楊曉晶 白海濤 莊良金

(廈門大學(xué)附屬第一醫(yī)院 1質(zhì)量管理部，福建 廈門 361003；2兒科)

腎間質(zhì)纖維化是慢性腎臟疾病發(fā)展為終末期腎衰竭的中間過程，既往對(duì)腎間質(zhì)纖維化形成過程的研究主要集中在腎小管上皮細(xì)胞凋亡、腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤，纖維化因子釋放、細(xì)胞外基質(zhì)的生成增多等方面〔1,2〕，而缺乏對(duì)腎小管周圍毛細(xì)血管的研究。研究顯示，多種慢性腎臟病伴有不同程度的腎小管周圍毛細(xì)血管丟失，提示腎小管周圍毛細(xì)血管的丟失可能是腎間質(zhì)纖維化的重要因素之一〔3,4〕。粒細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)〔5〕和他汀類藥物〔6〕均為有效的干細(xì)胞動(dòng)員劑，能動(dòng)員骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞，提高外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞數(shù)量。G-CSF是臨床經(jīng)典的干細(xì)胞動(dòng)員劑，其安全性和有效性已被臨床所證實(shí)〔7，8〕。本研究探討G-CSF和阿托伐他汀干預(yù)對(duì)毛細(xì)血管和腎間質(zhì)纖維化的作用。

1 材料與方法

1.1試驗(yàn)動(dòng)物 選取雄性SD大鼠160只，6周齡，體重200～220 g，購自河北醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 w，隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、G-CSF組和阿托伐他汀組，每組40只，分別于造模后1、2、3和4 w隨機(jī)抽取處死10只大鼠進(jìn)行研究。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1造模及干預(yù) ①假手術(shù)組：僅經(jīng)右下腹切口，分離右側(cè)輸尿管，不結(jié)扎。②模型組：經(jīng)右下腹切口，分離右側(cè)輸尿管，在腎輸尿管移行處分兩處結(jié)扎輸尿管，然后從中間剪斷輸尿管，模型組及假手術(shù)組每天給予生理鹽水 1 ml 灌胃。③G-CSF 組：結(jié)扎右側(cè)輸尿管并皮下注射 G-CSF 50 μg/(kg·d)。④阿托伐他汀組：結(jié)扎右側(cè)輸尿管并阿托伐他汀5 mg/(kg·d)灌胃給藥。飼養(yǎng)于隔離環(huán)境中，普通喂養(yǎng)，食物和水經(jīng)消毒處理，每日12 h光照，溫度 23～26℃、濕度 50%～60%。造模后1、2、3和4 w將以上小鼠頸椎脫臼處死固定在固定平板上，打開腹腔，剪取右側(cè)腎臟，放入生理鹽水中漂洗以去除血跡和游離脂肪組織等。迅速放入 10%甲醛溶液中固定。

1.2.2腎臟組織Masson染色法 制作常規(guī)石蠟切片，進(jìn)行脫水、脫蠟等步驟，于麗春紅染液、2%冰醋酸、5%磷鉬酸水溶液中分別染色2 min，再于甲基綠中染色3 min，用清水沖洗。然后進(jìn)行梯度酒精脫水、二甲苯透明等過程，最后用中性樹膠密封，在高功率(×200)下，選擇15個(gè)沒有腎小球和血管的腎皮質(zhì)視野。以膠原纖維陽性染色程度對(duì)腎間質(zhì)纖維化進(jìn)行評(píng)分：0分：正常；1分：染色面積≤25%；2分：染色面積26%～50%；3分，染色面積51%～75%；4分，染色面積>75%。

1.2.3CD34+細(xì)胞免疫組化染色法 使用免疫組織化學(xué)染色對(duì)石蠟切片進(jìn)行抗原修復(fù)，加入一抗并在4℃條件下孵育，二抗則在37℃條件下孵育30 min，并使用二氨基聯(lián)苯胺(DAB)底物顯色。微血管內(nèi)皮細(xì)胞中CD34+在顯微鏡下顯示棕褐色。任何一個(gè)棕褐色的內(nèi)皮細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞簇作為一條微血管，分支結(jié)構(gòu)也作為一條血管計(jì)數(shù)(除外大血管)，在顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)陽性的毛細(xì)血管腔個(gè)數(shù)，得出PTC密度(個(gè)/mm2)取平均值。

1.2.4細(xì)胞間黏附分子(ICAM)-1、結(jié)締組織生長因子(CTGF)免疫組化染色法 組織石蠟切片按照SP法試劑盒(福州麥新生物技術(shù)有限公司)的說明書進(jìn)行操作。山羊抗大鼠CTGF和ICAM-1多克隆抗體，在室溫下孵育1 h，洗滌3次，再加入兔抗山羊單克隆抗體(北京雅發(fā)生物制品有限公司)，在室溫下孵育15 min，DAB顯色 2～5 min，蘇木素復(fù)染，脫水封片，腎組織CTGF和ICAM-1 的免疫組織化學(xué)半定量分析采用HPIAS2000型圖像分析軟件(同濟(jì)千屏影像工程公司研制)，分析方法為每個(gè)標(biāo)本在放大200倍圖像的腎皮質(zhì)區(qū)依次選取 40個(gè)視野，染色陽性部位的深淺及范圍以平均光密度表示。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS22.0軟件行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組腎小管周圍毛細(xì)血管密度比較 模型組、G-CSF組和阿托伐他汀組造模后2 w、3 w和4 w腎小管周圍毛細(xì)血管密度顯著低于假手術(shù)組(P<0.05)，其中G-CSF組和阿托伐他汀組造模后2 w、3 w和4 w腎小管周圍毛細(xì)血管密度顯著高于模型組(P<0.05)。見表1。免疫組化染色棕褐色為CD34陽性細(xì)胞，假手術(shù)組PTC密度豐富，分布均勻，形態(tài)大致規(guī)則。模型組、G-CSF組和阿托伐他汀組PTC病變呈局灶性分布且PTC密度降低，模型組明顯低于G-CSF組和阿托伐他汀組。見圖1。

2.2各組腎間質(zhì)纖維化評(píng)分比較 模型組、G-CSF組和阿托伐他汀組造模后1 w、2 w、3 w和4 w腎間質(zhì)纖維化評(píng)分顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，其中G-CSF組和阿托伐他汀組造模后2 w、3 w和4 w腎間質(zhì)纖維化評(píng)分顯著低于模型組(P<0.05)。見表1。Masson染色可將腎小球間質(zhì)膠原纖維、網(wǎng)狀纖維染成藍(lán)色，藍(lán)染范圍越多，顏色越深，則表明腎間質(zhì)纖維化越嚴(yán)重。假手術(shù)組腎組織形態(tài)正常，模型組和G-CSF組、阿托伐他汀組可見腎小管擴(kuò)張，腎間質(zhì)纖維化，間質(zhì)藍(lán)染明顯增多，模型組明顯多于G-CSF組、阿托伐他汀組。見圖2。

2.3各組腎間質(zhì)ICAM-1、CTGF表達(dá)比較 模型組、G-CSF組和阿托伐他汀組造模后2 w、3 w和4 w腎間質(zhì)ICAM-1、CTGF表達(dá)光密度值顯著高于假手術(shù)組(P<0.05)，其中G-CSF組和阿托伐他汀組造模后2 w、3 w和4 w腎間質(zhì)ICAM-1、CTGF表達(dá)光密度值顯著低于模型組(P<0.05)。見表2。

表1 各組造模不同時(shí)間腎小管周圍毛細(xì)血管密度及腎間質(zhì)纖維化評(píng)分比較

圖1 各組造模后4 w腎臟病理切片CD34+(免疫組化染色，×100)

圖2 各組造模后4 w腎臟病理切片(Masson染色，×200)

表2 各組造模不同時(shí)間腎間質(zhì)ICAM-1、CTGF表達(dá)光密度值比較

3 討 論

腎小管間質(zhì)纖維化是由多種病因引起的慢性腎臟疾病發(fā)展為終末期腎臟疾病的最后一條途徑。腎功能的惡化在很大程度上取決于腎小管間質(zhì)纖維化程度〔9〕。腎小管周圍毛細(xì)血管主要由內(nèi)皮細(xì)胞和基底膜構(gòu)成，其間散在扁而有突起的周細(xì)胞。內(nèi)皮細(xì)胞損傷和功能障礙是腎小管周圍毛細(xì)血管丟失的主要原因。研究顯示維持內(nèi)皮細(xì)胞的正常生理功能對(duì)毛細(xì)血管的結(jié)構(gòu)和功能完整起重要作用，骨髓來源的內(nèi)皮祖細(xì)胞能通過自身分裂增殖、分化為內(nèi)皮細(xì)胞及旁分泌效應(yīng)參與血管修復(fù)及新生〔10〕。

G-CSF是臨床經(jīng)典的干細(xì)胞動(dòng)員劑，其安全性和有效性已被臨床所證實(shí)〔11〕。他汀類藥物是膽固醇合成中的限速酶，能夠抑制肝臟膽固醇生成途徑來減少脂質(zhì)合成。國內(nèi)外諸多研究表明〔12〕，他汀類藥物具有降脂作用、促新生血管生成、抗心律失常、動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞等作用。有研究〔13〕顯示阿托伐他汀能夠明顯增加內(nèi)皮祖細(xì)胞集落形成數(shù)目。

作為一種跨膜糖蛋白，CD34在毛細(xì)血管和小血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)維持穩(wěn)定狀態(tài)是反映血管內(nèi)皮細(xì)胞狀態(tài)的標(biāo)記物〔14〕。CD34數(shù)量能夠反映腎小管周圍的毛細(xì)血管密度，本研究中，內(nèi)皮細(xì)胞用CD34染色標(biāo)記被染成棕黃色。G-CSF動(dòng)員了內(nèi)皮祖細(xì)胞進(jìn)而加速了血管新生過程。有研究顯示：干細(xì)胞因子能夠動(dòng)員干細(xì)胞歸巢，有助于減少腎小管周圍毛細(xì)血管丟失。內(nèi)皮祖細(xì)胞能夠通過自身的分化增殖促進(jìn)新生血管的生成；還可以通過旁分泌效應(yīng)使血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生增殖。阿托伐他汀為3-羥-3-甲基戊二酰輔酶 A還原酶抑制劑，其能促進(jìn)受損冠狀動(dòng)脈和外周小動(dòng)脈內(nèi)皮化，他汀類藥物的這一效應(yīng)不依賴它的降膽固醇效應(yīng)，他汀類藥物促進(jìn)血管新生可能是通過動(dòng)員內(nèi)皮祖細(xì)胞，并促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖和分化。也可能是G-CSF和阿托伐他激活了磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號(hào)通路，該通路調(diào)節(jié)下游靶標(biāo)因子并抑制內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡，誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞增殖分化。

CTGF可促進(jìn)細(xì)胞增殖，加速細(xì)胞外基質(zhì)的生成，其在腎小球和腎小管周圍表達(dá)〔15,16〕。黏附分子是一類糖蛋白，可介導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)黏附。 ICAM-1是跨膜單鏈糖蛋白，屬于免疫球蛋白中的一種，其在內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)能力最強(qiáng)〔17,18〕。腎組織單核細(xì)胞，特別是淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤，可對(duì)腎小管造成損害并引起間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化，最終導(dǎo)致腎小管間質(zhì)纖維化。

G-CSF 和阿托伐他汀具有廣泛的生物效應(yīng)，有相似的生物活性，如動(dòng)員骨髓內(nèi)皮祖細(xì)胞，還能動(dòng)員造血干細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等，炎癥細(xì)胞浸潤可加劇微血管損傷及間質(zhì)纖維化，集落刺激因子的炎癥細(xì)胞動(dòng)員作用是否會(huì)減弱其促進(jìn)組織修復(fù)作用，目前尚缺乏進(jìn)一步的研究。阿托伐他汀具有多種腎保護(hù)功能，除了降低血漿膽固醇外，它還可以改善內(nèi)皮功能，抑制炎癥反應(yīng)和抗氧化活性，并可減少內(nèi)皮細(xì)胞凋亡〔19〕，提高內(nèi)皮一氧化氮合酶生物活性，調(diào)節(jié)促凝血活性和血小板功能，可促進(jìn)微血管修復(fù)。

腎間質(zhì)纖維化的發(fā)病機(jī)制還不是很明確。本研究從腎小管周圍毛細(xì)血管密度的丟失和腎間質(zhì)纖維化的進(jìn)程方面探討了他汀類藥物及G-CSF的作用，將對(duì)臨床改善腎小管周圍毛細(xì)血管密度丟失和腎間質(zhì)纖維提供理論依據(jù)。

綜上， G-CSF及阿托伐他汀均能延緩單側(cè)輸尿管梗阻大鼠腎小管周圍毛細(xì)血管密度丟失和腎間質(zhì)纖維化進(jìn)展，兩者作用機(jī)制可能相同。