李仟 羅太富 馮梓琦 朱玲 萬莉紅△ 江舟

（1. 四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院基礎醫(yī)學2018 級，四川 成都 610041；2. 四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院基礎醫(yī)學2020 級，四川 成都 610041；3. 四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院基礎醫(yī)學2019級，四川 成都 610041；4. 四川大學華西基礎醫(yī)學與法醫(yī)學院藥理學教研室，四川 成都 610041；5. 國家衛(wèi)生健康委員會時間生物學重點實驗室（四川大學），四川 成都 610041）

膿毒癥（Sepsis）是由細菌等病原微生物侵入機體引起的全身炎癥反應綜合征，常以彌漫性腦功能障礙為首發(fā)表現(xiàn)[1]。患者臨床上主要表現(xiàn)為躁動、注意力下降、意識改變、睡眠節(jié)律紊亂、譫妄等，且患者可能存在長期的認知功能障礙，嚴重影響生活質(zhì)量和自理能力[2]。因此明確發(fā)病機制，尋找診斷、治療的新靶點刻不容緩。

缺氧誘導因子-1α（Hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）是細胞和機體對缺氧穩(wěn)態(tài)反應的重要調(diào)節(jié)因子，可通過激活多種基因的轉(zhuǎn)錄，參與包括能量代謝、血管生成、細胞凋亡等多種生命體活動[3,4]。研究表明，HIF-1α 在膿毒癥引起的肺組織、心肌組織損傷中均明顯上調(diào)[5,6]，可見在膿毒癥發(fā)生發(fā)展中HIF-1α 發(fā)揮重要作用。目前認為在HIF-1α 的作用下，丙酮酸由進入三羧酸循環(huán)，轉(zhuǎn)變?yōu)橹苯由蔀槿樗?，導致大量乳酸堆積進而激活炎癥反應、補體系統(tǒng)等，最終引起組織的損傷和死亡[7]?；罨牡鞍准っ窩 受體1（Receptor for activated C kinase 1，RACK1）作為體內(nèi)廣泛表達的一種支架蛋白，具有調(diào)節(jié)細胞生長、自噬、免疫等多種重要作用[8]。目前研究表明，RACK1 作為HIF-1α 的負調(diào)控因子，可通過泛素化途徑降解HIF-1α[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生認知功能障礙的膿毒癥小鼠同時出現(xiàn)腦葡萄糖代謝下降以及RACK1 表達降低，可見調(diào)控RACK1/HIF-1α 通路有可能成為耐缺氧藥物的潛在靶點。

芫根是西藏道地食、藥、飼三用植物，資源豐富。在藏醫(yī)典籍《甘露本草明鏡》、《四部醫(yī)典》、《新編藏醫(yī)學》等中均記載有，芫根具有耐缺氧、緩解疲勞、延緩衰老等功效。當?shù)夭孛癯⑵鋾癯筛墒秤?，以緩解頭暈頭痛等高原反應。前期研究發(fā)現(xiàn)，芫根提取液灌胃可明顯降低小鼠血清乳酸水平，增加乳酸脫氫酶活性，同時影響HIF-1α的表達。本文擬從RACK1/HIF-1α 通路初步探究芫根對膿毒癥小鼠認知功能的改善作用，為開發(fā)芫根藥用價值提供初步的理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑

芫根提取液是阿壩州新鮮芫根交由四川小葉本草生物科技有限公司加工提取而成，LPS（Sigma，美國），生理鹽水（科倫，中國），BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒（上海碧云天生物技術有限公司，中國上海），RACK1 鼠單克隆抗體（CST，美國，稀釋比 1:1000），HIF-1α 兔單克隆抗體（Immunoway，美國，稀釋比1:1000），β-Actin 鼠單克隆抗體（CST，美國，稀釋比1:1000），辣根酶標記羊抗免IgG（中杉金橋，中國，稀釋比1:10000），辣根酶標記羊抗小鼠IgG（中杉金橋，中國，稀釋比1:10000），聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（Millipore, Billerica, MA，USA）。

1.1.2 動物

SPF 級KM 雄性小鼠21 只，6-8 周齡，購自成都達碩實驗動物有限公司（中國，成都），飼養(yǎng)于5 個獨立送風隔離籠具中，光暗循環(huán)12:12，溫度22℃、濕度55%。

1.2 方法

1.2.1 小鼠分組與模型的建立

將21 只雄性KM 小鼠適應性喂養(yǎng)3 d 后，根據(jù)體重隨機分為：對照組（n=4）：腹腔注射生理鹽水，模型組（n=8）：生理鹽水灌胃+腹腔注射LPS，治療組（n=9）：芫根灌胃+腹腔注射LPS。所有小鼠按照分組連續(xù)灌胃給藥，每日一次，每次灌胃量為20 mL·kg-1。灌胃結束后次日腹腔注射LPS 10 mg·kg-1建立膿毒癥小鼠模型。

1.2.2 腦組織病理學HE 檢測

連續(xù)灌胃給藥7 d 后，模型組及治療組各隨機抽取4 只小鼠腹腔注射LPS 構建膿毒癥小鼠模型，次日經(jīng)戊巴比妥鈉深度麻醉后取腦，置于4%多聚甲醛中固定48 h 后，依次等級脫水、石蠟包埋、蘇木素-伊紅（HE）染色。使用光學顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元形態(tài)變化。

1.2.3 曠場實驗

剩余小鼠連續(xù)灌胃給藥14 d 后，LPS 腹腔注射構建膿毒癥模型。造模后第7 d 進行曠場實驗。采用規(guī)格（100×100×40）cm 的曠場箱，平均分為25 份。將小鼠從中央?yún)^(qū)域放入曠場中心，記錄300 s 內(nèi)小鼠在中央、角落、四周區(qū)域的停留時間，以及總運動時間。中央?yún)^(qū)域停留時間越長，角落及四周停留時間越短，總運動時間越長說明小鼠抗焦慮能力越強。

1.2.4 蛋白提取及Western blotting

曠場實驗結束后，經(jīng)戊巴比妥鈉深度麻醉小鼠取腦，每克組織加入5 mL 裂解液（RIPA :PMSF=100 : 1）勻漿后置于冰上裂解30 min，隨后4°C、13000 g 離心10 min 收集上清，獲得總蛋白。使用BCA 試劑盒（凱基生物公司）測定蛋白濃度；經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、4°C 一抗孵育過夜、洗膜、二抗室溫孵育2 h、洗膜、曝光后，采用Quantity ONE 軟件以β-actin 為內(nèi)參進行半定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)使用SPSS 21.0 軟件進行統(tǒng)計學分析，計量資料以均值±標準差（±SD）表示，組別之間比較采用t檢驗（Student's t test）分析；P＜0.05 被認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 芫根對膿毒癥小鼠認知功能障礙的改善作用

在曠場實驗中，對照組小鼠運動軌跡分布較均一；模型組小鼠與對照組相比：角落區(qū)域的停留時間及總靜止時間明顯增加，中央?yún)^(qū)域及四周區(qū)域停留時間減少；而與模型組相比，芫根治療組小鼠角落區(qū)域停留時間以及總靜止時長明顯減少（P＜0.05），四周區(qū)域、中央?yún)^(qū)域停留時間明顯增加（P＜0.05），見圖1。

2.2 芫根對膿毒癥小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元損傷的保護作用

HE 染色顯示，對照組小鼠海馬神經(jīng)元細胞帶致密、整齊、均勻，細胞形態(tài)結構正常；模型組小鼠海馬神經(jīng)元細胞層次欠清晰，細胞帶寬度變窄，細胞排列松散紊亂，形態(tài)異常，大量神經(jīng)元細胞變性、壞死，細胞結構遭到破壞，細胞質(zhì)嗜酸性增強，細胞核固縮濃染，界限不清；芫根治療組小鼠海馬神經(jīng)元排列較為緊密，層次清晰，神經(jīng)元結構較完整，細胞核固縮濃染有不同程度減輕，見圖2。

圖1 曠場實驗測定芫根對膿毒癥小鼠認知功能的影響

圖2 芫根對膿毒癥小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元形態(tài)的影響（HE 染色）

2.3 芫根對膿毒癥小鼠腦RACK1/HIF-1α 的調(diào)節(jié)作用

與對照組小鼠相比，LPS 誘導膿毒癥小鼠腦RACK1 蛋白水平明顯降低（P＜0.05），HIF-1α 蛋白水平增高；經(jīng)芫根灌胃后小鼠腦RACK1 蛋白水平相對模型組有所升高，而HIF-1α 的蛋白水平相對降低，見圖3。

圖3 芫根對膿毒癥小鼠腦RACK1/HIF-1α 的影響

3 討論

膿毒癥患者常出現(xiàn)神經(jīng)系統(tǒng)嚴重并發(fā)癥，因此認知功能障礙患病率高，常出現(xiàn)注意力、記憶力下降以及焦慮、抑郁等情緒改變，影響患者正常的生活[10]。本研究采用曠場實驗評價不同組別小鼠在曠場箱中不同位置的活動時間，發(fā)現(xiàn)膿毒癥小鼠總運動時間明顯減少，但中央及四周區(qū)域的活動相對增多，提示膿毒癥小鼠出現(xiàn)明顯的焦慮情緒，而給予芫根預處理后可在一定程度上改善小鼠的焦慮情緒，說明芫根可能具有改善膿毒癥腦病認知功能的作用。

海馬組織在大腦的學習和記憶等方面發(fā)揮著重要作用?；趪X類動物模型的數(shù)據(jù)表明，腹側海馬體與情緒、壓力、情感有關，而背側海馬體則與學習、記憶、空間導航等相關[11]。因此腹側海馬病變的動物可出現(xiàn)明顯的焦慮行為，如明暗探索測試中，從黑盒到白盒的速度更快，在噬食癥測試中，開始進食的速度更快等[12,13]。目前研究發(fā)現(xiàn)膿毒癥患者海馬區(qū)明顯萎縮[14]。本研究結果顯示，經(jīng)LPS 腹腔注射誘導膿毒癥后，小鼠海馬組織神經(jīng)元細胞結構破壞，大量神經(jīng)元細胞變性、壞死，這與之前的報道結果一致[15]；而經(jīng)芫根預處理后小鼠神經(jīng)元結構破壞明顯減少，說明芫根對海馬區(qū)神經(jīng)元損傷具有一定的保護作用。

本研究進一步通過WB 測定膿毒癥小鼠腦RACK1 和HIF-1α 的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)經(jīng)腹腔注射誘導膿毒癥后，模型組小鼠的RACK1 表達降低，與我們之前證實RACK1 在學習記憶的形成和維持以及情緒改變中至關重要再次吻合[16]；同時我們發(fā)現(xiàn)RACK1 所調(diào)控的 HIF-1α 表達升高，也與既往研究認為RACK1 負性調(diào)控HIF-1α 一致[9]，然而由于本次實驗樣本量有限，目前對于HIF-1α的數(shù)據(jù)統(tǒng)計未見差異、僅有趨勢，未來將通過進一步擴大樣本量進行證明。

經(jīng)芫根治療后膿毒癥小鼠腦RACK1/HIF-1α表達有所逆轉(zhuǎn)，但也因樣本數(shù)量的限制而未見統(tǒng)計學差異，但趨勢明顯。

綜上所述，芫根防治膿毒癥小鼠產(chǎn)生焦慮情緒的作用確切，其機制可能與調(diào)控RACK1/HIF-1α、保護海馬神經(jīng)元有關。未來將通過擴大樣本量，增加糖代謝重編程等相關因子測定進一步深入研究芫根的藥用價值。