郎文萱，李曉辰，王藝穎，段云濤，王 鈺，魏鵬晟，李 雪，崔 躍，朱啟文*

0 引言

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是癡呆癥最常見的病因，導(dǎo)致記憶、行為和認(rèn)知功能逐漸喪失。AD增長(zhǎng)迅速，預(yù)測(cè)到2050年我國(guó)患病人數(shù)將達(dá)到2 687萬(wàn)[1]。盡管經(jīng)過(guò)幾十年的研究和藥物開發(fā)，仍然沒有治愈AD的方法，甚至沒有可行的長(zhǎng)期治療方案[2]。

神經(jīng)炎癥是AD的一種重要機(jī)制。Aβ的沉積會(huì)激活小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生更多的促炎因子[3]，隨著炎癥反應(yīng)的發(fā)展，小膠質(zhì)細(xì)胞釋放的促炎因子加劇了腦環(huán)境惡化[4]。研究表明，抑制神經(jīng)炎癥可以保護(hù)神經(jīng)元，減輕學(xué)習(xí)記憶障礙。短鏈脂肪酸(Short-chain fatty acids,SCFAs)是腸道微生物菌群的代謝產(chǎn)物，包括乙酸、丙酸、丁酸等[5]。SCFAs可以促進(jìn)腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)，抑制腸道炎癥[6-7]。SCFAs在發(fā)揮抗炎作用的同時(shí)，能夠通過(guò)抑制自由基，減少炎癥級(jí)聯(lián)引起的細(xì)胞氧化應(yīng)激，消除潛在的損傷產(chǎn)物。其中丙酸鈉(Sodium propionate，SP)是SCFAs的一種，由于其具有抑制組蛋白去乙?；傅哪芰?，對(duì)炎癥有影響。已有文獻(xiàn)報(bào)道，SP對(duì)Aβ1-42誘導(dǎo)的神經(jīng)毒性和脊髓損傷具有保護(hù)作用[8]。而且SP可能通過(guò)抑制某些信號(hào)分子達(dá)到抗炎和抗凋亡的作用。

本研究采用Aβ1-42誘導(dǎo)的AD小鼠模型，探討SP對(duì)AD小鼠認(rèn)知功能和炎癥因子表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 采用SPF級(jí)成年ICR小鼠60只，體重(30±5)g，購(gòu)自遼寧省沈陽(yáng)市長(zhǎng)生生物有限公司，所有程序均按照中國(guó)動(dòng)物福利法和沈陽(yáng)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的準(zhǔn)則進(jìn)行。造模前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，之后按照隨機(jī)原則進(jìn)行分組，動(dòng)物房溫度：18～22 ℃，濕度：50%～60%，燈光照射時(shí)間12 h明12 h暗交替進(jìn)行，動(dòng)物可自由進(jìn)食飲水。

1.2 動(dòng)物造模 麻醉：將小鼠用異氟烷進(jìn)行吸入麻醉，麻醉成功后進(jìn)行備皮及側(cè)腦室注射，將小鼠頭部消毒剃毛后，沿小鼠頭部皮膚矢狀線切開1 cm左右的切口，暴露小鼠顱骨前囟點(diǎn)，根據(jù)《小鼠腦立體定位圖譜》確定注射位置，側(cè)腦室注射Aβ1-42(Abcam,Cambridge,UK,ab120959)。術(shù)后處理：用可吸收手術(shù)縫合線進(jìn)行切口縫合后，再用紅霉素涂抹傷口，最后肌注青霉素3 d預(yù)防感染。

1.3 動(dòng)物分組及給藥[9-10]將ICR小鼠隨機(jī)分為5組，分別為假手術(shù)組、Aβ1-42組、Aβ1-42+SP 50 mg/kg組、Aβ1-42+SP 100 mg/kg組、Aβ1-42+SP 200 mg/kg組，每組12只。在側(cè)腦室注射Aβ1-42后1 d進(jìn)行SP(Sigma公司，p1880)腹腔給藥。給藥分為低、中、高劑量，分別為50 mg/kg、100 mg/kg、200 mg/kg。假手術(shù)組和Aβ1-42組給予生理鹽水，連續(xù)21 d后取材。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) Morris水迷宮主要由白色圓形水池(直徑120 cm,高45 cm)、可移動(dòng)的黑色平臺(tái)和視頻跟蹤系統(tǒng)組成。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中水溫保持在(25±1)℃。實(shí)驗(yàn)過(guò)程分為定位巡航和空間探索兩部分。定位巡航階段為連續(xù)5 d，每天進(jìn)行2次實(shí)驗(yàn)。小鼠可以成功地找到平臺(tái)，并且在平臺(tái)上停留10 s。如果小鼠在60 s內(nèi)找不到平臺(tái)，需要人為引導(dǎo)到達(dá)平臺(tái)并站立10 s，以小鼠找到平臺(tái)所用的時(shí)間作為學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。每只小鼠落在平臺(tái)上的時(shí)間被記錄為逃避潛伏期。第6天對(duì)小鼠進(jìn)行記憶能力檢測(cè)，即空間探索階段，將隱藏平臺(tái)撤掉，將小鼠放置在水池中。記錄在1 min內(nèi)小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)等。

1.4.2 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA) 使用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)試劑盒(伊萊瑞特生物科技股份有限公司，武漢，中國(guó))測(cè)定額葉皮質(zhì)中白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)以及白細(xì)胞介素-4(IL-4)和白細(xì)胞介素-10(IL-10)的水平。預(yù)先將ELISA試劑盒從4 ℃冰箱取出，置于室溫環(huán)境，室溫平衡20 min后，取出試劑盒按照說(shuō)明書進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)OD值用Orgin軟件計(jì)算出蛋白濃度。

2 結(jié)果

2.1 水迷宮結(jié)果 采用Morris水迷宮試驗(yàn)評(píng)價(jià)小鼠的空間學(xué)習(xí)和記憶能力。在第5天的定位巡航階段，與假手術(shù)組相比，Aβ1-42組小鼠尋找平臺(tái)的時(shí)間更長(zhǎng)(P<0.001)，與Aβ1-42組相比，Aβ1-42+SP 100 mg/kg組和Aβ1-42+SP 200 mg/kg組均顯著降低了逃避潛伏期(P<0.001),而與Aβ1-42+SP 50 mg/kg組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

在空間探測(cè)階段，與假手術(shù)組相比，Aβ1-42組小鼠穿越平臺(tái)次數(shù)較少(P<0.001)，與Aβ1-42組相比，Aβ1-42+SP 100 mg/kg組和Aβ1-42+SP 200 mg/kg組穿越平臺(tái)次數(shù)均增加(P<0.05,P<0.001)。而Aβ1-42+SP 50 mg/kg組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。水迷宮結(jié)果顯示，阿爾茨海默病小鼠造模成功，并且丙酸鈉改善了Aβ誘導(dǎo)的AD小鼠的認(rèn)知能力，見表1。

表1 各組小鼠第5天逃避潛伏期時(shí)間和第6天穿越平臺(tái)次數(shù)

2.2 IL-1β和TNF-α結(jié)果 采用鼠源IL-1β、TNF-α ELISA試劑盒，以空白孔調(diào)零檢測(cè)其450 nm處的OD值測(cè)量表達(dá)量。IL-1β結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，IL-1β表達(dá)水平在Aβ1-42組增加(P<0.001)，與Aβ1-42組相比，IL-1β表達(dá)水平在Aβ1-42+SP 100 mg/kg組和Aβ1-42+SP 200 mg/kg組減少(P<0.01，P<0.001)，而在Aβ1-42+SP 50 mg/kg組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

TNF-α結(jié)果顯示，與假手術(shù)相比，TNF-α表達(dá)水平在Aβ1-42組增加(P<0.05)，與Aβ1-42組相比，TNF-α表達(dá)水平在Aβ1-42+SP 200 mg/kg組表達(dá)減少(P<0.05)，而在Aβ1-42+SP 50 mg/kg組和Aβ1-42+SP 100 mg/kg組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.3 IL-4和IL-10的結(jié)果 采用鼠源IL-4和IL-10 ELISA試劑盒，以空白孔調(diào)零檢測(cè)其450 nm處的OD值測(cè)量表達(dá)量。IL-4結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，IL-4表達(dá)水平在Aβ1-42組減少(P<0.01)，與Aβ1-42組相比，IL-4表達(dá)水平在Aβ1-42+SP 200 mg/kg組表達(dá)增加(P<0.05)，而在Aβ1-42+SP50 mg/kg和Aβ1-42+SP 100 mg/kg組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

與假手術(shù)組相比，IL-10表達(dá)水平在Aβ1-42組減少(P<0.001)，與Aβ1-42組相比，IL-10表達(dá)水平在Aβ1-42+SP 100 mg/kg組和Aβ1-42+SP200 mg/kg組表達(dá)增加(P<0.01，P<0.001)，而在Aβ1-42+SP 50 mg/kg組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

表2 各組小鼠IL-1β、TNF-α、IL-4和IL-10表達(dá)水平比較

3 討論

AD的主要病理特征之一是由大量Aβ沉積形成的老年斑。Aβ可引起氧化應(yīng)激、神經(jīng)炎癥、能量代謝紊亂和離子紊亂等，最終導(dǎo)致退行性病變和神經(jīng)元丟失[11-12]。

本研究探討了丙酸鈉對(duì)AD病理進(jìn)展中神經(jīng)炎癥反應(yīng)的影響。結(jié)果顯示，與假手術(shù)組相比，Aβ1-42組IL-1β和TNF-α的含量明顯上升，與Aβ1-42組相比，丙酸鈉中劑量組IL-1β的含量下調(diào)，高劑量組IL-1β和TNF-α的含量顯著下調(diào)。說(shuō)明丙酸鈉對(duì)促炎因子有明顯的調(diào)節(jié)作用。另外，本研究也探討了丙酸鈉對(duì)抗炎因子的作用，與假手術(shù)組相比，Aβ1-42組IL-4和IL-10的含量明顯減少，與Aβ1-42組相比，丙酸鈉中劑量組IL-10的含量顯著上調(diào)，丙酸鈉高劑量組IL-4和IL-10的含量上調(diào)。先前的研究表明，小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的先天免疫效應(yīng)細(xì)胞，具有維持大腦穩(wěn)態(tài)的作用。在AD大腦中，活化的小膠質(zhì)細(xì)胞伴隨著促炎細(xì)胞因子的增加，如白細(xì)胞介素和TNF-α[13-14]。Aβ的積聚可以導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。Aβ激活小膠質(zhì)細(xì)胞，并與受體CD14、CD36和CD47結(jié)合。這種相互作用使小膠質(zhì)細(xì)胞分泌更多的促炎介質(zhì)[15]。有研究顯示，丁酸鈉可抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減少神經(jīng)炎癥的發(fā)生和Aβ的積聚[16]。丙酸鈉在體外神經(jīng)炎癥模型和體內(nèi)脊髓損傷模型中，可減少炎癥過(guò)程，具有神經(jīng)保護(hù)作用。正常衰老細(xì)胞與抗炎因子IL-4和IL-10降低有關(guān)，IL-10通過(guò)抑制促炎細(xì)胞因子受體表達(dá)和激活來(lái)減少促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生[17]，因此，IL-10的減少可能導(dǎo)致促炎細(xì)胞因子表達(dá)延長(zhǎng)和增加，使衰老的大腦容易受到傷害。本研究支持丙酸鈉可通過(guò)降低促炎因子的表達(dá)，提高抗炎因子的表達(dá)，進(jìn)而減少AD小鼠的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，有效改善了小鼠的認(rèn)知功能。

綜上所述，在Aβ1-42誘導(dǎo)的AD小鼠動(dòng)物模型上，本研究提供了丙酸鈉具有治療潛力的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。丙酸鈉通過(guò)減少促炎因子IL-1β和TNF-α的表達(dá)，提高抗炎因子IL-4和IL-10的表達(dá)，改善AD小鼠的認(rèn)知能力。丙酸鈉調(diào)控AD模型中促炎因子和抗炎因子平衡的具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。