李俊杰, 于 朋, 李 昀, 田 源, 張凱強(qiáng), 王海亮, 齊 鑫, 溫海深

花鱸基因家族的鑒定、進(jìn)化分析及對(duì)環(huán)境鹽度的表達(dá)響應(yīng)

李俊杰, 于 朋, 李 昀, 田 源, 張凱強(qiáng), 王海亮, 齊 鑫, 溫海深

(中國海洋大學(xué)海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266003)

Claudin (cldn)是細(xì)胞間緊密連接蛋白的重要功能和結(jié)構(gòu)組件, 通過控制細(xì)胞旁通路通透性參與滲透壓平衡的調(diào)節(jié)。本研究對(duì)花鱸()基因家族進(jìn)行了系統(tǒng)的鑒定分析, 結(jié)果表明: 花鱸基因家族共包含55個(gè)成員, 分布于16條染色體上, 其中34個(gè)基因在哺乳動(dòng)物體內(nèi)有對(duì)應(yīng)直系同源基因, 其余21個(gè)是硬骨魚所特有。選擇壓力分析顯示預(yù)測(cè)的花鱸cldns蛋白的跨膜區(qū)域存在14個(gè)受正選擇作用的氨基酸位點(diǎn), 這些正選擇位點(diǎn)可能與家族內(nèi)基因的多樣性和功能分化有關(guān)。此外, 基于花鱸鰓轉(zhuǎn)錄組的基因表達(dá)結(jié)果表明, 至少有24個(gè)基因在鰓中表達(dá), 其中、和在不同環(huán)境鹽度處理后表達(dá)差異顯著, 表明其可能是花鱸鰓組織中調(diào)節(jié)滲透壓平衡的候選功能基因。本研究成果為研究花鱸及其他廣鹽性魚類基因家族成員的滲透調(diào)節(jié)機(jī)制奠定了理論基礎(chǔ)。

基因家族; 花鱸; 鹽度; 進(jìn)化分析

緊密連接通過平衡細(xì)胞間通路調(diào)節(jié)細(xì)胞旁運(yùn)輸, 在滲透調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用。緊密連接復(fù)合蛋白由封閉蛋白(claudin)、閉合蛋白(oocludin)、縫隙連接蛋白(ZO-1)以及激動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架(actin cytoskeleton)構(gòu)成[1]。其中, Claudin是一個(gè)多基因家族, 常簡(jiǎn)寫為cldn, 是構(gòu)成細(xì)胞間緊密連接必不可少的組成部分, 可調(diào)節(jié)水和離子在細(xì)胞垂直方向跨細(xì)胞緊密連接的細(xì)胞旁運(yùn)動(dòng)[2], 對(duì)于細(xì)胞間密封的形成和緊密連接的滲透性的控制都至關(guān)重要[3]。

Claudin是一種四跨膜蛋白, 其中, 第1個(gè)與第2個(gè)跨膜結(jié)構(gòu)域高度保守, 氨基與羧基都分布在細(xì)胞內(nèi), 羧基末端富含豐富的絲氨酸、蘇氨酸及酪氨酸殘基[4]。Claudin對(duì)細(xì)胞連接處選擇滲透性的調(diào)節(jié)主要通過蛋白激酶途徑實(shí)現(xiàn), cldn上特異性的氨基酸靶點(diǎn)與蛋白激酶A或蛋白激酶C結(jié)合, 磷酸化后緊密連接功能下降, 表現(xiàn)為氯化物滲透性增強(qiáng)[5]。不同的成員存在組織特異性的表達(dá), 并對(duì)離子交換的選擇性不同, 它們以多種組合方式參與構(gòu)成緊密連接復(fù)合蛋白, 增加了緊密連接的結(jié)構(gòu)和功能的多樣性, 形成了不同類型的屏障功能[6]。目前, 已有大量基因被鑒定出來, 不同物種間基因數(shù)存在較大差異: 無脊椎動(dòng)物如秀麗隱桿線蟲()、黑腹果蠅()只有4到5個(gè)相關(guān)基因[7-8], 在哺乳動(dòng)物中, 有24個(gè)家族成員被發(fā)現(xiàn)[3], 而在硬骨魚中, 由于硬骨魚特異的全基因組復(fù)制(WGD)和串聯(lián)重復(fù)事件, 先后共有63個(gè)被發(fā)現(xiàn)[9]。最大的擴(kuò)增事件發(fā)生在上: 人類與13個(gè)魚類基因顯示出同源關(guān)系(、、、)[10]。

魚類的c基因與滲透壓調(diào)節(jié)和鹽度適應(yīng)存在著密切的關(guān)系。鰓是魚類調(diào)節(jié)滲透壓最重要的器官之一。透射電鏡觀察結(jié)果表明, 當(dāng)魚體從淡水轉(zhuǎn)入海水中時(shí), 鰓上皮離子細(xì)胞和附屬細(xì)胞間緊密連接的超微結(jié)構(gòu)由封閉的“柵欄”變?yōu)樾孤┑摹翱谞睢盵11]。這兩種細(xì)胞類型間存在著滲漏的緊密連接, 對(duì)于鰓上皮分泌多余的Na+提供了至關(guān)重要的細(xì)胞旁通路[12], 而cldns對(duì)于調(diào)節(jié)水和離子在細(xì)胞垂直方向跨細(xì)胞緊密連接的細(xì)胞旁運(yùn)動(dòng)至關(guān)重要。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 高滲環(huán)境誘導(dǎo)大西洋鮭魚鰓中的表達(dá), 低滲環(huán)境則誘導(dǎo)大西洋鮭魚鰓中和的表達(dá)[13]。而在羅非魚的鰓組織中, 低滲環(huán)境誘導(dǎo)和的表達(dá)[14]。此外, 在兩種河豚(和)鰓中均發(fā)現(xiàn)了mRNA的鹽度依賴性差異表達(dá)[15-16]。Marshall等[17]探究了底鱂亞型在不同鹽度下的適應(yīng)變化, 結(jié)果表明環(huán)境鹽度的增加提升了不同亞型的表達(dá)量。對(duì)于瓦氏雅羅魚()的基因家族的選擇壓力分析顯示,為正選擇基因, 表明其在促進(jìn)離子轉(zhuǎn)運(yùn)和酸堿調(diào)節(jié)以適應(yīng)高鹽堿的自然環(huán)境中發(fā)揮潛在作用[18]。

花鱸()是我國重要的海產(chǎn)經(jīng)濟(jì)魚類, 具有典型的廣鹽性特征, 可在鹽度0～45的范圍內(nèi)正常存活、生長, 是研究魚類鹽度耐受性及滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制的理想模型。本文對(duì)花鱸基因進(jìn)行了全基因組的鑒定和注釋, 并對(duì)其基因結(jié)構(gòu)及進(jìn)化特征進(jìn)行分析, 同時(shí)開展了它們?cè)诓煌}度下鰓組織中的表達(dá)特征分析, 以期篩選與鹽度適應(yīng)和滲透壓調(diào)節(jié)相關(guān)的基因, 為進(jìn)一步研究花鱸對(duì)急性鹽度脅迫的生理響應(yīng)以及花鱸的耐鹽機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚及暫養(yǎng)條件

實(shí)驗(yàn)用1齡花鱸[(100.00±2.34) g]取自山東省東營市雙瀛水產(chǎn)苗種有限責(zé)任公司, 實(shí)驗(yàn)開始前花鱸暫養(yǎng)在鹽度為30的水泥池(5 m×5 m×1 m)中, 溫度為(21.0±0.5) ℃, pH值為7.98～8.04, 溶解氧含量為6.90～8.54 mg/L, 亞硝酸鹽<0.1 mg/L, 光照周期14L: 10D。

1.2 鹽度處理實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)共設(shè)計(jì)3個(gè)鹽度組, 分別為0(淡水組)、12(等滲組)、30(海水組), 每個(gè)鹽度組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。實(shí)驗(yàn)開始后, 將暫養(yǎng)的花鱸轉(zhuǎn)移至不同鹽度的水桶中, 實(shí)驗(yàn)每個(gè)重復(fù)養(yǎng)殖5尾花鱸, 實(shí)驗(yàn)進(jìn)行30 d, 每日8: 30和16: 30投喂配合飼料, 每2 d換一次水, 換水量為50%。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 每個(gè)鹽度組至少隨機(jī)選取3尾魚進(jìn)行鰓組織取樣并迅速保存于液氮中, 隨后置于?80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 花鱸cldn基因的鑒定和序列分析

從NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)數(shù)據(jù)庫中檢索獲取人()、小鼠()、紅鰭東方鲀()和斑馬魚()4種物種的所有基因的氨基酸序列, 利用TBLASTN (1e-5)對(duì)花鱸參考基因組(NCBI登錄號(hào): PRJNA408177)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(NCBI登錄號(hào): SRR4409341和SRR4409397)進(jìn)行檢索, 初步獲得花鱸候選基因序列。利用在線工具open reading frame (ORF) finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/gorf.html)篩選出完整的開放閱讀框, 并預(yù)測(cè)氨基酸序列, 通過smartblast比對(duì)NCBI非冗余(nr)蛋白序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。利用NCBI-CDD數(shù)據(jù)庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)對(duì)鑒定得到的花鱸基因的特征結(jié)構(gòu)域進(jìn)行驗(yàn)證。使用ExPASyProt-Param工具(https://web.expasy.org/ protparam/)計(jì)算每個(gè)預(yù)測(cè)的cldn蛋白的分子量(MW, kDa)和等電點(diǎn)(pI)。根據(jù)其他幾種脊椎動(dòng)物的基因組數(shù)據(jù)庫對(duì)不同物種的基因拷貝數(shù)進(jìn)行比較。

1.4 Cldns的系統(tǒng)發(fā)育分析及染色體分布

對(duì)花鱸、人、小鼠、斑馬魚以及硬骨魚紅鰭東方鲀的cldns氨基酸序列進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析。利用ClustalW進(jìn)行比對(duì)(默認(rèn)參數(shù))。通過MEGA 7.0軟件, 采用Neighbor-Joining (NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹, bootstrap數(shù)值選擇1 000[19]。利用在線軟件Interactive Tree Of Life (http://itol.embl.de/)對(duì)進(jìn)化樹進(jìn)行作圖。通過花鱸基因組數(shù)據(jù)庫獲取染色體位置與基因密度信息, 通過MCScanX (默認(rèn)參數(shù))挖掘共線性信息[20]。根據(jù)每個(gè)基因在基因組上的坐標(biāo)定位其染色體位置, 并使用TBtools軟件進(jìn)行結(jié)果可視化[21]。

1.5 花鱸Cldns基因家族的進(jìn)化選擇壓力分析

使用MUSCLE方法對(duì)55條花鱸的預(yù)測(cè)的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)。使用MEGA 7.0程序的最大似然法對(duì)花鱸構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹, 基于物種內(nèi)部序列的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系和后續(xù)分析的需要, 本文將家族成員分為4組: ClassⅠ、Class Ⅱ、Class Ⅲ和Class Ⅳ。使用PAL2NAL (http://www.bork.embl. de/pal2nal/)獲得準(zhǔn)確比對(duì)的核苷酸序列, 用于獲得后續(xù)選擇壓力分析。

基于花鱸家族物種內(nèi)的系統(tǒng)發(fā)育樹, 采用PAML 4.9i的CODEML程序[22], 利用不同的模型(枝模型、位點(diǎn)模型、枝位點(diǎn)模型), 對(duì)4組主要的進(jìn)化枝進(jìn)行選擇壓力分析。計(jì)算非同義替換與同義替換的比值值, 即d/d。當(dāng)=1時(shí), 為中性進(jìn)化(Neutral selection), 即不受選擇; 當(dāng)>1時(shí), 為正選擇(positive selection); 當(dāng)0<<1時(shí), 為負(fù)選擇(nega-tive selection), 也叫凈化選擇或純化選擇(purifying selection)。本文利用EasyCodeML程序?qū)?種模型的各項(xiàng)參數(shù)進(jìn)行計(jì)算[23], 采用似然比檢驗(yàn)(LRT)比較模型對(duì)的擬合程度, 采用貝葉斯法對(duì)正選擇位點(diǎn)進(jìn)行識(shí)別[24]。

1.6 基因表達(dá)分析

利用花鱸在不同鹽度條件下的鰓組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(NCBI登錄號(hào): PRJNA515986)進(jìn)行meta分析, 對(duì)每百萬reads中來自于某基因每千堿基長度的reads數(shù)(RPKM)值進(jìn)行歸一化處理后, 基于RPKM計(jì)算在每個(gè)組之間的表達(dá)倍數(shù)變化(海水組/等滲組、淡水組/等滲組、淡水組/海水組)。滿足總read數(shù)≥5、log2|(差異表達(dá)倍數(shù))|≥1、值≤0.05的基因被認(rèn)為是顯著差異表達(dá)基因。

2 結(jié)果

2.1 花鱸cldns基因家族成員的鑒定

在花鱸全基因組范圍內(nèi)共鑒定獲得55條序列(表1), CDS長度387～1 284 bp, 編碼蛋白長度為128～427個(gè)氨基酸。除和外, 分子量均在80 kDa以下。此外, 各等電點(diǎn)和保守結(jié)構(gòu)域的位置在表1中列出。

表1 花鱸cldns基因家族成員的序列特征

續(xù)表

2.2 花鱸cldns基因拷貝數(shù)分析及染色體定位

對(duì)各基因在花鱸、人、小鼠、雞()、斑點(diǎn)叉尾鮰()、斑馬魚及紅鰭東方鲀7種脊椎動(dòng)物中的拷貝數(shù)進(jìn)行了總結(jié)分析。如表2所示, 硬骨魚基因數(shù)目顯著高于高等脊椎動(dòng)物的數(shù)目。花鱸、紅鰭東方鲀和斑點(diǎn)叉尾鮰的數(shù)目是人類的2倍以上, 表明基因家族在硬骨魚中產(chǎn)生了顯著擴(kuò)增。及為高等脊椎動(dòng)物所特有, 而其直系同源物在硬骨魚中缺失; 根據(jù)斑馬魚和紅鰭東方鲀的命名規(guī)則: 硬骨魚與哺乳動(dòng)物(人)有直系同源關(guān)系的基因參照哺乳動(dòng)物命名, 而與人無直系同源關(guān)系的基因從開始命名[10], 因此,之后的基因?yàn)橛补囚~所特有。花鱸比其他硬骨魚多了一個(gè)基因拷貝, 而在花鱸基因組中缺失,擁有3個(gè)拷貝, 多于所對(duì)比的任何一種硬骨魚(表2)。

表2 cldns各基因拷貝數(shù)在幾種典型脊椎動(dòng)物中的比較

花鱸的55個(gè)基因分布于16條染色體上, 染色體5和染色體12分布著多個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因(圖1)。如圖2所示, 兩基因簇分別與人類的和具有較高的同源性。此外, 3號(hào)、8號(hào)、16號(hào)、18號(hào)和20號(hào)染色體分別包含1個(gè)基因, 15號(hào)、17號(hào)和23號(hào)染色體分別包含2個(gè)基因, 10、11、19號(hào)染色體各含有3個(gè)基因, 而2號(hào)染色體包含4個(gè)基因?；|的定位于scaffold524上, 未掛載到染色體上(圖1)。

圖1 花鱸cldns基因的染色體分布情況

注: 黑色線條代表每個(gè)基因在染色體上的位置, 基因組所有基因的共線性關(guān)系由灰色線條表示。橙色外環(huán)代表每個(gè)染色體上的基因密度

圖2 人cldn3、cldn4及紅鰭東方鲀和花鱸cldn3-like、cldn4-like基因簇在染色體上的定位和位置關(guān)系

注: 紅色虛線表示染色體內(nèi)的基因復(fù)制, 黑色虛線表示染色體片段間的基因復(fù)制

2.3 系統(tǒng)發(fā)育分析

選取人、鼠、紅鰭東方鲀、斑馬魚以及花鱸共202條氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。如圖3所示, 這些基因共聚為7組進(jìn)化枝。總的來說, 大多數(shù)花鱸基因與已知其他物種的同類基因聚在一起。共有34個(gè)花鱸基因與哺乳動(dòng)物基因同源, 其余21個(gè)是硬骨魚所特有[10]。其中, 花鱸具有兩個(gè)拷貝(和), 由圖3可知, 二者的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較遠(yuǎn)。因此, 為進(jìn)一步證實(shí)花鱸基因注釋的準(zhǔn)確性, 我們進(jìn)行了共線性分析(圖4), 結(jié)果顯示花鱸與紅鰭東方鲀的具有高度保守的相鄰基因, 而由于在紅鰭東方鲀?yōu)閱慰截? 我們選取雙色雀鯛()與花鱸的進(jìn)行共線性分析, 結(jié)果證明花鱸與其具有相似的鄰近基因, 證實(shí)了花鱸基因的命名的準(zhǔn)確性。

圖3 cldns基因家族各成員系統(tǒng)進(jìn)化樹

注: 紅點(diǎn)表示鑒定出的花鱸基因, 不同顏色表示不同的進(jìn)化枝

2.4 花鱸cldns基因的選擇壓力分析

將花鱸55條氨基酸序列構(gòu)建物種內(nèi)的進(jìn)化樹, 依據(jù)聚類關(guān)系將55條共分為4個(gè)大組: Class Ⅰ包含和等多個(gè)旁系同源基因, 多為硬骨魚較高等脊椎動(dòng)物所特有的基因; Class Ⅱ包括、、、和; Class Ⅲ包括、、、; Class Ⅳ包括、、、、(圖5)。

圖4 cldn1基因共線性分析

圖5 花鱸cldns系統(tǒng)進(jìn)化樹

采用枝位點(diǎn)模型檢測(cè)不同分支上不同位點(diǎn)受到的選擇壓力。結(jié)果如表3所示: 將Class Ⅰ、Class Ⅱ、Class Ⅲ和Class Ⅳ四大枝分別作為前景枝, 每次計(jì)算時(shí)將其他分支標(biāo)記為背景枝, 結(jié)果表明, 除Class Ⅱ以外均檢測(cè)到受正選擇作用的氨基酸位點(diǎn), 在Class Ⅰ分枝中, 有6.38%的位點(diǎn)受到正選擇壓力, 139Y為正選擇位點(diǎn)(>0.95); 在Class Ⅳ的分支上, 115D在>0.95這個(gè)置信水平上被認(rèn)為是受正選擇的氨基酸位點(diǎn); 在Class Ⅲ的分支上, 在>0.95的置信水平上在蛋白的跨膜區(qū)域有14個(gè)位點(diǎn)被檢測(cè)出來: 92A、93S、100G、102K、105K、115D、117I、135A、136V、137S、139Y、140A、143V、174A。但就整體而言, 四大枝的值仍遠(yuǎn)小于1, 處于負(fù)選擇。

表3 支位點(diǎn)模型的參數(shù)估計(jì)與似然比檢驗(yàn)

2.5 花鱸鰓組織中cldns基因在不同鹽度下的表達(dá)模式分析

對(duì)不同鹽度條件下的花鱸鰓組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行Meta分析, 結(jié)果如表4所示,基因家族中至少有24個(gè)成員在鰓組織中表達(dá), 共有6個(gè)基因在不同的鹽度實(shí)驗(yàn)組中呈現(xiàn)出顯著差異表達(dá):、、、、和。其中,和在淡水中的表達(dá)量顯著高于等滲水、海水中的表達(dá)量;和的表達(dá)量關(guān)系為: 海水>等滲水>淡水;、與在淡水中的表達(dá)量顯著高于海水, 其在淡水和等滲水中也存在顯著差異。研究結(jié)果表明: 這6個(gè)基因在不同的鹽度環(huán)境下差異表達(dá), 可能參與花鱸鰓組織滲透調(diào)節(jié), 具備離子屏障等功能。

3 討論

Cldns是細(xì)胞間緊密連接蛋白的重要功能和結(jié)構(gòu)組件, 在調(diào)節(jié)細(xì)胞旁通路通透性方面起著至關(guān)重要的作用[8]。本研究在花鱸全基因組范圍內(nèi)共鑒定出55個(gè)基因, 并對(duì)其進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析、基因拷貝數(shù)分析、染色體定位、進(jìn)化分析以及鰓組織在不同鹽度環(huán)境下的表達(dá)特征分析。與多數(shù)硬骨魚的研究相似[10, 13, 14, 25-27], 相較于高等脊椎動(dòng)物, 本研究中家族在花鱸中也出現(xiàn)顯著擴(kuò)增, 為理解硬骨魚的基因進(jìn)化和全基因組復(fù)制提供了一個(gè)理想模型。在硬骨魚中的注釋較為復(fù)雜, 如在斑馬魚中, 與人類有直系同源關(guān)系的基因以數(shù)字后綴命名(、等), 而斑馬魚相比于高等脊椎動(dòng)物所特有的基因則以字母后綴命名(、等)[25]。在紅鰭東方鲀的相關(guān)研究中, 所有的基因均以數(shù)字后綴命名[9]。Baltzegar等人在2013年對(duì)斑馬魚基因的注釋根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行了修訂[2]。本文通過與斑馬魚和紅鰭東方鲀的同源關(guān)系對(duì)花鱸的進(jìn)行注釋, 并通過系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證。對(duì)于產(chǎn)生擴(kuò)增且系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系聚類不好的基因拷貝(如)通過共線性分析對(duì)基因的注釋進(jìn)行進(jìn)一步驗(yàn)證。此外, 位于5號(hào)染色體上的通過串聯(lián)重復(fù)產(chǎn)生了一個(gè)旁系同源物, 二者所編碼的蛋白及理化性質(zhì)完全一致, 我們參考斑馬魚的注釋原則, 在本文中將其注釋為和。

表4 花鱸鰓中cldns基因在不同鹽度下的差異表達(dá)

續(xù)表

注: 數(shù)值代表log2(差異表達(dá)倍數(shù)); *: 顯著差異表達(dá)基因

在高等哺乳動(dòng)物的基因組中, 共發(fā)現(xiàn)27種[28], 而在硬骨魚中, 已經(jīng)有63個(gè)在16種硬骨魚中被發(fā)現(xiàn)。在本次研究中, 共獲得55個(gè)花鱸的。值得注意的是, 僅在硬骨魚中發(fā)現(xiàn)了直系同源基因的多拷貝現(xiàn)象, 表明硬骨魚基因相較于高等脊椎動(dòng)物的顯著擴(kuò)增與硬骨魚的全基因組復(fù)制(WGD)有密切的關(guān)系。據(jù)報(bào)道, 這次硬骨魚特異的全基因組復(fù)制事件是導(dǎo)致硬骨魚物種多樣化的重要原因[29]。而全基因組復(fù)制事件后部分基因丟失而硬骨魚的基因數(shù)量卻是高等脊椎動(dòng)物的兩倍還多, 這表明單是WGD不足以解釋硬骨魚中基因的擴(kuò)增, 例如本研究中5號(hào)和12號(hào)染色體上出現(xiàn)的多個(gè)基因形成的基因簇解釋了該現(xiàn)象。在基因復(fù)制事件后, 產(chǎn)生的新基因存在3種情況: 1) 丟失(例如成為假基因或沉默基因); 2) 關(guān)鍵通路的效能需增加一倍; 3) 有足夠的環(huán)境選擇壓力來推動(dòng)新功能的發(fā)展, 新基因保存下來并獲得新的功能[30-31]。為此, 我們對(duì)花鱸的基因進(jìn)行了選擇壓力分析, 枝模型和位點(diǎn)模型的計(jì)算結(jié)果表明,基因家族整體主要受負(fù)選擇。枝位點(diǎn)模型的計(jì)算結(jié)果表明, 在不同的主要分枝上, cldns蛋白的某些氨基酸位點(diǎn)受正選擇作用。所篩選到的正選擇位點(diǎn)主要分布在cldns蛋白跨膜區(qū)域, 這些位點(diǎn)上的正選擇壓力可能是不同基因的組織表達(dá)特異性和功能多樣性的重要原因。

由于鰓組織與周圍水環(huán)境直接接觸, 因此其對(duì)維持硬骨魚體內(nèi)的穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。幾十年來, 人們普遍認(rèn)為鰓上皮的不同的旁細(xì)胞特性對(duì)鰓組織的功能至關(guān)重要[12], 但是鰓組織緊密連接復(fù)合蛋白的分子生理學(xué)直到近幾年才成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)[1]?；蛟邛w組織中的重要性已經(jīng)在多個(gè)硬骨魚中進(jìn)行探討[10, 32], 并在多中硬骨魚的鰓組織中找到至少44個(gè)[1]。一些研究表明, 當(dāng)青斑河豚和雙斑鲀由海水轉(zhuǎn)入淡水的低滲環(huán)境后,和亞型的mRNA表達(dá)量上調(diào), 表明該的功能可能是形成細(xì)胞間屏障以限制體內(nèi)離子的流失[16, 33]。本研究中, 我們同樣發(fā)現(xiàn)花鱸在淡水中的表達(dá)量顯著高于等滲水中, 且高于其在海水中的表達(dá)量; 此外,在淡水中的表達(dá)量顯著高于其在海水中的表達(dá)量, 且表達(dá)量在海水、等滲水和淡水中逐級(jí)上調(diào), 表明在低滲環(huán)境下同樣起到細(xì)胞間“屏障”功能, Engelund等人對(duì)大西洋鮭的研究結(jié)果與上述結(jié)果一致, 其將大西洋鮭的轉(zhuǎn)染至哺乳動(dòng)物的腎臟細(xì)胞系后降低了上皮細(xì)胞的電導(dǎo)率和一價(jià)陽離子的細(xì)胞旁通路滲透性[34]。對(duì)斑馬魚和大西洋鮭的研究表明, 在高滲環(huán)境下,的mRNA水平上調(diào), 作為離子細(xì)胞(MRCs)和附屬細(xì)胞(AC)間的“泄漏孔洞”使體內(nèi)多余的Na+排出體外[13-14, 25], 而在本研究中卻相反,、和在高滲環(huán)境中的表達(dá)較低, 在淡水中的表達(dá)顯著高于海水中的表達(dá), 且未在鰓組織中發(fā)現(xiàn)在高滲環(huán)境顯著上調(diào)的基因。推測(cè)由于各物種應(yīng)對(duì)環(huán)境鹽度變化的響應(yīng)機(jī)制具有物種特異性, 以及實(shí)驗(yàn)處理的條件不同、實(shí)驗(yàn)用魚的規(guī)格不同所導(dǎo)致。關(guān)于花鱸的基因在應(yīng)對(duì)環(huán)境鹽度變化的具體功能, 還需進(jìn)一步深入研究。

4 結(jié)論

本研究在花鱸全基因組范圍內(nèi)共鑒定獲得55個(gè)基因, 通過系統(tǒng)發(fā)育和共線性分析確保了基因注釋的準(zhǔn)確性; 基因拷貝數(shù)和染色體定位分析證實(shí)硬骨魚基因家族擴(kuò)增為全基因組復(fù)制和串聯(lián)重復(fù)事件共同作用的結(jié)果; 選擇壓力分析表明花鱸基因家族整體處于負(fù)選擇, 但在蛋白的跨膜區(qū)域存在14個(gè)受環(huán)境正選擇作用的氨基酸位點(diǎn), 這些位點(diǎn)上的正選擇壓力可能是基因多樣性和功能分化的重要依據(jù); 此外, 在不同的鹽度環(huán)境下, 鰓組織中共有6個(gè)基因呈現(xiàn)顯著的差異表達(dá), 表明它們?cè)趹?yīng)對(duì)鹽度環(huán)境變化時(shí)發(fā)揮潛在作用。

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Identification and evolutionary analysis of Claudins gene family in spotted sea bass and its expression characteristics in gill tissue under different salinity

LI Jun-jie, YU Peng, Li Yun, TIAN Yuan, ZHANG Kai-qiang, WANG Hai-liang, QI Xin, Wen Hai-shen

(The Key Laboratory of Mariculture, Ministry of Education, Ocean University of China, Qingdao 266003, China)

Claudin (cldn) is an important functional and structural component of the intercellular tight junction protein, which is involved in the regulation of osmotic pressure balance by controlling the permeability of cellular bypass pathways. In the present study,gene family was systematically identified and characterized in spotted sea bass (). The results showed that there were 55 members ingene family of spotted sea bass, which were distributed on 16 chromosomes. Among them, 34 members have their direct homologous genes in mammals, and the remaining 21genes seemed to be teleosts-specific. Selection pressure analysis showed that 14 amino acid sites were positively selected in the predicted transmembrane region of cldns protein, which may be associated with the gene diversity and functional differentiation within the family. Additionally, the expression levels of at least 24genes were detected in the transcriptome of gills in spotted sea bass and、、、andshowed significant expression differences between different salinity environment, suggesting their key roles in regulating osmotic pressure balance in gills of spotted sea bass. This study provides a theoretical basis for studying the osmotic regulation mechanism ofgene family in spotted sea bass and other teleosts.

gene family;; salinity; evolutionary analysis

Feb. 3, 2021

S917.4

A

1000-3096(2022)08-0065-14

10.11759/hykx20210203001

2021-02-03;

2021-03-09

國家自然科學(xué)基金課題(32072947); 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系專項(xiàng)(CARS-47)

[National Natural Science Foundation of China, No. 32072947; China Agriculture Research System, No. CARS-47]

李俊杰(1996—), 男, 江蘇蘇州人, 碩士研究生, 研究方向?yàn)轸~類生理與繁育, E-mail: 1121938079@qq.com; 溫海深(1963—),通信作者, 男, 教授, 研究方向?yàn)轸~類生理與繁育, E-mail: wenhaishen@ouc.edu.cn

(本文編輯: 楊 悅)