guān)，即椎間盤源性腰痛（discogenic low back pain，DLBP）［2］。但DLBP具體病理機制不明，建立動物模型對探討DLBP發(fā)生發(fā)展規(guī)律、指導臨床治療及康復鍛煉具有重要意義。既往DLBP動物模型研究重點多集中于椎間盤，建模過程會損傷椎旁肌和腹壁?。?］，而椎旁肌是負責脊柱移動和穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)。已有研究表明，DLBP與椎旁肌病變密切相關(guān)［4-5］。因此，如何合理構(gòu)建DLBP動物模型以更好地模擬臨床患者疾病特征，顯得尤為重要。本研究采用更為微創(chuàng)的X線透視引導穿刺腰椎間盤技術(shù)建立DLBP大鼠模型，通過行為學、影像學及組織學綜合評估模型建立的可行性，為研究DLBP病理機制和椎旁肌病理改變提供動物模型載體。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用230～250 g雌性Sprague-Dawley大鼠60只（昆明醫(yī)科大學實驗動物中心），飼養(yǎng)溫度為（24±3）℃、濕度為（50±10）%，保持晝夜節(jié)律。本研究已獲昆明醫(yī)科大學倫理委員會批準（審批號：kmmu2021038），飼養(yǎng)及實驗過程遵循動物實驗3R原則。

1.2 主要試劑和設(shè)備

蘇木精-伊紅（HE）染液套裝、番紅固綠染液套裝（賽維爾生物科技，武漢），無水乙醇、二甲苯、中性樹膠（國藥集團化學試劑，中國），26 G穿刺針（康德萊醫(yī)療器械，上海），磷酸緩沖液（PBS）（Biosharp，中國），Discovery MR750W 3.0T MR機（GE，美國），3.0T 16通道老鼠線圈（辰光醫(yī)療科技，上海），X線透視機（島津醫(yī)療，日本）。

1.3 實驗動物分組

60只雌性大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d，隨機分為DLBP組（n=24）、假手術(shù)組（n=15）、正常組（n=21）；根據(jù)建模時間，再將每組大鼠平均分為30 d組、90 d組、180 d組。

1.4 模型建立

大鼠腹腔麻醉，取右側(cè)臥位，醫(yī)用乙醇局部消毒；從側(cè)后方入路，使用26 G穿刺針，X線透視下進針（進針方向位于棘突上半橫指處，與水平面呈45°），分別使其平對L4～5和L5～6層面椎間盤，進針后探查針尖，至有沙礫感時透視引導穿刺進入椎間盤，觀察穿刺深度（圖1），確保每只大鼠穿刺深度相同；針尖旋轉(zhuǎn)360°打入2.5 μL無菌PBS，穿刺針停留30 s后拔出。同點穿刺假手術(shù)組大鼠至腰椎旁，穿刺針不進入椎間盤。正常組不做任何處理。透視條件為：管電壓52 kV、管電流0.6 mA，圖像采集幀速為1幀／s。

圖1 X線片觀察穿刺針穿刺位置和深度

1.5 行為學評估

在建模后1、7、14、30、90、180 d分別進行行為學實驗，所有行為學實驗均在固定時點進行。具體實驗方法：①步態(tài)實驗——對3組大鼠進行步態(tài)障礙評分，將大鼠放到動物實驗臺上，安靜1 min后，觀察行走過程中步態(tài)變化。評分標準：3分，重度運動障礙且不能行走；2分，中度運動障礙，可行走但明顯跛行；1分，輕度跛行；0分，肢體活動正常。②痛溫覺實驗之熱板實驗——將熱板調(diào)試至55℃，待其溫度穩(wěn)定后將大鼠放置在熱板上，用透明板包圍四周限制其活動（圖2①）；計時20 s，若20 s內(nèi)大鼠出現(xiàn)舔后爪、擺動后爪、跳躍等行為時計時停止，記錄大鼠出現(xiàn)反應(yīng)所需時間；每只大鼠操作2次，2次間歇10 min。丙酮實驗——將大鼠放置于透明板內(nèi)（圖2②），適應(yīng)1 min后，用移液槍吸取50 μL丙酮噴射于后趾皮膚，計時1 min，若出現(xiàn)抬起后爪、舔后爪、震動后爪即停止計時，記錄大鼠出現(xiàn)反應(yīng)所需時間，左右腳各操作1次，2次間歇10 min。③軸性腰痛誘發(fā)實驗之旋尾實驗——由于大鼠受到的自身重力較大，很少會處于靜止狀態(tài)，基于之前研究方法［6］，只計時大鼠掙扎和彎腰時間；將大鼠尾部后1/3用膠帶固定在細線上，掛于金屬桿上離地面30 cm呈倒掛狀，四周用木板包圍以避免干擾（圖2③），分別記錄5 min內(nèi)大鼠掙扎和彎腰時間。④抓握實驗——將大鼠放在高50 cm網(wǎng)格上倒掛，下方墊上泡沫墊（圖2④），在15 s內(nèi)以大鼠從網(wǎng)格上墜落為終點，記錄大鼠在網(wǎng)格上停留時間，每只大鼠操作2次，2次間歇10 min。

圖2 行為學實驗

1.6 MR評估

在建模后30、90、180 d，對3組大鼠行腰椎MR矢狀位T2加權(quán)成像掃描，使用Pfirrmann分級對每只大鼠L4～5和L5～6層面椎間盤進行評價［7］。MR掃描參數(shù)：重復時間3 190 ms，回波時間100 ms，層厚1.2 mm，層間隔0 mm，帶寬41.67，矩陣320×256，視野10 cm×10 cm，激勵次數(shù)4。

1.7 組織學評估

在建模后30、90、180 d，MR掃描后處死大鼠。充分分離椎旁肌，使用咬骨剪剪斷椎體，完整截取L4～5和L5～6椎間盤，將取出的椎間盤組織浸泡在濃度為4%甲醛溶液中固定，進行常規(guī)HE染色和番紅O-固綠染色，并根據(jù)Masuda評分標準評估椎間盤退變程度［8］。

1.8 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件處理分析數(shù)據(jù)結(jié)果。計量資料符合正態(tài)分布以均數(shù)±標準差表示，采用單因素方差分析，多組間重復比較用Bonferroni檢驗；不符合正態(tài)分布以M（P25，P75）表示，用Kruskal-Wallis檢驗分析，多組間重復比較用Dunn檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 行為學結(jié)果

DLBP組大鼠建模后1 d、7 d步態(tài)障礙評分升高（均P＜0.05），隨后步態(tài)功能逐漸恢復，180 d步態(tài)障礙評分再次升高（均P＜0.01）。熱板實驗和丙酮實驗結(jié)果表明，DLBP組大鼠建模后90 d開始出現(xiàn)痛溫覺過敏，熱刺激和冷刺激反應(yīng)閾值顯著低于正常組和假手術(shù)組（均P＜0.01）。并且在相同時間點，旋尾實驗成功誘發(fā)大鼠軸性腰痛行為，與正常組和假手術(shù)組相比，DLBP組大鼠出現(xiàn)掙扎時間減少、彎腰時間增多（均P＜0.05），而3組大鼠抓握實驗各時間點差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。各組行為學結(jié)果見圖3。

圖3 3組大鼠各時間點行為學改變折線圖

2.2 MR結(jié)果

腰椎MR矢狀位T2加權(quán)成像顯示，建模后30 d、90 d、180 d正常組和假手術(shù)組大鼠髓核呈均勻T2高信號，與纖維環(huán)分界清楚，而DLBP組大鼠自建模后30 d開始髓核T2信號明顯減低，與纖維環(huán)分界欠清楚，見圖4。椎間盤退變Pfirrmann分級評價顯示，建模后30 d、90 d、180 d正常組和假手術(shù)組大鼠均為Ⅰ級，而DLBP組大鼠Ⅲ、Ⅳ級均占比較高，呈中-重度退變，見表1。

表1 3組各時間點椎間盤退變Pfirrmann分級評估結(jié)果

圖4 3組大鼠腰椎MR矢狀位T2加權(quán)成像

2.3 組織學結(jié)果

椎間盤HE和番紅O-固綠染色結(jié)果顯示，建模后180 d，正常組和假手術(shù)組大鼠髓核形態(tài)正常，含豐富的軟骨細胞及基質(zhì)，與纖維環(huán)分界清楚，纖維環(huán)呈同心圓樣結(jié)構(gòu)排列，髓核蛋白多糖染色清晰且顏色較深；DLBP組正常髓核結(jié)構(gòu)消失，纖維環(huán)同心圓樣結(jié)構(gòu)消失，與髓核分界不清，髓核細胞明顯減少，髓核基質(zhì)凝結(jié)，髓核內(nèi)蛋白多糖染色程度逐漸減低，見圖5。椎間盤退變Masuda評分結(jié)果顯示，建模后30、90、180 d正常組和假手術(shù)組均顯示為正常椎間盤Masuda評分，而DLBP組Masuda評分顯著高于正常組和假手術(shù)組（均P＜0.05），見表2。

表2 組織學椎間盤退變Masuda評分評估結(jié)果

圖5 3組大鼠椎間盤HE染色(×20)、髓核HE染色和番紅O-固綠染色(×200)圖

3 討論

穿刺建模技術(shù)具有便捷、創(chuàng)傷小、穿刺深度可控等特點，常被用于DLBP動物模型建立［9］。本研究采用透視引導細針穿刺椎間盤建模方式避免了常規(guī)分離椎旁肌肉和腹部肌群造成的肌肉損傷，更符合人體椎間盤退變的病理過程，而向椎間盤內(nèi)注入無菌PBS可通過增加椎間盤內(nèi)壓力導致椎間盤結(jié)構(gòu)性損傷并誘導椎間盤退變［10］，有效彌補了使用較細穿刺針穿刺導致的椎間盤退變程度輕的缺點。同時嚙齒類動物作為基礎(chǔ)研究中常用于模型建立的動物，相較于其他大型動物（兔、犬、羊等）具有疼痛程度可評估的優(yōu)勢。

本研究中自建模后30 d開始，DLBP組大鼠腰椎MR矢狀位T2加權(quán)成像、HE染色和番紅O-固綠染色即表現(xiàn)出顯著的椎間盤退變，一直持續(xù)至建模后180 d，而穿刺后腰椎間盤表現(xiàn)出一種穩(wěn)定且快速的椎間盤退變，與Ohnishi等［11］研究結(jié)果類似，穿刺建模所誘導的椎間盤退變并不會隨時間點推移而加重。一個穩(wěn)定的椎間盤退變模型是研究DLBP及其脊柱附屬結(jié)構(gòu)病理改變的基礎(chǔ)，而穿刺后快速出現(xiàn)椎間盤退變可以在早期對成模情況進行評價。

雖然DLBP通常與椎間盤退變有關(guān)，但受限于個體差異，椎間盤退變并不意味患者存在腰痛癥狀［12］。除椎間盤退變外，對患者臨床癥狀和體征的評估也很有必要。而且臨床患者治療效果評價需要以癥狀改善作為依據(jù)，因此，所構(gòu)建的動物模型要能模擬出與患者相似的疼痛表型。本研究通過不同的行為學評估，量化了大鼠疼痛程度及表型；發(fā)現(xiàn)模型建立后期出現(xiàn)了由于椎間盤退變后脊柱失穩(wěn)導致的步態(tài)功能障礙。這與臨床中DLBP患者表現(xiàn)出步頻或活動度減少的表現(xiàn)相似［13］。椎間盤退變后運動功能障礙在之前小鼠研究中也被發(fā)現(xiàn)，但其具體機制尚不清楚［14］。DLBP患者雖無神經(jīng)壓迫，但還會出現(xiàn)腹股溝區(qū)及大腿根性疼痛和軸性腰痛癥狀，這在本研究建模后大鼠中也發(fā)現(xiàn)類似表現(xiàn)，建模后90 d、180 d DLBP組大鼠出現(xiàn)痛溫覺反應(yīng)閾值降低，旋尾實驗中軸性腰痛誘發(fā)的逃避行為。這與Millecamps等［14］的研究相似，被認為是由椎間盤退變后病理性神經(jīng)長入和周圍神經(jīng)纖維致敏所導致，還可能與椎間盤周圍一些結(jié)構(gòu)，如肌肉、韌帶和關(guān)節(jié)相關(guān)。然而在抓握實驗中，3組大鼠表現(xiàn)出的抓握能力相似，這可能是大鼠墜落前會以前爪抓握而計時較短，通過自身重力未能有效引出軸性腰痛癥狀的緣故。

對于DLBP的步態(tài)功能障礙、軸性腰痛癥狀和痛溫覺過敏行為學表現(xiàn)，僅通過椎間盤退變不能很好地進行解釋，因此DLBP評估不應(yīng)僅局限于椎間盤，還應(yīng)關(guān)注脊柱附屬結(jié)構(gòu)，如椎旁肌。近年已有學者從組織學層面觀察到DLBP椎旁肌病理改變［15-17］，但尚不清楚這些病理改變在活體中能否被客觀反映。這也是本研究模型建立的意義，通過微創(chuàng)透視引導穿刺建模方式使DLBP椎旁肌無創(chuàng)評估（如肌電圖、影像學）成為可能，有利于探討椎間盤、椎旁肌、行為學改變?nèi)咧g的關(guān)系。

本研究DLBP模型建立的主要特點：①使用26 G細針穿刺椎間盤，避免了外科手術(shù)對椎旁肌和腹壁肌的損傷；②X線透視引導下建模不僅便捷高效，而且穿刺深度可控，避免了盲穿刺導致的穿刺深度不一致；③使用行為學表征了DLBP疼痛表型，作為評估DLBP疼痛程度和進展的間接證據(jù)。

但本研究構(gòu)建的DLBP大鼠模型仍存在一定局限性，如大鼠屬四足行走動物，其脊柱生物力學不同于人體；由穿刺誘導的椎間盤退變模型無法完全模擬人體自發(fā)的椎間盤退變。因此，選擇用于人體椎間盤退變研究的動物模型時，應(yīng)充分考慮各模型的適用性及局限性。

總之，本研究通過X線透視引導穿刺腰椎間盤成功構(gòu)建了DLBP大鼠模型。單側(cè)穿刺腰椎間盤顯示了一種以痛溫覺改變?yōu)樘卣鞯碾p側(cè)行為學表型，且伴有運動功能受損和軸性腰痛引起的逃避行為。這種模型構(gòu)建方式復制了人類DLBP臨床表現(xiàn)的關(guān)鍵特征，為后續(xù)DLBP椎間盤及椎旁肌病理機制研究奠定了基礎(chǔ)。