趙帥 陳燕虹 莊杰欽 高煥佳 蔡海榮 陳伯鈞

(廣州中醫(yī)藥大學(xué) 1第二附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510120；2第二臨床醫(yī)學(xué)院)

現(xiàn)今，我國霧霾天氣日益嚴(yán)峻，不僅影響了生態(tài)環(huán)境，還對人體的健康造成了威脅〔1～3〕。而PM2.5(顆粒物粒徑動態(tài)直徑<2.5 μm)作為霧霾天氣的罪魁禍?zhǔn)住?〕，其主要來源有燃煤、機(jī)動車尾氣排放、工業(yè)生成過程及其他排放源(地面揚塵、溶劑揮發(fā)、植物、農(nóng)業(yè)及生物質(zhì)的燃燒等)〔5〕。長期暴露于PM2.5環(huán)境中會導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能受損從而加速動脈粥樣硬化(AS)的發(fā)展〔6〕。內(nèi)皮功能的損傷與AS的發(fā)病機(jī)制息息相關(guān)，內(nèi)皮受損可使平滑肌細(xì)胞增生、脂質(zhì)沉積、白細(xì)胞黏附、粥樣斑塊脆性增多與破裂，引起血栓形成，是引發(fā)心血管疾病共同的生理病理基礎(chǔ)，引起AS形成的關(guān)鍵。因此，對內(nèi)皮功能的紊亂采取干預(yù)措施，已然是防治AS的緊要環(huán)節(jié)。

炎癥反應(yīng)是引起血管內(nèi)皮功能損傷的重要機(jī)制，而核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB信號通路在炎癥中起著極其重要的作用，其下游主要因子為腫瘤壞死因子(TNF)-α。肝X受體(LXR)α具有調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝及炎癥反應(yīng)的作用，還可以影響TNF因子。本研究以吸入機(jī)動車尾氣作為暴露于霧霾的一種手段，通過制備相關(guān)空氣污染的動物模型，以炎癥通路為干預(yù)靶點，探討疏肝溫膽湯對動脈血管內(nèi)皮損傷的影響及可能機(jī)制，為中醫(yī)藥治療血管內(nèi)皮損傷提供思路和方法。

1 材料與方法

1.1試劑和儀器 LXRα、TNF-α、NF-κB用Primer Premier5軟件設(shè)計；戊二醛磷酸緩沖液；全自動生化分析儀；Agilent Stratagene熒光定量PCR儀Mx3000P；JEM-2000EX型透射電鏡；離心機(jī)等均由廣州醫(yī)科大學(xué)實驗室提供。

1.2動物 從廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心購入雄性健康成年SD大鼠20只，體重約130 g，許可證號：SCXK(粵)2013-002，生產(chǎn)批號：44007200038004。

1.3實驗藥物的制備 疏肝溫膽湯(陳皮15 g、竹茹12 g、半夏10 g、枳實15 g、甘草6 g、茯苓20 g、柴胡12 g、白芍15 g、丹參15 g)，藥物批號：161102201，以上藥材均由廣東省中醫(yī)院中藥房提供，按成年人60 kg體重劑量的4倍水煎濃縮至含生藥1.24 g/ml，高壓滅菌，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4暴露及干預(yù)方式 將暴露組和藥物組置于機(jī)車尾氣暴露房，關(guān)閉暴露房，打開機(jī)車開關(guān)，擰動引擎5 min，后關(guān)閉開關(guān)，打開暴露房內(nèi)的小電扇使暴露均勻，如此暴露6 h后搬出動物，藥物組用疏肝溫膽湯按照1 ml/100 g的比例進(jìn)行灌胃。如此暴露及干預(yù)2個月。對照組飼養(yǎng)于實驗室過濾空氣環(huán)境。

1.5C反應(yīng)蛋白(CRP)水平測定 于2個月干預(yù)結(jié)束時，動脈采血5 ml，以4℃ 3 000 r/min離心15 min后取上層血清，用生化分析儀檢測CRP水平。

1.6組織病理學(xué)觀察 采血結(jié)束后，立即開胸取主動脈約2 cm，用戊二醛磷酸緩沖液固定，不超出3 d，經(jīng)磷酸緩沖液沖洗，用1%鋨酸加0.8%鐵氰化鉀固定，再經(jīng)磷酸緩沖液漂洗，行梯度丙酮脫水，包埋，聚合。先制成半薄切片，用光鏡觀察定位于血管內(nèi)膜部位。然后切成70～80 nm的超薄切片，置于附有支持膜的銅網(wǎng)上，用5%的水性醋酸鈾染色，再用枸櫞酸染色5 min后用透射電鏡觀察并拍照。

1.7采用RT-PCR檢測肝臟組織內(nèi)LXRα、TNF-α、NF-κB的mRNA表達(dá)水平 收集肝臟組織，提取組織RNA，紫外分光光度計測定組織RNA分別在280nm和260nm處的吸光度值(OD)，并計算RNA的含量及純度。從組織總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成總cDNA，然后稀釋探針及引物，依次加入每管中，用Agilent Stratagene熒光定量PCR儀Mx3000P 94℃ 2 min，94℃ 20 s，58℃ 20 s，40個循環(huán)，記錄結(jié)果。檢測基因的序列、產(chǎn)物長度見表1。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗、方差分析、秩和檢驗、χ2檢驗、多因素重復(fù)測量方差分析。

表1 PCR 引物序列及產(chǎn)物片段長度

2 結(jié) 果

2.1藥物對LXRa、TNF-α、NF-κB的mRNA表達(dá)水平的影響 暴露組肝臟LXRa mRNA水平較對照組顯著下降，肝臟內(nèi)NF-κB、TNF-α mRNA水平較對照組顯著升高(P<0.05)。藥物組肝臟LXRα mRNA水平較暴露組顯著升高，肝臟NF-κB、TNFα mRNA水平較暴露組顯著下降(P<0.05)。見表2。

表2 各組TNF-α、LXR-α、NF-κB mRNA表達(dá)

2.2CRP水平 暴露組CRP水平較對照組顯著升高〔(0.48±0.08)mmol/L vs (0.20±0.08)mmol/L〕，而藥物組CRP水平〔(0.27±0.15)mmol/L〕較暴露組顯著下降(均P<0.05)。

2.3組織病理學(xué)檢測

2.3.1蘇木素-伊紅(HE)染色觀察 對照組：血管內(nèi)皮細(xì)胞呈梭形，結(jié)構(gòu)較完整，排列較整齊，大小較一致。暴露組：血管內(nèi)膜增厚，內(nèi)皮細(xì)胞減少，結(jié)構(gòu)不完整，排列紊亂，中可見較多中性粒細(xì)胞(黑色箭頭所指)。藥物組：內(nèi)膜未見明顯增厚，細(xì)胞結(jié)構(gòu)及排列尚規(guī)整，未見炎癥細(xì)胞。見圖1。

2.3.2掃描電鏡觀察 對照組：內(nèi)皮完整，內(nèi)皮細(xì)胞呈梭形，排列交錯，細(xì)胞間緊密連接。暴露組：內(nèi)皮細(xì)胞收縮，細(xì)胞間隙增大，部分內(nèi)皮細(xì)胞脫落，形成脫失區(qū)中可見較多泡沫細(xì)胞及炎癥細(xì)胞(黑色箭頭指代炎癥細(xì)胞浸潤，紅色箭頭指代泡沫細(xì)胞)。藥物組：內(nèi)皮尚規(guī)整，細(xì)胞間連接較疏松，未見細(xì)胞間隙開大及內(nèi)皮細(xì)胞崩解。見圖2。

圖1 各組胸主動脈組織病理學(xué)(HE染色，×100)

圖2 各組胸主動脈掃描電鏡

3 討 論

血管內(nèi)皮功能的損傷與AS的發(fā)生發(fā)展直接相關(guān)，內(nèi)皮損傷已成為心血管病發(fā)病的獨立危險因素〔7,8〕。炎癥反應(yīng)是內(nèi)皮損傷的主要機(jī)制，單核/巨噬細(xì)胞激活、滲出、分化和泡沫細(xì)胞的形成是AS斑塊典型的特征。目前研究證明，炎癥因子直接參與AS的形成〔9,10〕。hs-CRP可使炎癥細(xì)胞向血管內(nèi)皮遷徙，使單核、淋巴細(xì)胞激活，使AS發(fā)展〔11〕?？杉せ頝F-κB是促炎癥基因表達(dá)的關(guān)鍵，NF-κB 通過促使局部炎癥和細(xì)胞因子轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)，使白細(xì)胞及黏附因子的表達(dá)增加，使中膜平滑肌細(xì)胞向內(nèi)膜遷徙，單核細(xì)胞堆積、浸潤，從而導(dǎo)致AS形成〔12〕。在刺激因子的誘導(dǎo)下，NF-κB活化后可調(diào)控一些基因的表達(dá)，而前炎癥性細(xì)胞因子TNF-α是NF-κB通路重要的下游調(diào)控因子〔13〕。TNF-α因子能夠誘導(dǎo)白細(xì)胞介素(IL)-6、IL-10等炎性細(xì)胞的釋放，損傷血管內(nèi)皮。LXR表達(dá)于巨噬細(xì)胞，是膽固醇在斑塊中代謝的重要的信號通路〔14〕。研究發(fā)現(xiàn)LXR不僅參與調(diào)節(jié)膽固醇的逆轉(zhuǎn)運，而且在炎癥調(diào)控方面起關(guān)鍵作用。LXR具有抗炎的作用，可以通過對炎癥因子表達(dá)的調(diào)控，參與機(jī)體炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)〔15,16〕。巨噬細(xì)胞在炎癥及免疫反應(yīng)中起到至關(guān)重要的作用，能被內(nèi)毒素通過 Toll 樣受體(TLR)4通路激活釋放炎癥介質(zhì)，其中內(nèi)毒素主要為革蘭陰性桿菌細(xì)胞壁中的脂多糖(LPS)成分。在人體中，LXR可以增加TLR4的表達(dá)，并增強(qiáng)TLR4對LPS的反應(yīng)性〔17〕。而且LXR的激活對經(jīng)由TLR4通路增強(qiáng)的免疫炎癥反應(yīng)起著允許作用〔18〕。有研究提及 LXRs 的激動劑能壓制一些炎癥因子表達(dá)，其中包括：TNF-α、CRP等〔19〕。LXR 激動劑作用于人單核巨噬細(xì)胞，可抑制TNF-α在核酸和蛋白質(zhì)水平上的表達(dá)，起到保護(hù)血管內(nèi)皮功能的作用〔19〕。LXR具有調(diào)節(jié)體內(nèi)生理活動和基因的作用〔20〕，目前已知LXR有兩種同源亞型:LXRα和LXRβ，其中LXRα是一種核受體〔21〕，在與脂代謝緊密相關(guān)的組織如肺、脂肪組織、小腸、腎上腺、腎和巨噬細(xì)胞中高度表達(dá)，但在肝中含量最豐富。本研究結(jié)果說明疏肝溫膽湯在抑制炎癥方面發(fā)揮顯著療效。

疏肝溫膽湯是陳伯鈞教授治療AS的經(jīng)驗方，由溫膽湯和柴胡疏肝散化裁而成，全方共七味藥物，具有化痰祛瘀、疏肝理氣的功效。疏肝溫膽湯可以使AS患者的癥狀得到改善。前期實驗研究表明疏肝溫膽湯能夠使血脂水平降低，AS斑塊面積縮小、動脈硬化程度減輕，且已證實疏肝溫膽湯可以使LXRα的表達(dá)上調(diào)。疏肝溫膽湯中柴胡疏肝解郁以理氣和肝膽；芍藥柔肝養(yǎng)陰；竹茹清熱化痰，止嘔除煩；法半夏燥濕降逆以和胃；茯苓健脾滲濕；枳殼、陳皮行氣導(dǎo)滯以疏通氣機(jī)；川芎活血化瘀，行氣止痛以通達(dá)肝脾；甘草和中緩?fù)?。諸藥共濟(jì)，合以法暢。此方以疏肝理氣為主，兼以養(yǎng)肝，調(diào)血和胃。臨床上應(yīng)用疏肝理氣方藥能改善血管內(nèi)皮功能〔22〕，疏肝的方法也能改善血脂狀況〔23〕，疏肝理氣要藥柴胡有抗炎、抗氧化、穩(wěn)定細(xì)胞膜、抑制血管通透性增加等作用〔24〕。因此，疏肝解郁、調(diào)理氣機(jī)對于AS的預(yù)防及其引發(fā)的心腦血管病有多方面的作用機(jī)制。

綜上，在對機(jī)動車尾氣誘導(dǎo)所致血管內(nèi)皮損傷的大鼠中，應(yīng)用疏肝溫膽湯進(jìn)行干預(yù)能取得令人滿意的效果，可以明顯降低機(jī)車尾氣對血管內(nèi)皮造成的影響，改善血管內(nèi)皮損傷，升高肝臟LXRα水平，降低肝臟NF-κB、TNFα、血清CRP，這為心血管內(nèi)皮損傷疾病的中醫(yī)治療方面提供了一定的思路和理論基礎(chǔ)。但本實驗中樣本量較少，需擴(kuò)大樣本量以進(jìn)一步研究。