李仲琪 侯樹(shù)愛(ài) 徐超 宋旭 李劍 李緒剛

(1日照市人民醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，山東 日照 276800；2日照市中心醫(yī)院卒中中心)

創(chuàng)傷失血性休克(THS)是臨床急診常見(jiàn)的高死亡率疾病，其病理生理機(jī)制主要是嚴(yán)重外傷和疾病失血，使機(jī)體有效循環(huán)血量下降、微循環(huán)障礙發(fā)生、細(xì)胞氧代謝紊亂等，導(dǎo)致全身炎癥反應(yīng)和多器官功能障礙，最終導(dǎo)致器官衰竭〔1〕，且受害人群主要是45歲以下的青壯年〔2〕。腸道是機(jī)體最大的內(nèi)毒素庫(kù)，生理狀態(tài)下腸黏膜屏障功能完好，防治多種致病微生物和毒素入侵，而THS早期腸道屏障功能即遭到破壞，細(xì)菌侵入機(jī)體循環(huán)，引發(fā)全身毒性反應(yīng)，導(dǎo)致多器官功能損害〔3〕。有研究發(fā)現(xiàn)活性氧(ROS)介導(dǎo)的腸道黏膜損傷和總抗氧化能力的喪失是THS引起的腸道損傷和功能障礙的關(guān)鍵〔4〕。ROS是重要的細(xì)胞內(nèi)第二信使，可通過(guò)多種信號(hào)途徑，如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)和核因子(NF)-κB，介導(dǎo)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生〔5〕。鹽酸納美芬為新型阿片受體拮抗藥〔6〕，藥理研究表明，鹽酸納美芬可降低炎癥介質(zhì)的釋放和自由基的產(chǎn)生，改善腦細(xì)胞能量代謝，具有神經(jīng)保護(hù)作用〔7,8〕；當(dāng)前已在臨床上用于治療創(chuàng)傷性休克，可積極影響血流動(dòng)力學(xué)(心率、平均動(dòng)脈壓)，明顯降低血漿腫瘤壞死因子(TNF)-α、一氧化氮(NO)和內(nèi)毒素(ET)水平〔9〕；還可以通過(guò)調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)與氧化應(yīng)激指標(biāo)水平，預(yù)防機(jī)體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，幫助急性酒精中毒昏迷患者盡快蘇醒〔10〕。但鹽酸納美芬對(duì)創(chuàng)傷性休克的保護(hù)機(jī)制尚不明確，對(duì)THS腸黏膜屏障損傷的影響尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道，本研究通過(guò)建立創(chuàng)傷失血性休克大鼠模型，探究鹽酸納美芬對(duì)創(chuàng)傷性休克腸黏膜屏障損傷的影響及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)健康SD雄性大鼠70只，體重(280±20)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)為SCXK(京)2016-0011。所有動(dòng)物嚴(yán)格按照動(dòng)物飼養(yǎng)規(guī)則喂養(yǎng)，溫度為24℃，濕度為50%，12 h明暗交替，自由飲水和攝食。適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后開(kāi)始實(shí)驗(yàn)。

1.2藥品及試劑 鹽酸納美芬注射液(北京四環(huán)制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20120125，1 ml:0.1 mg)；乳酸鈉林格注射液(輔仁藥業(yè)集團(tuán)有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字H20103236，500 ml)；戊巴比妥鈉(中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司，批號(hào)：F20020915，每瓶25 g)；肝素鈉(Solarbio，H8060，每瓶1 g)；大鼠TNF-α(RA20035)、ET(RA20354)、D乳酸(LA，RA20770)及二胺氧化酶(DAO，RA20028)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒均購(gòu)自武漢貝茵萊生物科技有限公司，ROS測(cè)定試劑盒(化學(xué)熒光法，E004-1-1)、總超氧化物歧化酶(SOD)測(cè)定試劑盒(WST-1法，A001-3-2)、丙二醛(MDA)測(cè)定試劑盒(TBA法，A003-1-2)均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；兔抗p38MAPK抗體(ab170099)、兔抗磷酸化(p)-p38MAPK抗體(ab38238)、兔抗GAPDH抗體(ab9485)、山羊抗兔IgG H&L辣根過(guò)氧化物酶(HRP，ab205718)均購(gòu)自英國(guó)abcam公司；蘇木素-伊紅(HE)染色試劑、放射免疫沉淀測(cè)定(RIPA)裂解液和二喹啉甲酸(BCA)試劑盒(碧云天生物科技公司，批號(hào)分別為C0105、P0013B、P0012S)；聚乙烯導(dǎo)管(美國(guó)BD公司，批號(hào)：80430022)、多功能酶標(biāo)儀(iMark680，Bio-Rad公司)、電動(dòng)顯微鏡(日本Olympus公司)、BL-420F生物功能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)。

1.3方法

1.3.1動(dòng)物分組及模型復(fù)制 從70只大鼠中隨機(jī)選取12只為假手術(shù)(Sham)組，其余大鼠參照文獻(xiàn)〔4,11,12〕采用雙側(cè)股骨中上段閉合性骨折+股動(dòng)脈放血的方法復(fù)制THS大鼠模型。具體方法為：各組大鼠術(shù)前禁食12 h，戊巴比妥鈉(30 mg/kg)腹腔注射麻醉，大鼠仰臥位固定于手術(shù)臺(tái)上，暴露一側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈、靜脈，顯微鏡下放置導(dǎo)管，連接BL-420生物技能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)大鼠的平均動(dòng)脈壓，同時(shí)經(jīng)靜脈導(dǎo)管注入肝素(125 U/kg)，使全身肝素化。用骨鉗夾大鼠股骨造成雙側(cè)股骨完全性骨折，之后暴露股動(dòng)脈進(jìn)行插管放血(放出的血液存儲(chǔ)于無(wú)菌無(wú)熱原的瓶子中，加入肝素10 U/ml抗凝)，使平均動(dòng)脈壓降至40 mmHg，維持血壓1 h。1 h后經(jīng)靜脈緩慢回輸抽出的血液，加2倍放血量的乳酸鈉林格液進(jìn)行復(fù)蘇，復(fù)蘇后縫合血管和傷口，建立大鼠創(chuàng)傷失血性休克模型。假手術(shù)組進(jìn)行相同的手術(shù)操作，但不進(jìn)行創(chuàng)傷、放血、回輸血液及復(fù)蘇過(guò)程。復(fù)蘇前若大鼠出現(xiàn)死亡，補(bǔ)充新大鼠。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中死亡10只，剩余48只大鼠分為T(mén)HS組、鹽酸納美芬低、中、高劑量組(0.05、0.10、0.20 mg/kg)〔13〕，每組12只。

1.3.2給藥 鹽酸納美芬各劑量組在復(fù)蘇的同時(shí)靜脈注射相應(yīng)劑量的鹽酸納美芬注射液。鹽酸納美芬成人每日給藥劑量為0.5 mg，給藥劑量按成人平均體重60 kg體表面積換算，大鼠對(duì)應(yīng)給藥劑量為成人的6.3倍，則大鼠每日給藥劑量為0.05 mg/kg，因此設(shè)置低、中、高劑量藥物劑量為0.05、0.10、0.20 mg/kg。

1.4檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1HE染色及Chiu評(píng)分 各組于給藥結(jié)束24 h后，戊巴比妥腹腔注射麻醉，腹主動(dòng)脈取血，取血完成后，在距回盲部5 cm處環(huán)切回腸組織樣本。取部分腸組織4%的多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，進(jìn)行HE染色，二甲苯及梯度酒精脫蠟入水，蒸餾水沖洗，蘇木素染色8 min，自來(lái)水沖去浮色，1%鹽酸酒精分色，伊紅染色5 min，自來(lái)水流水洗3次，至無(wú)色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，光鏡下觀察腸黏膜損傷情況，采用Chiu評(píng)分法〔14〕評(píng)價(jià)回腸黏膜損傷程度，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分，無(wú)明顯損傷,黏膜絨毛結(jié)構(gòu)正常；1分，腸黏膜絨毛頂端上皮下間隙增寬,少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；2分， 絨毛上皮下間隙進(jìn)一步擴(kuò)大,絨毛頂尖端上皮抬高與固有層分離；3分，絨毛兩邊上皮成塊脫落,大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及淋巴細(xì)胞增生；4分，上皮完全脫落,僅存固有層結(jié)構(gòu)；5分，黏膜固有層崩解,出現(xiàn)出血和潰瘍。每只動(dòng)物觀察10個(gè)高倍鏡視野，取其平均值。

1.4.2檢測(cè)血清中TNF-α、ET、D-LA含量及DAO活性 取1.4.1中血清，ELISA檢測(cè)血清中DAO活性、D-LA、ET及TNF-α含量。

1.4.3檢測(cè)腸組織DAO活性、SOD、MDA、ROS水平 取大鼠小腸組織，制備10%的組織勻漿，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作檢測(cè)勻漿中DAO活性、SOD、MDA、ROS水平。

1.4.4Western印跡檢測(cè)腸組織p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá) 稱(chēng)取部分腸組織，放入組織凍存管中，液氮保存，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)的操作提取組織中的總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，取等量蛋白質(zhì)樣品(30 μg/孔)上樣，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉，加入一抗(p38MAPK，p-p38MAPK，按1∶1 000的比例稀釋?zhuān)籊APDH，1∶2 000稀釋)，4℃下孵育過(guò)夜，辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗(1∶5 000)室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光試劑(ECL)顯色，以GAPDH為內(nèi)參，通過(guò)與內(nèi)參的灰度比，得出目的條帶的相對(duì)表達(dá)水平。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS22.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)、方差分析、組間采用SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1鹽酸納美芬對(duì)THS大鼠腸黏膜組織病理學(xué)變化的影響 Sham組大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞層完整，固有層內(nèi)僅見(jiàn)極少量淋巴細(xì)胞，未見(jiàn)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，腸黏膜細(xì)胞無(wú)明顯病理改變；THS組大鼠腸黏膜上皮細(xì)胞層下間質(zhì)水腫，間隙增寬，小腸絨毛生長(zhǎng)稀疏、水腫、長(zhǎng)短不一，部分絨毛脫落，固有層大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)及淋巴細(xì)胞增生，部分腸黏膜固有層內(nèi)腺體有灶性壞死，形成糜爛點(diǎn)；鹽酸納美芬高、中劑量組小腸絨毛水腫、脫落情況明顯減輕，固有層可見(jiàn)少量中性粒細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，未見(jiàn)上皮細(xì)胞壞死；見(jiàn)圖1。Chiu評(píng)分結(jié)果顯示，與Sham組〔(0.45±0.11)分〕相比，THS組大鼠腸黏膜損傷評(píng)分顯著升高〔(4.21±0.46)分，P<0.05〕；與THS組相比，鹽酸納美芬高、中劑量組腸黏膜損傷評(píng)分明顯降低〔(2.85±0.34)分、(3.38±0.47)分，P<0.05〕，鹽酸納美芬低劑量組腸黏膜損傷評(píng)分〔(3.72±0.42)分〕有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 光鏡下小腸黏膜形態(tài)學(xué)改變(HE染色，×200)

2.2鹽酸納美芬對(duì)THS大鼠血清TNF-α、ET、D-LA含量及DAO活性的影響 與Sham組相比，THS組血清TNF-α、ET、D-LA含量及DAO活性顯著升高(P<0.05)；與THS組相比，鹽酸納美芬高、中劑量組TNF-α、ET、D-LA含量及DAO活性明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.3鹽酸納美芬對(duì)THS大鼠腸組織DAO活性、ROS、SOD、MDA水平的影響 與Sham組相比，THS組腸組織ROS、MDA水平顯著升高，DAO活性、SOD水平顯著降低(P<0.05)；與THS組相比，鹽酸納美芬高、中、低劑量組(除MDA外)腸組織ROS、MDA水平明顯降低，DAO活性、SOD水平明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)表1。

2.4鹽酸納美芬對(duì)THS大鼠腸組織p38MAPK、p-p38MAPK蛋白表達(dá)的影響 與Sham組相比，THS組腸組織p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；與THS組相比，鹽酸納美芬高、中、低劑量組腸組織p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表1、圖2。

表1 鹽酸納美芬對(duì)THS大鼠血清TNF-α、ET、D-LA含量、DAO活性及腸組織DAO活性、 ROS、SOD、MDA水平及p-p38MAPK/p38MAPK蛋白表達(dá)的影響

1～8：Sham組，THS組，鹽酸納美芬高劑量組，鹽酸納美芬中劑量組，鹽酸納美芬低劑量組圖2 Western印跡檢測(cè)大鼠腸組織 p-p38MAPK/p38MAPK蛋白

3 討 論

腸屏障功能障礙與THS引起的多器官功能障礙綜合征(MODS)的發(fā)展有關(guān)，是導(dǎo)致多器官衰竭的啟動(dòng)因素，也是THS死亡的重要原因之一。腸道是機(jī)體發(fā)生缺血時(shí)出現(xiàn)反應(yīng)最為敏感的器官之一，尤其是在THS發(fā)生時(shí)，腸道損傷發(fā)生最早，且恢復(fù)最晚；且兩者常相互影響，休克的發(fā)生可導(dǎo)致腸黏膜屏障損傷，而腸黏膜屏障損傷可進(jìn)一步加重休克；然而，THS誘導(dǎo)的腸道屏障損傷的機(jī)制仍知之甚少。液體復(fù)蘇或盡快恢復(fù)血管內(nèi)容積被認(rèn)為是治療THS并降低死亡率的最有效措施〔15〕，但是，由于缺血再灌注損傷(IRI)和MODS，液體復(fù)蘇后死亡率仍然很高〔16〕。因此，充分了解其發(fā)病機(jī)制，防止休克時(shí)腸黏膜屏障損傷對(duì)抗休克治療起到非常重要的作用。

鹽酸納美芬是常見(jiàn)的純阿片受體阻滯藥物，有研究報(bào)道，鹽酸納美芬可抑制炎癥介質(zhì)釋放、減少自由基產(chǎn)生和小膠質(zhì)細(xì)胞活化，有效改善創(chuàng)傷性顱腦損傷癥狀；可明顯降低急性酒精中毒昏迷患者血清β內(nèi)啡肽(EP)、MDA水平，升高SOD水平，縮短患者蘇醒時(shí)間和癥狀消失時(shí)間，且療效好、安全性高〔10〕；臨床已用于創(chuàng)傷性休克的治療，可有效降低創(chuàng)傷性休克患者血清NO、ET、心肌肌鈣蛋白(cTn)I水平，減輕休克癥狀〔17〕；但鹽酸納美芬是否能改善休克復(fù)蘇后腸道形態(tài)學(xué)損傷和屏障功能相關(guān)指標(biāo)至今未有文獻(xiàn)報(bào)道。血清ET、D-LA和DAO的水平是腸屏障功能受損的標(biāo)志物，正常情況下在血清中的含量很少，當(dāng)腸道屏障功能損害時(shí)，腸道內(nèi)ET、DAO、D-LA大量釋放入血，使血清中ET、DAO、D-LA升高，腸組織中DAO活性降低〔18〕。鄧哲等〔14〕研究發(fā)現(xiàn)，大鼠創(chuàng)傷性休克后2 h，即出現(xiàn)小腸黏膜Chiu評(píng)分、腸組織MDA含量、血漿TNF-α和D-LA含量增加，而腸組織DAO活性降低；本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致，提示鹽酸納美芬可增強(qiáng)THS大鼠腸黏膜屏障功能，改善腸黏膜損傷。

ROS的過(guò)度積累會(huì)破壞細(xì)胞體內(nèi)穩(wěn)態(tài)，導(dǎo)致氧化應(yīng)激和細(xì)胞功能障礙〔19〕。ROS可通過(guò)多種信號(hào)途徑，介導(dǎo)胞內(nèi)氧化應(yīng)激狀態(tài)和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，其中MAPK級(jí)聯(lián)通路是重要的調(diào)節(jié)通路。Jordan等〔4〕發(fā)現(xiàn)THS發(fā)生3 h時(shí)腸道黏液層已被ROS破壞，黏液抗氧化能力下降，腸屏障滲透性增加，用自由基清除劑二甲亞砜(DMSO)可以消除THS誘導(dǎo)的腸道屏障破壞；Barrett等〔20〕使用THS的小鼠模型模擬患者的臨床狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)THS發(fā)生后，大量的ROS釋放，可導(dǎo)致內(nèi)皮屏障功能喪失，引起器官損傷；清除ROS可減輕熱應(yīng)激引起的腸道損傷和細(xì)胞凋亡〔21〕。MAPK通路已被充分證明在氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的腸細(xì)胞損傷和腸炎癥中被激活〔22〕。羅麗芳等〔23〕、曹軍軍等〔24〕研究發(fā)現(xiàn)ROS可激活p38MAPK通路，引起心肌纖維化和細(xì)胞凋亡，加入抗氧劑后，ROS水平明顯降低，p38MAPK蛋白磷酸化明顯減少，證明p38MAPK通路的激活可能是由于ROS水平的升高；Jiao等〔25〕研究發(fā)現(xiàn)雙酚A暴露可增加細(xì)胞內(nèi)ROS，通過(guò)激活ROS-p38MAPK通路，導(dǎo)致腸上皮細(xì)胞線粒體功能障礙、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡，損害腸道物理屏障功能，谷氨酰胺可通過(guò)使ROS-p38MAPK通路正?；迯?fù)腸損傷。本研究結(jié)果提示鹽酸納美芬可能通過(guò)降低ROS，抑制p38MAPK蛋白磷酸化，改善氧化應(yīng)激狀態(tài)，降低炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生。