興偉 劉遠 徐曌 徐志峰 宋易華

(河北省中醫(yī)院普外科，河北 石家莊 050000)

乳腺增生(MGH)是育齡婦女的常見疾病，屬中醫(yī)學乳癖范疇，其發(fā)病率占育齡婦女的40%左右，病程長且具有一定的癌變傾向，嚴重威脅廣大婦女的身心健康〔1〕?，F(xiàn)代醫(yī)學認為，MGH主要與內(nèi)分泌功能紊亂密切相關(guān)，西醫(yī)臨床以內(nèi)服激素和手術(shù)治療為主。人參皂苷(GS)Rd在人參屬植物中的含量較低，但卻具有較強的生物活性，如改善微循環(huán)、調(diào)節(jié)免疫、抗炎和鎮(zhèn)痛等藥理作用〔2，3〕。本研究主要觀察GSRd對雌孕激素誘導MGH大鼠血清性激素水平、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)和Ki-67等表達影響，探討其誘導凋亡的可能機制。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 GSRd(成都曼思特生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)≥98%)；雌二醇(E2)苯甲酸注射液和孕酮(P)注射液(浙江寧波，三生制藥有限公司)提供；E2、P、促黃體激素(LH)、促卵泡激素(FSH)、催乳素(PRL)、睪酮(T)酶聯(lián)免疫吸附測定試劑盒(江蘇南京，建成生物工程研究所)；細胞核增殖指數(shù)(Ki)-67、Bax、Bcl-2、β-actin抗體(美國，Danvers)；SZX10顯微鏡(日本，奧林巴斯公司)；ChemiDoc-XRS成像系統(tǒng)(美國，BioRad)。

1.2實驗動物 60只Wistar雌性大鼠，重180～220 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司〔SCXK(京)2015-0011〕，使用許可證號〔SYXK(冀)2015-0023〕，適應性喂養(yǎng)1 w，進行正常飲食和自由飲水。將大鼠隨機分為對照組(10只)和模型組(50只)，對照組不做任何處理，模型組建模方法：大鼠后腿內(nèi)側(cè)肌肉注射雌激素〔0.5 mg/(kg·d)〕25 d，隨后5 d注射孕激素〔5 mg/(kg·d)〕誘導動物模型生長。從第31天開始，將60只大鼠分為6組，每組10只，分別處理如下：對照組(等量生理鹽水)、模型組(等量生理鹽水)、陽性對照組(三苯氧胺，1.5 mg/kg)、GSRd-低劑量組(10 mg/kg)、GSRd-中劑量組(20 mg/kg)、GSRd-高劑量組(40 mg/kg)。所有藥物在使用前溶于蒸餾水中，以10 ml/kg體重灌胃給藥，連續(xù)給藥30 d。在實驗過程中于預定時間測量大鼠乳頭直徑。實驗結(jié)束后，禁食一晚，經(jīng)腹主動脈采集血樣，離心分離血清，然后在-80℃下儲存，用于激素測定。將部分乳腺組織固定在4%多聚甲醛中，以備后續(xù)實驗。本研究經(jīng)單位動物保護與利用委員會批準。

1.3乳頭直徑和器官系數(shù)的測定 實驗開始第1天、第30天、第45天和最后1 d，用游標卡尺測量乳頭直徑。實驗結(jié)束時，子宮和卵巢完全分離并稱重，以子宮或卵巢重量除以體重計算器官系數(shù)。

1.4酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)檢測MGH大鼠血清性激素水平 血清中E2、P、LH、FSH、PRL和T的含量檢測，按試劑盒(南京建城生物工程研究所)說明書操作。

1.5蘇木素-伊紅(HE)染色觀察大鼠乳腺組織病理變化 取乳腺組織在4%多聚甲醛中處理48 h后，經(jīng)乙醇梯度脫水、石蠟包埋，切成4 μm厚的切片，然后用HE染色，用顯微鏡觀察乳腺組織的病理變化。

1.6免疫組化法檢測大鼠乳腺Bcl-2蛋白表達 將石蠟切片(4 μm)在二甲苯中脫蠟，水化，并在3%過氧化氫中孵育20 min，將切片在微波爐中加熱兩次，在0.01 mol/L檸檬酸鹽緩沖液中加熱5 min，室溫封閉1 h。Bcl-2一抗4℃ 孵育過夜，用辣根過氧化物酶(HRP)二級抗體洗滌和孵育30 min。二氨基聯(lián)苯胺(DAB)染色后，蘇木精復染，乙醇分級脫水，最后用中性樹膠封片，切片在顯微鏡下拍照觀察。

1.7Western印跡檢測乳腺Bcl-2、Bax和Ki-67蛋白表達 提取乳腺組織中總蛋白，用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白質(zhì)濃度，用10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離等量的蛋白質(zhì)(50 μg)，然后轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。用5%脫脂奶粉在TBS-T中封閉2 h，分別加Bcl-2、Bax和Ki-67一抗于4℃下孵育過夜，在室溫下與HRP結(jié)合的二級抗體孵育2 h后，用電化學發(fā)光(ECL)顯色。用ImageJ軟件定量分析蛋白質(zhì)條帶的強度，實驗重復3次。

1.8統(tǒng)計學分析 采用SPSS18.0軟件進行方差分析、t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1GSRd對MGH大鼠子宮和卵巢器官系數(shù)的影響 與對照組相比，模型組實驗30、45、60 d乳頭直徑及子宮系數(shù)明顯升高(P<0.05)。與模型組相比，GSRd-中、高劑量組和陽性對照組子宮系數(shù)及實驗45、60 d乳頭直徑明顯下降(P<0.05)。而各組間卵巢系數(shù)無顯著差異(P>0.05)，見表1。

表1 各組乳頭直徑、子宮及卵巢系數(shù)

2.2GSRd對模型大鼠乳腺組織病理形態(tài)學的影響 對照組大鼠乳腺組織未發(fā)現(xiàn)病理學改變。模型組乳腺上皮細胞組織有明顯的增生性病變，包括大多數(shù)小葉增生，腺泡和導管數(shù)目增加，腺上皮增厚。三苯氧胺和GSRd高劑量連續(xù)給藥4 w后，乳腺小葉增生程度及腺泡、導管數(shù)目明顯減少。與模型組相比，TSP中、低劑量組均不同程度上減少乳腺腺泡和導管的管腔面積和數(shù)量，見圖1。

2.3免疫組化檢測乳腺組織中Bcl-2表達 與對照組相比，模型組Bcl-2蛋白表達上調(diào)，而與模型組相比，GSRd-中、高劑量組及陽性對照組均下調(diào)Bcl-2蛋白表達水平，而低劑量組則無影響，見圖2。

2.4GSRd改善MGH大鼠血清性激素水平 與對照組相比，模型組E2、PRL含量明顯升高，而P、T含量明顯下降(P<0.05,P<0.01)；與模型組相比，不同濃度GSRd組及陽性對照組E2、PRL水平明顯下降，而T、P水平明顯上升(P<0.05,P<0.01)，各組間FSH、LH含量無明顯變化(P>0.05)，見表2。

2.5Western印跡檢測乳腺組織中凋亡相關(guān)蛋白表達 與對照組相比，模型組Bcl-2、Ki-67表達明顯上調(diào)，Bax表達明顯下調(diào)(P<0.05)。而與模型組相比，GSRd-中、高劑量組及陽性對照組均明顯下調(diào)Bcl-2、Ki-67蛋白表達，明顯上調(diào)Bax表達(P<0.05)，低劑量組Bcl-2、Ki-67蛋白表達無影響，見圖3、表3。

圖1 各組乳腺組織病理形態(tài)學(HE染色，×200)

圖2 各組乳腺組織中Bcl-2蛋白表達(免疫組化染色，×100)

表2 GSRd對各組血清性激素水平的影響

1～6:對照組、模型組、陽性對照組、GSRd-低劑量組、GSRd-中劑量組、GSRd-高劑量組圖3 Western印跡檢測乳腺組織中Bcl-2、 Bax和Ki-67表達

表3 各組Bcl-2、Ki-67和Ki-67蛋白相對表達

3 討 論

MGH是婦女乳腺組織既非炎癥又非腫瘤的良性增生性疾病，以乳房腫物和疼痛為主要癥狀，常隨著月經(jīng)周期或情緒變化而消長，有發(fā)展為乳腺癌的可能性。MGH婦女患乳腺癌的概率是健康婦女的1.3～2.69倍〔4〕。

GSRd首先其對正常細胞具有無毒性，其次還具有廣泛的藥理活性，不僅對中樞神經(jīng)系統(tǒng)顯示出良好的神經(jīng)保護效應，而且對腎臟功能、免疫系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)等具有保護作用，目前已受到國內(nèi)外學者的廣泛關(guān)注〔5～7〕。

本研究結(jié)果提示，從乳房形態(tài)觀察，GSRd對MGH有明顯的治療作用；HE染色觀察發(fā)現(xiàn)，對照組乳腺沒有組織學變化，而模型組大鼠乳腺上皮細胞組織有明顯的增生性病變。服用三苯氧胺和GSRd高劑量連續(xù)4 w后乳腺小葉增生程度及腺泡、導管數(shù)目明顯減少。這也說明GSRd對雌、孕激素誘導的MGH大鼠有治療作用。

現(xiàn)代醫(yī)學認為乳腺是性激素的靶器官，導致MGH的主要原因是激素代謝紊亂，E2絕對值或相對值增加，P持續(xù)缺乏，因此在E2和P的聯(lián)合作用下，腺垂體遠端產(chǎn)生的親核細胞促進了乳腺的生長和發(fā)育，甚至導致過度增生〔8，9〕。少量T促進乳腺，相反大量T起到抑制作用〔10〕。本研究說明GSRd可調(diào)節(jié)MGH大鼠血清E2、P、PRL和T水平，發(fā)揮抗MGH作用。

細胞凋亡又稱程序性細胞死亡，是指細胞死亡的一種生理形式，主要受基因控制〔11，12〕。Bcl-2家族在細胞凋亡研究領(lǐng)域中具有重要地位，包括凋亡的關(guān)鍵調(diào)控因子，如抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax等，它們通常被認為是凋亡的重要分子蛋白〔13〕。Ki-67是與細胞增殖密切相關(guān)的核抗原，其分布、表達狀況可較準確地反映出細胞增殖活性，是應用最廣泛的增殖細胞標志之一〔14，15〕。本研究結(jié)果表明，GSRd可以顯著地促進MGH大鼠細胞凋亡，其機制可能與下調(diào)Bcl-2表達，上調(diào)Bax表達有關(guān)，同時GSRd還可能通過下調(diào)Ki-67表達，起到抑制細胞增殖作用，從而減輕MGH。

綜上，GSRd對雌孕激素誘導的大鼠MGH具有顯著的保護作用，其機制可能通過糾正性激素紊亂，抑制乳腺組織細胞增殖，促進細胞凋亡有關(guān)，更具體的治療機制有待研究。