陳程 史碩 麻雯熠 劉東慧 陳志宏
(1承德醫(yī)學院,河北 承德 067000;2石家莊醫(yī)學高等??茖W校)
糖尿病腎病(DN)是糖尿病最常見、最嚴重的微血管并發(fā)癥之一,早期即可出現蛋白尿〔1,2〕。目前,DN的發(fā)病機制雖尚未明確,但研究發(fā)現腎小球濾過屏障的結構或功能異常,對最終進展為蛋白尿和腎衰竭具有重要影響〔3,4〕。足細胞作為腎小球濾過血漿的最后屏障,在保持屏障的完整性及預防蛋白尿方面發(fā)揮著重要作用。微小RNA(miRNA)可通過特異性識別并結合目的信使RNA(mRNA)3′端非翻譯區(qū),誘導mRNA降解或阻滯蛋白質翻譯過程,起到轉錄后調控基因表達的作用〔5,6〕。miR-346是miRNA家族中的一員,有研究發(fā)現其可參與眾多疾病的炎癥反應過程,并在DN時呈現低表達狀態(tài)〔7〕,這提示miR-346可能在DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。絲膠是從蠶繭中提取的一種天然水溶性蛋白,前期研究發(fā)現其能有效降低2型糖尿病大鼠的血糖,并對糖尿病時腎臟損傷具有保護作用〔8,9〕,但具體機制尚不清楚。本研究探討絲膠是否通過調控miR-346的表達來發(fā)揮對高糖致足細胞損傷的保護作用。
1.1材料 條件永生化小鼠足細胞(MPC)細胞株(上海中喬新舟生物科技有限公司);絲膠(美國Sigma公司);RPMI1640無糖培養(yǎng)基(武漢普諾賽科技有限公司);PCR引物(miR-346、β-actin)、RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒、mRNA提取試劑盒、cDNA第一鏈合成試劑盒、熒光定量擴增試劑盒(北京天根生化科技有限公司);PCR引物〔白細胞介素(IL-18),寶生物工程(大連)有限公司〕;兔抗Nephrin單克隆抗體(美國Abcam公司);兔抗GAPDH單克隆抗體(美國ABclonal公司);山羊抗兔IgG二抗(北京義翹神州科技有限公司);二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒(北京索萊寶科技有限公司);小鼠IL-18酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國RayBiotech公司)。
1.2實驗方法
1.2.1觀察絲膠對高糖致損傷足細胞中Nephrin、miR-346、IL-18表達的影響及確定絲膠保護作用的最佳劑量
1.2.1.1細胞培養(yǎng) 將條件永生化小鼠足細胞培養(yǎng)在含5.5 mmol/L葡萄糖、10%胎牛血清、1%青鏈霉素、50 U/ml γ-干擾素的RPMI1640無糖培養(yǎng)基中,先置于33℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中增殖傳代,再將傳代的足細胞用不含γ-干擾素的RPMI1640無糖培養(yǎng)基在37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)7~14 d誘導其分化,待分化成熟后用于后續(xù)試驗。
1.2.1.2細胞分組 將處于對數生長期的成熟足細胞隨機分為6組:正常組(NG組:5.5 mmol/L葡萄糖)、高滲對照組(MG組:5.5 mmol/L葡萄糖+24.5 mmol/L甘露醇)、高糖組(HG組:30 mmol/L葡萄糖)、絲膠低劑量治療組(LS組:30 mmol/L葡萄糖+150 μg/ml絲膠)、絲膠中劑量治療組(MS組:30 mmol/L葡萄糖+300 μg/ml絲膠),絲膠高劑量治療組(HS組:30 mmol/L葡萄糖+600 μg/ml絲膠),同步化處理12 h后,按上述條件給藥培養(yǎng)48 h。
1.2.1.3Western印跡檢測各組足細胞Nephrin蛋白表達 將各組足細胞用磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后,加入蛋白裂解液(RIPA∶PMSF∶磷酸酶抑制劑=100∶1∶1)于冰上裂解30 min,用細胞刮輕輕刮取細胞制備細胞懸液后,于4℃環(huán)境中12 000 r/min離心15 min,收集的上清即為足細胞總蛋白。將提取的總蛋白定量后取30 μg上樣,10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE),轉膜,封閉后一抗(稀釋比例:Nephrin 1∶1 000,GAPDH 1∶10 000)、二抗(稀釋比例1∶10 000)室溫搖床分別孵育2 h,洗膜后顯影并應用Quantity One-v4.6.2軟件計算Nephrin蛋白與GAPDH條帶灰度值的比值,結果作為Nephrin蛋白的相對表達水平。
1.2.1.4Real time PCR法檢測各組足細胞IL-18及miR-346 mRNA的表達 將各組足細胞用PBS清洗后,分別提取miRNA(裂解液MZ)和總RNA(裂解液RL),測定純度和濃度后反轉錄成cDNA。以各組足細胞的cDNA為模板,利用Real time PCR法擴增miR-346、IL-18及β-actin片段,得到各目的mRNA的循環(huán)數(CT值)、擴增曲線及溶解曲線。采用2-ΔΔCt法對結果進行統(tǒng)計學分析,結果作為miR-346及IL-18 mRNA的相對表達水平。
1.2.1.5ELISA法檢測各組足細胞IL-18蛋白的表達 取各組足細胞上清液,按小鼠IL-18 ELISA試劑盒說明書進行檢測,最終用酶標儀測定450 nm處的吸光度值后計算出對應濃度,結果作為IL-18蛋白的相對表達水平。
1.2.2觀察絲膠是否通過調控miR-346的表達發(fā)揮對高糖致損傷足細胞的保護作用
1.2.2.1細胞培養(yǎng) 方法同1.2.1.1。
1.2.2.2采用miR-346抑制劑(MicrOFF mmu-miR-346-5p inhibitor)轉染足細胞并分組 根據1.2.1.3、1.2.1.4及1.2.1.5的結果,確定絲膠的最佳作用濃度為600 μg/ml。采用miR-346抑制劑MicrOFF mmu-miR-346-5p inhibitor轉染足細胞,將分化好的足細胞隨機分為正常(NG1)組、高糖(HG1)組、絲膠治療(HS1)組、miR-346抑制劑(MI)組及miR-346抑制劑對照(MIC)組。將MI組及MIC組足細胞種于六孔板中,在含600 μg/ml絲膠無血清無雙抗的培養(yǎng)基中分別按10∶1、50∶1及50∶1的比例加入Lipofectamine?2000 Reagent、MicrOFF mmu-miR-346-5p inhibitor及MicrOFF mmu-miR-346-5p control混勻后分別標記為溶液①、②、③,室溫孵育5 min后,將溶液②、③分別按1∶1的比例與溶液①混勻后分別加入MI組及MIC組足細胞的6孔板中,置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h,NG1組、HG1組及HS1組足細胞分別采用含5.5 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L葡萄糖、30 mmol/L葡萄糖+600 μg/ml絲膠的無血清無雙抗培養(yǎng)液培養(yǎng),時間及培養(yǎng)條件同MI組及MIC組。
1.2.2.3Real time PCR法檢測各組足細胞IL-18 mRNA的表達 方法同1.2.1.4。
1.2.2.4ELISA法檢測各組足細胞IL-18蛋白的表達 方法同1.2.1.5。
1.3統(tǒng)計學處理 采用IBM SPSS Statistics21.0軟件,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。
2.1絲膠對高糖致損傷足細胞中Nephrin、miR-346、IL-18表達的影響及絲膠保護作用的最佳劑量
2.1.1各組足細胞Nephrin蛋白的表達 HG組足細胞Nephrin蛋白表達較NG組明顯降低(P<0.05);MG組足細胞Nephrin蛋白表達與NG組相比無明顯差異(P>0.05);LS、MS及HS三組足細胞Nephrin蛋白表達較HG組均明顯升高(P<0.05)。見圖1、表1。
2.1.2各組足細胞miR-346 mRNA表達 NG、MG及HG三組足細胞miR-346 mRNA表達無明顯差異(P>0.05);LS、MS及HS三組足細胞miR-346 mRNA表達較HG組均明顯升高(P<0.05),且LS、MS、HS三組足細胞miR-346 mRNA表達依次升高,兩兩比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。
2.1.3各組足細胞IL-18的表達 與NG組足細胞相比,HG組IL-18蛋白及mRNA表達均明顯升高(P<0.05),MG組IL-18蛋白及mRNA表達均無明顯差異(P>0.05);與HG組足細胞相比,LS、MS及HS三組IL-18蛋白及mRNA表達均明顯降低(P<0.05),且LS、MS、HS三組IL-18蛋白及mRNA表達依次降低,兩兩比較差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1。
2.2采用miR-346抑制劑(MicrOFF mmu-miR-346-5p inhibitor)轉染足細胞后,IL-18的表達 NG1、HS1、MIC三組間及HG1、MI兩組間足細胞IL-18蛋白及mRNA表達均無明顯差異(P>0.05);HG1及MI組足細胞IL-18蛋白及mRNA表達較NG1組均明顯升高(P<0.05);HS1及MIC組足細胞IL-18蛋白及mRNA表達較HG1及MI組均明顯降低(P<0.05)。見表2。
表1 各組足細胞Nephrin蛋白、miR-346 mRNA、IL-18 蛋白及mRNA表達
表2 miR-346抑制劑轉染足細胞后各組足細胞 IL-18表達
DN出現腎臟損害的早期臨床表現之一是微量蛋白尿,這提示腎小球濾過屏障已受損,通透性發(fā)生了改變。腎小球濾過屏障包括內皮細胞、腎小球基底膜和足細胞三層,其中足細胞作為腎小球濾過屏障的重要組成部分,其結構或功能受損與蛋白尿的發(fā)生密切相關,因此許多學者也將DN歸為“足細胞病”〔10,11〕。足細胞是一種高度分化的上皮細胞,由細胞體、初級突起和足突三部分組成,相鄰足突間有裂孔隔膜(SD)相連,水和小分子物質可自由通過SD,但蛋白質等大分子物質卻被阻攔。研究發(fā)現在高糖刺激下,足細胞會出現肥大、數目減少及足突融合等病理變化,導致腎小球濾過屏障的通透性增加,進而引發(fā)蛋白尿〔12,13〕。因此,本研究采用高濃度葡萄糖培養(yǎng)來建立足細胞損傷模型,以特異性表達于足細胞的Nephrin蛋白表達降低作為成模標準。
miRNA可通過多種信號途徑介導腎臟炎癥反應、足細胞凋亡及腎組織纖維化等病理過程,從而影響DN的發(fā)生發(fā)展〔14〕。miR-346是新近發(fā)現的一種miRNA,有研究通過全基因組miRNAs芯片及實時熒光定量PCR篩選后發(fā)現其在DN時呈現低表達狀態(tài),并且在采用miR-346質粒對DN小鼠治療后發(fā)現,實驗過程中小鼠血糖水平及體重無明顯變化,但蛋白尿的癥狀卻明顯改善,同時實驗結束DN模型小鼠腎小球組織結構的病理變化已明顯改善〔7〕,這表明miR-346可能在DN的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。此外,研究表明miR-346可參與人體炎癥反應,并發(fā)揮負調節(jié)作用。IL-18屬于白細胞介素家族,是一種重要的促炎性因子,Alsaleh等〔15〕在針對類風濕性關節(jié)炎的研究中發(fā)現,miR-346可通過調控IL-18的表達來減輕脂多糖介導的成纖維滑膜細胞的炎癥反應。
DN是糖尿病微血管病變中最主要的并發(fā)癥之一,據統(tǒng)計,近三分之一的糖尿病患者會發(fā)展為DN〔16,17〕,因此,尋找一種安全有效的治療藥物已迫在眉睫。目前臨床用于治療DN的西藥雖具有明顯降低血糖、血壓的優(yōu)勢,但對DN導致的靶器官損傷的保護作用卻較薄弱。隨著對天然藥物的深入研究,發(fā)現天然藥物在防治DN及其并發(fā)癥、改善全身整體狀況方面表現出一定的優(yōu)勢。絲膠是蠶繭中的一種天然水溶性蛋白,主要由18種氨基酸組成,分子結構中羥基、羧基和氨基等強極性側基的氨基酸占絕大多數,具有生物相容性可生物降解〔18,19〕。我國民間早有開水浸泡蠶繭后溫服用以輔助控制血糖的經驗方法,課題組前期研究亦發(fā)現絲膠對2型糖尿病大鼠腎臟損傷具有保護作用,但具體機制仍需深入探討。本研究提示絲膠對高糖致損傷足細胞的保護作用可能與提高miR-346的表達而抑制炎癥反應有關。本研究結果表明絲膠可通過提高miR-346的表達來抑制IL-18的表達進而減輕足細胞炎癥反應,從而對高糖所致的足細胞損傷起保護作用。絲膠對高糖所致足細胞損傷的保護作用機制可能還有很多種途徑,有待進一步研究。