池寧娟 劉明義 馮娟 石小鵬 王婧雯

(空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院藥劑科，陜西 西安 710032)

良性前列腺增生(BPH)是引起中老年男性排尿障礙最常見的一種良性疾病，其發(fā)病率隨著年齡而增加〔1〕。BPH在中醫(yī)上屬于“癃閉”“淋證”的范疇，其主要的病機(jī)是濕熱蘊(yùn)結(jié)、氣滯血瘀、脾腎氣虛等〔2〕。如意金黃貼(RYT)是本研究依據(jù)《中國藥典》2015版一部如意金黃散制成的外用貼劑，具有清熱解毒，消腫止痛的功效，在臨床上用于治療BPH有較好的療效，但其作用機(jī)制并不清楚〔3,4〕。本實(shí)驗(yàn)探討RYT對(duì)BPH大鼠前列腺指數(shù)的影響及其可能的作用機(jī)制，以期為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SD雄性大鼠，體重180～200 g，由空軍軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，醫(yī)動(dòng)證字SCXK(軍)2016-0007，動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(軍) 2016-0023。大鼠均在溫度(25±2)℃、相對(duì)濕度45%～65%、光照12 h的清潔環(huán)境中飼養(yǎng)1 w后實(shí)驗(yàn)，飼養(yǎng)期間大鼠自由進(jìn)食、飲水。

1.2實(shí)驗(yàn)藥物和試劑 RYT RYT由醫(yī)院藥劑科制(批號(hào)：20161201)，每貼面積為18.84 cm2，重量2.9 g，每克相當(dāng)于表面積6.50 cm2，含生藥0.674 g/cm2；丙酸睪酮注射液，上海通用藥業(yè)股份有限公司(批號(hào)：160702)，規(guī)格：25 mg/ml；保列治(Finasteride)：杭州默沙東制藥有限公司(批號(hào)：R009405；規(guī)格：5 mg/片)。轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子(TGF)β1和前列腺素內(nèi)過氧化物合成酶(PTGS)2引物購于TakaRa公司。兔抗-Ⅰ型前膠原蛋白(Pro-COL-Ⅰ)、Ⅰ型膠原蛋白(COL-Ⅰ)、血管細(xì)胞黏附分子(VCAM)-1、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)、磷酸化ERK(p-ERK)、原癌基因c-Jun、c-Fos、山羊抗小鼠、兔IgG標(biāo)記的辣根過氧化物酶(HRP)抗體均購自 Santa Cruz 公司。RAPI組織細(xì)胞裂解液購自上海碧云天公司，聚偏二氟乙烯(PVDF)膜、HRP化學(xué)發(fā)光底物購于Millipore公司。iQTM5多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀，設(shè)備編號(hào)：582BR016236，購自美國Bio-Rad公司；多功能酶標(biāo)儀，設(shè)備編號(hào)：N05C023603，購自德國貝克曼公司；電泳儀，設(shè)備編號(hào)：N10B014643，購自美國Bio-Rad公司。

1.3實(shí)驗(yàn)流程

1.3.1動(dòng)物分組 取潔凈級(jí)雄性SD大鼠40只，隨機(jī)分為5組，即對(duì)照組、模型組、保列治組、RYT高劑量組、RYT低劑量組，每組8只。

1.3.2模型建立與給藥方法 對(duì)照組注射生理鹽水0.5 ml/kg，其余各組大鼠皮下注射丙酸睪酮10 mg/kg，每天1次，連續(xù)30 d。于造模第1天起給予藥物干預(yù)，保列治組灌胃給藥保列治(4.5 mg/kg)，RYT高、低劑量組背部脫毛區(qū)分別貼42.0 cm2/kg、21.0 cm2/kg的藥物，對(duì)照組和模型組的大鼠背部脫毛區(qū)均貼基質(zhì)貼，每天給藥1次，連續(xù)30 d。

1.3.3標(biāo)本采集 末次用藥后大鼠禁食12 h，稱體重，處死大鼠，取前列腺隨即稱重，計(jì)算前列腺指數(shù)(臟器重量/體重×1 000)。取前列腺組織腹葉2份，液氮凍存，一份RT-PCR測(cè)定前列腺組織中TGFβ1和PTGS2 mRNA表達(dá)，另一份Western印跡測(cè)定前列腺組織中有關(guān)蛋白的表達(dá)。

1.3.4RT-PCR分析前列腺組織中TGFβ1和PTGS2 mRNA表達(dá) 按照TaKaRa公司的說明書操作提取總RNA，紫外分光光度法測(cè)定RNA的含量及純度，經(jīng)測(cè)定A260/A280比值在1.8～2.0之間,進(jìn)行cDNA模板合成。引物設(shè)計(jì)根據(jù)目的基因Genbank中的已知序列，由TakaRa設(shè)計(jì)并合成，GAPDH為內(nèi)參。逆轉(zhuǎn)錄PCR嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行，iQTM5多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀定量分析。RT-PCR引物合成序列：TGFβ1上游引物：5′-TCAGTGCCACATACCAACTGGAG-3′，下游：5′-GTGCCAACCGGTACCTTGCTA-3′(150 bp)；PTGS2上游引物：5′-GCGACTGTTCCAAACCAGCA-3′，下游：5′-TGGGT-CGAACTTGAGTTTGAAGTG-3′(112 bp)；GAPDH上游引物：5′-ATGGTGGTGAAGACGCCAGTA-3′，下游：5′-GGCACGTCAAGGCTGAGAATG-3′(143 bp)。

1.3.5Western印跡檢測(cè)前列腺組織中Pro-COL-1、COL-1、VCAM-1、ERK、p-ERK、c-Jun和c-Fos蛋白表達(dá) 取凍存于液氮的前列腺組織，每組取樣品2塊置于冰浴玻璃研磨器中，加入1 ml組織裂解液，反復(fù)研磨使組織沉淀均勻地溶散在裂解液中，冰浴上裂解30 min，每隔10 min振搖1次。4℃ 12 000 r/min離心20 min，上清液即為組織蛋白提取液。BCA 法測(cè)定蛋白含量，總蛋白樣品加入等體積變性液煮沸10 min。調(diào)整上樣量為25 μg 蛋白/泳道，經(jīng)10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝電泳(SDS-PAGE)，半干轉(zhuǎn)膜、封閉，分別與抗Pro-COL-1(1∶500)、COL-1(1∶500)、VCAM-1(1∶500)、ERK(1∶500)、p-ERK(1∶1 000)、c-Jun(1∶400)、c-Fos(1∶500)一抗反應(yīng)，4℃孵育過夜，加入HRP標(biāo)記的二抗(1∶3 000 ～ 1∶5 000)，37℃孵育 50～70 min，化學(xué)發(fā)光、顯影、壓片，以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，采用圖像分析軟件計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用 SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、Games-Howell檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1RYT對(duì)BPH大鼠前列腺指數(shù)的影響 與對(duì)照組比較，模型組前列腺指數(shù)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與模型組比較，保列治組、RYT高、低劑量組大鼠前列腺指數(shù)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2RYT對(duì)BPH大鼠前列腺組織中TGFβ1、PTGS2 mRNA表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組前列腺組織中TGFβ1、PTGS2 mRNA表達(dá)顯著增高(P<0.05)。與模型組比較，保列治組和RYT高、低劑量組TGFβ1、PTGS2 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 各組前列腺指數(shù)及前列腺組織中TGFβ1、 PTGS2 mRNA的表達(dá)

2.3RYT對(duì)BPH大鼠前列腺組織中Pro-COL-1、COL-1、VCAM-1蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組Pro-COL-1表達(dá)增加(P<0.05)，VCAM-1表達(dá)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而COL-1表達(dá)增加不顯著(P>0.05)。與模型組比較，RYT高劑量組COL-1下降、VCAM-1表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；RYT低劑量組Pro-COL-1表達(dá)下降、VCAM-1表達(dá)增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

2.4RYT對(duì)BPH大鼠前列腺組織中ERK、p-ERK、c-Jun和c-Fos蛋白表達(dá)的影響 與對(duì)照組比較，模型組p-ERK表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，c-Fos表達(dá)增加(P<0.05)。與模型組比較，保列治組和RYT高劑量組c-Fos表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，RYT低劑量組p-ERK表達(dá)增加(P<0.05)、c-Fos表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 各組前列腺組織中Pro-COL-1、COL-1、VCAM-1、ERK、p-ERK、c-Jun和c-Fos蛋白表達(dá)

3 討 論

BPH俗稱“前列腺肥大”，是一種緩慢進(jìn)展性、以下尿路癥狀為主的疾病，是老年男性的常見病，隨著年齡增加，患病率顯著增高。目前BPH治療方法主要是外科治療和藥物治療，外科治療效果較好，但大多數(shù)患者為中、老年人，基礎(chǔ)疾病復(fù)雜，不適宜外科手術(shù)治療或不愿意接受手術(shù)治療；而藥物治療主要包括化學(xué)藥物、中藥及中藥制劑治療，化學(xué)藥物有較多不良反應(yīng)，因此，從中藥或中藥制劑中尋找安全、有效的治療方法就顯得尤為必要〔5～8〕。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為濕熱蘊(yùn)結(jié)、氣滯血瘀、腎陽虧虛、腎陰不足、脾腎氣虛等因素為BPH的主要病機(jī)，因此清濕熱、散淤結(jié)、利氣機(jī)、化瘀血、扶元補(bǔ)虛為其治療的原則〔2〕。如意金黃散是出自明代陳實(shí)功的《外科正宗》卷之一，收錄在《中國藥典》(2015 年版)的制劑，處方由姜黃、大黃、黃柏、蒼術(shù)、厚樸、陳皮、甘草、生天南星、白芷和天花粉 10 味中藥組成，具有清熱燥濕、行氣、散瘀、利水消腫的功效〔9〕。RYT是本單位依據(jù)如意金黃散制成的外用貼劑，在臨床上用于治療BPH，且療效顯著。RYT給藥部位為會(huì)陰穴，該穴位主治疾病有小便不利、遺尿、遺精、勃起功能障礙等。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示一定劑量的丙酸睪酮可致大鼠BPH，而RYT可有效抑制由丙酸睪酮所致大鼠BPH所引起的泌尿器官重量的指數(shù)。

目前研究認(rèn)為生長(zhǎng)因子、炎癥反應(yīng)、生殖激素水平紊亂、前列腺間質(zhì)和上皮細(xì)胞相互作用等因素與BPH的發(fā)生密切相關(guān)〔10～12〕。TGFβ1是一種多肽類細(xì)胞生長(zhǎng)因子，具有雙向調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡、分化和增殖等多種生物活性，前列腺發(fā)育的微環(huán)境穩(wěn)態(tài)主要是由促有絲分裂因子的刺激作用和 TGFβ1 的抑制作用的平衡來調(diào)節(jié)，在老年BPH患者血清中 TGFβ1 水平升高〔13〕。PTGS2為一種誘導(dǎo)性即刻反應(yīng)基因，正常生理狀況下，在大多數(shù)組織細(xì)胞不表達(dá)，但在炎癥等病理反應(yīng)過程中，受炎癥介質(zhì)、生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、促癌因子、缺氧、激素等刺激因素作用，其表達(dá)迅速上調(diào)，PTGS2主要產(chǎn)物前列腺素具有抑制細(xì)胞凋亡、促進(jìn)細(xì)胞增殖、抑制免疫監(jiān)視、促進(jìn)血管生成等生物活性〔14〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，BPH大鼠前列腺組織中TGFβ1和PTGS2 mRNA水平顯著上升，而RYT可顯著降低TGFβ1和PTGS2 mRNA水平。

前列腺間質(zhì)與上皮細(xì)胞增殖和凋亡的平衡性破壞被認(rèn)為是BPH發(fā)生和發(fā)展的生物學(xué)基礎(chǔ)，而膠原蛋白(COL)是各組織中的重要成分并構(gòu)成組織細(xì)胞外基質(zhì)，COL-Ⅰ和Pro-COL-Ⅰ水平的異常會(huì)引起組織的增生〔15〕。本研究結(jié)果提示BPH大鼠前列腺組織中COL-Ⅰ和Pro-COL-Ⅰ增加，使用RYT可降低COL-Ⅰ和Pro-COL-Ⅰ表達(dá)水平。VCAM-1是免疫球蛋白超家族成員之一，能介導(dǎo)細(xì)胞黏附和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)〔16〕，ERK是將信號(hào)從表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的關(guān)鍵，它的信號(hào)傳遞途徑是涉及調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育及分裂的信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的核心，p-ERK由胞質(zhì)轉(zhuǎn)位到核內(nèi)，進(jìn)而介導(dǎo)Elk-1、ATF、Ap-1、c-Jun和c-fos的轉(zhuǎn)錄活化，參與細(xì)胞增殖與分化、細(xì)胞形態(tài)維持、細(xì)胞骨架的構(gòu)建、細(xì)胞凋亡和細(xì)胞的癌變等多種生物學(xué)反應(yīng)〔17〕。本研究結(jié)果提示BPH大鼠前列腺組織中VCAM-1、ERK、p-ERK表達(dá)降低、c-Jun和c-fos表達(dá)增加，使用RYT可增加VCAM-1、ERK、p-ERK表達(dá)、降低c-Jun和c-fos表達(dá)。

該藥前期研究〔4〕表明其可降低BPH大鼠前列腺上皮細(xì)胞增生及平滑肌增厚，減輕間質(zhì)纖維細(xì)胞增生，對(duì)MAPK信號(hào)通路的分子有調(diào)節(jié)作用。本研究RYT可能通過降低TGFβ1、Ptgs-2 mRNA和Pro-COL-1及c-Fos表達(dá)，增加VCAM-1和p-ERK表達(dá)而抑制大鼠BPH。本研究通過探討RYT在BPH中的作用及其機(jī)制，為BPH的防治提供了新的思路和方法，也為RYT的臨床應(yīng)用提供了分子機(jī)制依據(jù)。