殷 艷，韋業(yè)平，麥 虹，張麗瀅

(廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院，廣西南寧 530007)

宮頸癌是常見的婦科惡性腫瘤，其發(fā)病率位居全球女性惡性腫瘤第四位，是女性癌癥死亡的第四大原因[1]。每年我國的宮頸癌新發(fā)病例大約有106 000例，我國與印度的新發(fā)病例約占全世界的1/3，是發(fā)達國家的6倍[2]。

大量研究已經證實，持續(xù)感染高危型人乳頭瘤病毒(Human Papilloma Virus，HPV)是宮頸上皮內瘤變(Cervical Intraepithelial Neoplasia,CIN)及宮頸癌的主要原因。C-myc基因能夠促進細胞增殖，是與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關的原癌基因，它參與了多種惡性腫瘤(如乳腺癌、胃癌、結腸癌等)的發(fā)生發(fā)展[3]，可能是宮頸癌的一種潛在標志物。E2F1蛋白在細胞周期調控方面發(fā)揮著重要作用，在多種腫瘤(如肺癌、乳腺癌、子宮內膜癌)細胞呈高表達，表現為促癌基因的作用[4]。目前，關于E2F1蛋白在宮頸癌中的具體作用機制尚不明確。宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程較長，約10-15 a，其處于CIN狀態(tài)的時間較長，可以有很多機會發(fā)現病變。目前，發(fā)達國家通過有效的篩查方法和廣泛的注射HPV疫苗，已使宮頸癌的發(fā)病率大大降低，但發(fā)展中國家仍面臨著巨大的經濟負擔和社會負擔。因此，臨床上開展早期篩查、分流管理及適當干預治療至關重要。

本研究通過檢測高危型HPV(16，18，31，33，35，39) DNA、C-myc基因及E2F1蛋白在不同宮頸組織中的表達情況，探討其與宮頸癌的相關性及聯合檢測對于篩查宮頸癌的臨床應用價值，旨在進一步提高宮頸癌的早期確診率，為患者病情評估及干預治療提供參考。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選擇2016年1月至2020年6月廣西醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院的活檢及手術切除的宮頸組織石蠟標本100例，包括正常宮頸組織20例為對照組，患者年齡為35-65歲，平均為(46±12.3)歲；宮頸病變80例為實驗組，包括CIN Ⅰ級20例，CIN Ⅱ-Ⅲ級30例，宮頸鱗狀細胞癌30例，患者年齡為25-66歲，平均為(46±16.5)歲。其中，宮頸鱗狀細胞癌中臨床分期Ⅰ期20例，Ⅱ期10例；分化程度Ⅰ-Ⅱ級17例，Ⅲ級13例；淋巴結轉移陰性11例，陽性19例。兩組之間的一般資料差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。病例納入標準：(1)既往無宮頸物理治療及手術史；(2)無其他惡性腫瘤病史；(3)未接受過放化療及腫瘤藥物治療；(4)所有病理結果均經病理科兩位高級職稱醫(yī)師審核確定。

1.2 主要試劑

生物素標記的高危型HPV探針、原位雜交試劑盒購自福建泰普生物科學有限公司；C-myc和E2F1單克隆抗體購自廣西卓一生物技術有限公司。

1.3 方法

1.3.1 固態(tài)石蠟標本制作

組織標本離體后立即進行取材、固定、脫水、透明、浸蠟、包埋等步驟，制作石蠟標本并常溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 原位雜交技術檢測

將組織切成4 μm的薄片，APES處理后烤片，二甲苯脫蠟3次，每次10 min，分別于100%、95%、80%的乙醇溶液脫水3 min，用蒸餾水沖洗3 min，放入盛有雜交增強液的容器里，微波爐高溫處理20 min，自然冷卻至室溫后，用蒸餾水沖洗2 min，擦干。然后再添加探針，蓋上蓋玻片，置于原位雜交儀上95℃變性5 min，37℃培養(yǎng)箱中雜交過夜。用PBS緩沖液浸片，蓋玻片脫落后，用PBS緩沖液沖洗10 min。滴加適量一抗，放入濕盒中37℃孵育30 min，PBS緩沖液洗滌3次，每次2 min。滴加適量二抗，濕盒中37℃孵育30 min，PBS緩沖液沖洗3次，每次2 min。然后再添加DAB顯色劑，PBS緩沖液終止顯色。自來水充分沖洗，蘇木精復染，鹽酸乙醇分化，氨水反藍，乙醇脫水，二甲苯透明，樹膠封片。結果判定：高危型HPV DNA原位雜交陽性細胞為細胞核內棕黃色點、片狀著色。

1.3.3 免疫組織化學法檢測

石蠟切片常規(guī)脫蠟、水化，放入盛有EDTA修復液的容器里，微波爐高溫處理10 min后進行抗原修復。蒸餾水沖洗3次，每次1 min，放入3% H2O2溶液浸片10 min，蒸餾水沖洗3次，每次1 min，甩干擦凈后，滴加3% BSA,放入濕盒中封閉1 h。滴加一抗，4℃過夜，TBST沖洗4次，每次30 s。滴加二抗，37℃孵育30 min，TBST沖洗4次，每次30 s。滴加DAB液，蒸餾水充分沖洗，蘇木精復染，梯度酒精及二甲苯脫水，樹膠封片。結果判定：C-myc基因、E2F1蛋白免疫組織化學陽性細胞均為細胞核內棕黃色染色。

1.4 統(tǒng)計分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數資料以例數或百分率表示，組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Spearman等級相關分析法，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果與分析

2.1 不同宮頸組織中HPV DNA、C-myc基因和E2F1蛋白的表達情況

不同宮頸組織中HPV DNA、C-myc和E2F1的表達情況如表1所示。HPV DNA在正常宮頸組織中的陽性率為5.0%，在CINⅠ、CIN Ⅱ-Ⅲ、宮頸鱗狀細胞癌組織中的陽性率分別為15.0%、53.3%和80.0%，其陽性率呈明顯升高的趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=36.012，P<0.001)。C-myc基因在正常宮頸組織中無陽性表達；在CIN Ⅰ、CIN Ⅱ-Ⅲ組織中的陽性率分別為10.0%和36.7%，且表達強度增加；在宮頸鱗狀細胞癌組織中的陽性率為80.0%，呈強陽性表達；陽性表達率顯著增高，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=41.799，P<0.001)。E2F1蛋白在正常宮頸組織中陽性率為5.0%；在CIN Ⅰ、CIN Ⅱ-Ⅲ組織中的陽性率分別為25.0%、66.7%；在宮頸鱗狀細胞癌組織中的陽性率為90.0%，且為強陽性表達；陽性表達率有明顯增高的趨勢，差異有統(tǒng)計學意義(χ2=43.530，P<0.001)。病理染色結果如圖1、圖2所示。

表1 不同宮頸組織中HPV DNA、C-myc和E2F1的表達

圖1 CIN Ⅲ、宮頸鱗狀細胞癌HPV16/18原位雜交著色結果(40×)

圖2 C-myc、E2F1免疫組織化學染色結果(20×)

2.2 宮頸鱗狀細胞癌中HPV DNA、C-myc基因和E2F1蛋白表達的相關性分析

Spearman相關性分析結果顯示，HPV DNA與C-myc基因之間的表達呈明顯正相關(r=0.621，P<0.01),HPV DNA與E2F1蛋白之間的表達呈明顯正相關(r=0.579，P<0.01),C-myc基因與E2F1蛋白之間的表達呈明顯正相關(r=0.555，P<0.01)。

2.3 宮頸鱗狀細胞癌中HPV DNA、C-myc基因和E2F1蛋白與臨床病理的關系

在宮頸鱗狀細胞癌中HPV DNA、C-myc基因和E2F1蛋白的表達與臨床病理參數(分期、分化程度、淋巴結轉移情況)的關系見表2。結果顯示，C-myc基因的陽性表達率在分化程度Ⅲ級明顯高于Ⅰ-Ⅱ級，差異有顯著性(P<0.05)，而其余各項差異均無顯著性(P>0.05)。

表2 宮頸鱗狀細胞癌中HPV DNA、C-myc、E2F1與臨床病理關系

3 討論

腫瘤的發(fā)生是一個復雜的過程，是由多種因素協同作用的結果。流行病學研究顯示，近年來我國宮頸癌發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢，并且存在發(fā)病年齡年輕化的現象，20-30歲女性發(fā)病率上升[5]。宮頸癌最常見的病理類型為鱗狀細胞癌，其次為腺癌，其他類型的比較少見。

持續(xù)的高危型HPV感染是CIN和宮頸癌發(fā)生發(fā)展的必需條件之一[6]。研究已發(fā)現持續(xù)感染HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，56，58，59，68等高危類型病毒能引起CIN和宮頸癌，所以將這些HPV類型定義為“致癌”病毒類型[7]。高危型HPV感染后整合到宿主細胞基因組中，導致病毒癌基因E6和E7持續(xù)性表達，并與p53和Rb等抑癌基因結合使其失活，引發(fā)細胞異常增殖、凋亡，最終發(fā)生癌變。本研究證實，從正常宮頸組織到CIN各級病變，最終至宮頸鱗狀細胞癌，HPV DNA的陽性表達率呈升高趨勢，說明高危型HPV感染與CIN以及宮頸癌的發(fā)生進展有密切關系。

C-myc基因位于染色體8q24，是一種重要的核內癌基因，對多種惡性腫瘤均有特異性[8]。正常情況下C-myc基因由于受生長抑制信號和有絲分裂原的調控而處于低表達水平，從而維持正常的細胞活動。當高危型HPV持續(xù)感染宮頸細胞后，通過基因整合C-myc發(fā)生擴增或特異性重排，導致細胞中C-myc表達升高從而促進了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展[9]。有研究證實，從CIN Ⅰ發(fā)展至CIN Ⅲ直至宮頸癌，C-myc基因表達率明顯升高，并發(fā)現在接受化療后其表達降低[10]。本研究發(fā)現，在正常宮頸組織中C-myc基因無表達，而在宮頸病變組織中其陽性率和表達程度明顯增加，提示C-myc基因參與了宮頸癌的發(fā)生，其在CIN Ⅰ時被激活并逐漸積累，持續(xù)存在于整個癌變過程中，如C-myc基因異常表達，則患者可能已經存在CIN病變甚至是宮頸癌。該研究結果與Yang等[10]、盧建軍等[11]的研究結果一致，提示C-myc基因與宮頸病變的進展情況密切相關，對宮頸病變的篩查具有一定的價值。烏守恒等[12]報道了C-myc基因的表達與宮頸癌臨床分期、分化程度、淋巴結轉移有關，其高表達可能促進腫瘤的侵襲和轉移。本研究分析了C-myc基因與宮頸鱗狀細胞癌病理參數的關系，發(fā)現其表達與分化程度有關，隨著分化程度的增加而增加，提示C-myc基因表達檢測對預測宮頸癌進展、觀察病情有指導作用。

E2F1位于染色體20q11，是一種重要的轉錄促進因子，能夠調節(jié)細胞周期、細胞增殖、細胞凋亡和細胞分化等生物過程[13]。研究發(fā)現，E2F1在多種腫瘤如肺癌、乳腺癌、卵巢癌等組織細胞中高表達，發(fā)揮促癌基因的作用[14]。HPV感染宮頸細胞后，HPV E7致癌蛋白和低磷酸化的Rb基因結合，破壞了Rb/E2F1復合物，從而使E2F1得以釋放，促進組織細胞進入S期而加速細胞周期進程，導致細胞過度增殖，促進宮頸癌細胞增殖和腫瘤形成[15]。本研究結果顯示，E2F1的陽性表達率在CIN Ⅱ-Ⅲ及宮頸鱗狀細胞癌組織中明顯升高，提示E2F1過度表達能加速細胞周期及細胞增殖，在宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用。另外，關于E2F1與腫瘤臨床病理相關性的研究，其中在乳腺癌中E2F1與分化程度低及預后差密切相關；外陰癌中E2F1表達與FIGO分期有關；宮頸癌中E2F1與分期和腫瘤分化程度有關。本研究也分析了宮頸鱗狀細胞癌組織中E2F1與病理參數的關系，結果顯示E2F1與分期、分化程度、淋巴結轉移情況均無表達差異，考慮為樣本量較少所致。

宮頸癌的癌前病變期較長，有效篩查及處理是降低宮頸癌發(fā)病率的關鍵。目前，我國普遍使用液基薄層細胞學檢查(Thinprep Cytologic Test，TCT)聯合HPV的篩查方法，雖然能在早期篩查出宮頸病變，但是對于病變的進展和轉歸不能進行判斷和預測。何志連等[16]研究發(fā)現，HPV16/18表達與C-myc表達情況呈明顯正相關，推測C-myc基因是HPV16/18的靶基因。本研究發(fā)現，HPV DNA與C-myc基因、HPV DNA與E2F1蛋白、C-myc基因與E2F1蛋白之間的表達也存在密切的相關性，因此可作為宮頸病變早期篩查的生物學指標，聯合檢測對宮頸癌的診斷和評估具有重要的臨床意義。

4 結論

本研究表明，HPV DNA、C-myc基因及E2F1蛋白的表達均隨著宮頸病變的加重而增強。相關性分析顯示，HPV DNA與C-myc基因、HPV DNA與E2F1蛋白、C-myc基因與E2F1蛋白之間均呈正相關。C-myc基因在宮頸鱗狀細胞癌中的表達隨腫瘤分化程度的降低而增高，提示其與宮頸鱗狀細胞癌關系密切。今后還需進一步通過聯合檢測增加宮頸病變及宮頸癌的早期診斷，對高風險患者進行分流管理，適時干預治療，降低宮頸癌的發(fā)病率，這對于宮頸病變的診斷及監(jiān)測具有重要意義。