黃仕美 汪元河 羅亞 楊小蓉 劉樹(shù)馨 祝勁松

(貴州醫(yī)科大學(xué) 1法醫(yī)學(xué)院法醫(yī)臨床學(xué)教研室，貴州 貴陽(yáng) 550004；2附屬醫(yī)院綜合病房；3貴州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院麻醉科)

急性心肌梗死(AMI)是引起心源性猝死的常見(jiàn)類(lèi)型〔1〕。及時(shí)準(zhǔn)確地確診對(duì)AMI的治療、預(yù)后及法醫(yī)學(xué)鑒定有至關(guān)重要的作用。然而，到目前為止，AMI的診斷和治療尚無(wú)有效的策略。

轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)-β/Smads信號(hào)通路心肌修復(fù)重要的調(diào)節(jié)因子，與AMI發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，Jin等〔2〕研究發(fā)現(xiàn)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)-7通過(guò)拮抗TGF-β1信號(hào)通路減弱心肌纖維化，從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用。TGF-β信號(hào)最初由其Ⅰ型和Ⅱ型跨膜受體(TGFBR1和TGFBR2)介導(dǎo)，TGF-β活化后與TGFBR2，TGFBR1結(jié)合形成異四聚體。當(dāng)TGFBR1被激活，便將其所含帶的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)給胞質(zhì)區(qū)的信號(hào)傳導(dǎo)分子Smads。Yang等〔3〕研究發(fā)現(xiàn)TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)基因TGFB1、TGFBR1、SNAI1和TWIST1的多態(tài)性與子宮內(nèi)膜癌易感性相關(guān)。

微小RNA(miRNAs)是非編碼RNA家族的一員，長(zhǎng)度為18～25個(gè)核苷酸〔4〕，近年來(lái)，研究證實(shí)包括miR-378〔5〕、miR-184〔6〕、miR-214〔7〕等多種miRNA與心肌纖維化、AMI等多種心血管疾病病理生理進(jìn)程有關(guān)。本研究旨在探討miR-155對(duì)AMI小鼠心肌纖維化進(jìn)程及心功能的影響及對(duì)心肌成纖維細(xì)胞(CFs)增殖和周期的調(diào)節(jié)，分析miR-155對(duì)TGFBR1/TGFBR2調(diào)控作用，闡明miR-155在AMI中的作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料 C57/BL6小鼠由貴州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，本研究中小鼠的處理均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理和使用委員會(huì)的要求與規(guī)定。CFs購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)，qRT-PCR試劑盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白質(zhì)分析試劑盒、電化學(xué)發(fā)光(ECL)檢測(cè)試劑盒、TRIzol?試劑盒均購(gòu)自賽默飛世爾科技(中國(guó))有限公司，LipofectamineTM2000購(gòu)自Gibco公司，一抗TGFBR1、TGFBR2、內(nèi)參GAPDH及辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗購(gòu)自Abcam 公司。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒和載體購(gòu)自Promega公司，miR-155 mimic及其陰性對(duì)照購(gòu)自吉瑪公司。

1.2方法

1.2.1外周血采集 收集貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院收治的93例AMI患者，并選取50例同期的健康志愿者(對(duì)照組)。受試者均于清晨空腹?fàn)顩r下抽取外周靜脈血約3 ml，置于含乙二胺四乙酸(EDTA)的抗凝血管中，快速上下混合。所有樣本經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，并簽署知情同意書(shū)。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 CFs細(xì)胞株使用含10%胎牛血清的杜爾貝科改良伊格爾培養(yǎng)基(DMEM)培養(yǎng)基培養(yǎng)。待CFs生長(zhǎng)至70%～90%融合時(shí)，按照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 試劑說(shuō)明書(shū)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.2.3qRT-PCR檢測(cè) 使用Trizol提取總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的總RNA合成cDNA，按照qRT-PCR試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行PCR，miR-155表達(dá)水平以U6為內(nèi)參，TGFBR1，TGFBR2和NPPA的mRNA表達(dá)水平以GAPDH為內(nèi)參，qRT-PCR結(jié)果以2-ΔΔCt值形式得到。

1.2.4雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 通過(guò)TargetScan發(fā)現(xiàn)miR-155與TGFBR1和TGFBR2的3′-非編碼區(qū)(UTR)的潛在結(jié)合位點(diǎn)，構(gòu)建TGFBR1野生型(WT)3′-UTR熒光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-WT-TGFBR1和突變型(Mut)報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-Mut-TGFBR1，TGFBR2 WT報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-WT-TGFBR2和Mut報(bào)告基因質(zhì)粒pMIR-Mut-TGFBR2，將TGFBR1/TGFBR2 WT或Mut報(bào)告基因質(zhì)粒與miR-NC，miR-155 mimic，NC-inhibitor或miR-155 inhibitor共轉(zhuǎn)染進(jìn)CFs。轉(zhuǎn)染24 h后，利用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組的熒光素酶活性。

1.2.5Western印跡 用放射免疫沉淀法(RIPA)裂解緩沖液提取各組CFs蛋白，BCA法檢測(cè)蛋白濃度，取上樣緩沖液與樣品混合并置于95℃變性10 min。蛋白樣品以每孔50 μg加到10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白，將蛋白轉(zhuǎn)到聚偏氟乙烯(PVDF)膜上后，5%脫脂奶粉的封閉緩沖液中，室溫封閉2 h。將TGFBR1抗體(1∶500)，TGFBR2抗體(1∶500)，P-smad2抗體(1∶500)，P-smad3抗體(1∶500)和GAPDH抗體(1∶1 000)加入至PVDF膜，GAPDH為內(nèi)參。4℃孵育過(guò)夜。加入1∶1 000稀釋的辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記二抗1 h，ECL劑顯色，暗室下顯影。

1.2.6CCK8實(shí)驗(yàn) 以2 000個(gè)/孔的量將CFs接種到96孔板，按照CCK-8試劑盒制造商說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)CFs增殖，在450 nm波長(zhǎng)，測(cè)定每孔光密度值。

1.2.7流式細(xì)胞法 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的CFs收集于5 ml離心管中，用0.01%胰蛋白酶消化30 min。用普通離心機(jī)100 r/min離心5 min后棄上清，再用預(yù)冷的PBS洗滌一次，100 r/min離心5 min后棄上清，收集細(xì)胞于同一5 ml流式離心管中，然后用4℃預(yù)冷的70%乙醇固定細(xì)胞1 h。去除乙醇后用PBS洗滌1次，用細(xì)胞染色液重懸細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度為1×106個(gè)/ml，最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。

1.2.8構(gòu)建AMI小鼠模型 C57/BL6小鼠隨機(jī)分為Sham組、AMI組、AMI+miR-155組各6只。AMI組小鼠用2%水合氯醛(100 mg/kg)腹腔注射麻醉。胸骨左緣第2～4肋開(kāi)胸，識(shí)別前降支走行范圍，7/0滑線(xiàn)結(jié)扎左前降支，當(dāng)結(jié)扎區(qū)域顏色轉(zhuǎn)為蒼白，心電圖示波為AMI表現(xiàn)時(shí)確認(rèn)模型構(gòu)建成功。Sham組小鼠開(kāi)胸但不結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈。其余步驟同AMI組。AMI+miR-155組小鼠采用miR-155 mimic慢病毒進(jìn)行心肌局部注射。

1.2.9小鼠心功能檢測(cè) 10%水合氯醛腹腔注射對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉，然后心臟彩超檢查各組小鼠并記錄左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.2.10Masson染色 小鼠心肌組織石蠟切片脫蠟至水，用蘇木素染液染核10 min，充分水洗后用鹽酸酒精分化，再蒸餾水洗。用Masson麗春紅酸性復(fù)紅液10 min。1%磷鉬酸水溶液分化5 min，甩掉磷鉬酸后直接用苯胺藍(lán)染5 min。再依次用95%酒精、無(wú)水酒精、二甲苯透明、中性樹(shù)膠封固。

1.2.11天狼星紅染色 小鼠心肌組織石蠟切片脫蠟水化，天狼星紅染色液染色10 min，稍微沖洗后用Mayer蘇木素染色液染色8 min，流水沖洗10 min。常規(guī)梯度乙醇進(jìn)行脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)膠封片。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析。

2 結(jié) 果

2.1miR-155在AMI患者中表達(dá)降低 對(duì)照組血清中miR-155的相對(duì)表達(dá)量(1.00±0.12)顯著高于AMI組(0.74±0.09；t=14.616，P<0.001)。

2.2miR-155對(duì)AMI小鼠左心室功能及纖維化的影響 AMI組miR-155表達(dá)量(0.34±0.09)明顯低于Sham組(1.00±0.14，t=9.714，P<0.01)。AMI組LVEF明顯低于Sham組，而AMI+ miR-155組LVEF明顯高于AMI組(P<0.01)。AMI+miR-155組NPPA mRNA表達(dá)水平明顯低于AMI組(P<0.01)。見(jiàn)表1。小鼠心肌組織Masson染色結(jié)果顯示，AMI小鼠心肌組織中有大量膠原纖維沉積于心肌細(xì)胞間隙，而AMI+miR-155組小鼠心肌膠原纖維分布較AMI小鼠明顯減少。天狼星紅染色結(jié)果也顯示，上調(diào)miR-155表達(dá)能抑制AMI小鼠心肌纖維化進(jìn)程，見(jiàn)圖1。

2.3TGFBR1和TGFBR2是miR-155的靶基因 在CFs中轉(zhuǎn)染miR-155 mimic或inhibitor及各自陰性對(duì)照，在熒光顯微鏡下的觀察結(jié)果顯示，miR-155 mimic組中miR-155表達(dá)明顯高于miR-NC組，而miR-155 inhibitor組中miR-155表達(dá)明顯低于NC inhibitor組(P<0.01，圖2)，表明轉(zhuǎn)染成功。TargetScan篩選結(jié)果表明miR-155在TGFBR1的3′-UTR上具有潛在的結(jié)合位點(diǎn)，并且雙熒光素酶試驗(yàn)結(jié)果顯示，miR-155 mimic和pMIR-WT-TGFBR1共轉(zhuǎn)染進(jìn)CFs時(shí)，熒光素酶活性較miR-NC組明顯降低(P<0.01)，而miR-155 inhibitor和pMIR-WT-TGFBR1共轉(zhuǎn)染時(shí)，熒光素酶活性較NC inhibitor組明顯升高(P<0.01)，但miR-155 mimic和inhibitor對(duì)pMIR-Mut-TGFBR1的熒光素酶活性均無(wú)明顯影響。另一方面，通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)miR-155也能特異性結(jié)合TGFBR2的3′-UTR，表明TGFBR2也是miR-155的靶基因。見(jiàn)表2。

表1 各組LVEF和NPPA mRNA比較

圖1 miR-155對(duì)AMI小鼠左心室功能及纖維化的影響(×20)

圖2 熒光顯微鏡觀察CFs轉(zhuǎn)染后miR-155的表達(dá)(×500)

表2 TargetScan和雙熒光素酶報(bào)告基因試驗(yàn)驗(yàn)證TGFBR1、TGFBR2是miR-155的靶基因

2.4miR-155負(fù)性調(diào)控TGFBR1和TGFBR2表達(dá) miR-155 mimic組中TGFBR1、TGFBR2 mRNA和蛋白表達(dá)均明顯低于miR-NC組(P<0.01)，而miR-155 inhibitor組中TGFBR1、TGFBR2 mRNA和蛋白表達(dá)較NC inhibitor組明顯升高(P<0.01)。見(jiàn)圖3、表3。

2.5miR-155對(duì)CFs增殖和周期的影響 miR-155 mimic組OD值明顯低于miR-NC組(P<0.01)，而miR-155 inhibitor組的OD值較NC inhibitor組明顯升高(P<0.01)。轉(zhuǎn)染miR-155 mimic能導(dǎo)致S期細(xì)胞比值較miR-NC組明顯降低(P<0.01)，而轉(zhuǎn)染miR-155 inhibitor則促進(jìn)了細(xì)胞的S期阻滯(P<0.01)。見(jiàn)表3。

1～4：miR-NC組、miR-155 mimic組、NC inhibitor組、miR-155 inhibitor組圖3 miR-155負(fù)性調(diào)控TGFBR1和TGFBR2的表達(dá)

表3 各組TGFBR1、TGFBR2 mRNA表達(dá)及CFs增殖及S期細(xì)胞比較

2.6miR-155通過(guò)調(diào)控Smad信號(hào)通路抑制EndMT 與NC組相比，在缺氧的刺激下，CFs中TGFBR1，TGFBR2，P-smad2和P-smad3表達(dá)明顯升高，但轉(zhuǎn)染miR-155 mimic能明顯抑制TGFBR1和TGFBR2蛋白及smad2和smad3的磷酸化水平。但在共轉(zhuǎn)染miR-155 mimic和TGFBR1/TGFBR2的細(xì)胞中，miR-155的調(diào)控效果會(huì)因TGFBR1/TGFBR2過(guò)表達(dá)而被逆轉(zhuǎn)，圖4、表4、表5。

1～4：NC組、Hypoxia組、Hypoxia+miR-155組、Hyporia+miR-155+TGFBR1/2組圖4 Western印跡檢測(cè)TGFBR1、TGFBR2、P-smad2和P-smad3的表達(dá)

表4 各組P-SMAD2、P-SMAD3、TGFBR1蛋白 表達(dá)

表5 各組P-SMAD2、P-SMAD3、TGFBR2蛋白 表達(dá)

3 討 論

在AMI發(fā)病過(guò)程中，由于冠狀動(dòng)脈血流突然中斷，導(dǎo)致供血區(qū)域的心肌細(xì)胞缺血缺氧壞死，繼而引發(fā)一系列病理生理過(guò)程〔8〕。多種miRNAs證實(shí)為 AMI后重構(gòu)或誘導(dǎo)血管生成的重要基因調(diào)控因子〔9，10〕。Ma等〔11〕研究表明，MiR-532-5p通過(guò)靶向PDCD4減輕缺氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡；Fan等〔12〕發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)miRNA-210可刺激HGF表達(dá)，誘導(dǎo)改善左心室重構(gòu)，從而改善心功能，促進(jìn)梗死心肌的血管生成。雖然當(dāng)前已報(bào)道了多種miRNA與心肌梗死的關(guān)系，但miR-155在AMI中的作用目前尚不清楚。本研究提示miR-155表達(dá)的異常變化可能與AMI有關(guān)。miR-155能改善AMI小鼠的左心室功能，對(duì)心肌纖維化具有抑制效果。

研究顯示，TGF-β在可誘導(dǎo)CFs分化為肌成纖維細(xì)胞，TGFBR1和TGFBR2是TGF-β信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，TGF-β需通過(guò)與特異性受體TGFBR1，TGFBR2結(jié)合，才能發(fā)揮生物學(xué)作用〔13〕。在本研究結(jié)果表明miR-155能與TGFBR1和TGFBR2的3′-UTR特異性結(jié)合并負(fù)性調(diào)控兩者的表達(dá)。

CFs的增殖能力是調(diào)控心肌纖維化過(guò)程的一個(gè)重要因素，過(guò)度增殖的CFs也能導(dǎo)致心肌纖維化的發(fā)生〔14〕。本研究結(jié)果表明上調(diào)miR-155表達(dá)能抑制細(xì)胞的增殖和S期阻滯，與之相反的是，下調(diào)miR-155表達(dá)能促進(jìn)CFs的上述生物學(xué)行為。這提示miR-155可能抑制心肌纖維化發(fā)生。

內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化(EndMT)與胚胎發(fā)生、損傷修復(fù)、組織新生、腫瘤進(jìn)展和纖維化密切相關(guān)，EndMT可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞產(chǎn)生基質(zhì)，從而加速心肌纖維化的進(jìn)程，TGF-β1最近被證實(shí)是腎小管內(nèi)皮細(xì)胞EndMT的重要觸發(fā)因子〔15〕。研究表明缺氧等刺激因素可以誘導(dǎo) EndMT過(guò)程〔16〕，發(fā)現(xiàn)在缺氧條件下，TGFBR1，TGFBR2，P-smad2和P-smad3表達(dá)明顯升高，但過(guò)表達(dá)miR-155能抑制TGFBR1和TGFBR2蛋白及smad2和smad3的磷酸化水平。而值得注意的是，上調(diào)TGFBR1或TGFBR2表達(dá)均能逆轉(zhuǎn)miR-155的調(diào)控效果。這表明miR-155能通過(guò)靶向調(diào)控TGFBR1和TGFBR2表達(dá)抑制Smad信號(hào)通路從而調(diào)節(jié)EndMT。

綜上，miR-155異常低表達(dá)可能和AMI密切相關(guān)，上調(diào)其表達(dá)能抑制CFs的增殖和S期阻滯及AMI小鼠的心肌纖維化進(jìn)程，并且miR-155是通過(guò)靶向調(diào)控TGFBR1和TGFBR2從而抑制EndMT，可能對(duì)AMI誘導(dǎo)的心肌纖維化具有抑制作用。