袁琳 李潔 王芳 李可

(1蘇州市中西醫(yī)結合醫(yī)院老年科，江蘇 蘇州 215101；2徐州醫(yī)科大學附屬醫(yī)院神經(jīng)內科監(jiān)護室)

腦性癱瘓(腦癱)是一種神經(jīng)發(fā)育障礙性腦損傷疾病，其主要臨床特征是肌張力、運動和運動技能異?！?,2〕，研究報道，我國腦癱患病率為5.40%〔3〕。因此研究腦癱的發(fā)病機制，對其臨床治療有重要意義。研究表明，凋亡是神經(jīng)細胞發(fā)育和自然死亡的重要過程，凋亡機制紊亂會引起缺血性腦血管病、帕金森病等多種神經(jīng)疾病的發(fā)生〔4,5〕，磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B(PI3K/Akt)是組織細胞內的中央網(wǎng)絡，調節(jié)細胞增殖、遷移和凋亡，并參與調控神經(jīng)元細胞信號的傳導〔6〕。丁苯酞是一種具有抗腦缺血作用的藥物，能夠有效治療腦梗死、缺血性腦血管疾病〔7,8〕。然而，丁苯酞在腦癱中的作用研究報道較少，本研究通過觀察丁苯酞對腦癱大鼠的影響，探討其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF清潔級SD大鼠75只，8周齡，體重約為250 g，由北京生命科學研究所動物實驗中心提供，合格證號為SYXK(京)2015-0002，適應性飼養(yǎng)1 w后，進行后續(xù)實驗。本研究經(jīng)醫(yī)院動物倫理委員會批準同意。

1.2試劑及儀器 丁苯酞(貨號： hzm2479)購自上海滬崢生物科技有限公司；蘇木素染液(貨號：G1080)、伊紅染液(貨號：G1100)購自北京索萊寶科技有限公司；TUNEL試劑盒(貨號：C1086)購自碧云天生物技術研究所；PI3K抗體(貨號：ab32089)、AKT抗體(貨號：ab38449)、p-AKT抗體(貨號：ab8805)、GAPDH抗體(貨號：ab181602)、B細胞淋巴瘤(Bcl)-2抗體(貨號：ab182858)、Bcl-2相關X蛋白(Bax)抗體均購自美國abcam公司；p-PI3K抗體(貨號：XGK0788)購自上海西格生物科技有限公司；辣根過氧化物酶標記的二抗(貨號：BHR101)購自北京博爾西科技有限公司；二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒(貨號：P0010S)購自上海碧云天公司；蛋白電泳及電轉移裝置(型號：AU5800)購自北京市六一儀器廠；酶聯(lián)免疫分析儀(型號：EVO75)購自澳大利亞Techan公司；超低溫冰箱(型號：MDF-U32V)購自美國Thermo公司。

1.3實驗方法

1.3.1腦癱大鼠模型構建及分組 將75只SD大鼠隨機分為5組：假手術組、模型組、丁苯酞低、中、高劑量組各15只。丁苯酞低、中、高劑量組：腹腔分別注射丁苯酞20、40、80 mg/(kg·d)；假手術組、模型組：腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)注射3 d。末次給藥2 h后，參考文獻〔9〕制備腦癱大鼠模型：除假手術組外，其余大鼠用10%水合氯醛(4 ml/kg)進行麻醉，在頸部鈍性分離左側頸總動脈，用0號線進行結扎，迅速縫合傷口，大鼠自然蘇醒后，將其置于封閉的缺氧箱中，箱中通入92%氮氣+8%氧氣的混合氣體，維持2 L/min的流速，箱內溫度37℃，2 h后取出大鼠進行后續(xù)實驗，假手術組大鼠僅鈍性分離左側頸總動脈，不結扎，其他干預與模型大鼠相同。本研究模型構建成功率為100%。

1.3.2各組神經(jīng)功能缺損評分 術后24 h后，參考文獻〔10〕對各組神經(jīng)功能缺損進行評分：0分，大鼠行為正常；1分，大鼠右前肢伸展不完全；2分，大鼠行走過程中轉圈；3分，大鼠行走中出現(xiàn)傾倒；4分，大鼠意識喪失，無行走能力。重復評定3次，取平均值作為最終評分，評分在1～3分說明模型制備成功。

1.3.3蘇木素-伊紅(HE)染色觀察各組海馬區(qū)組織病理變化 各組神經(jīng)功能損傷評分后，每組取5只大鼠，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉后，處死大鼠，分離腦組織，用4%多聚甲醛固定，做常規(guī)石蠟切片，海馬吻合位置連續(xù)冠狀切片(4 μm)。用HE染色，每張切片選取5個視野，光學顯微鏡下觀察腦組織海馬區(qū)病理學改變。

1.3.4TUNEL染色觀察海馬區(qū)神經(jīng)元細胞凋亡情況 每組選取5只大鼠，同1.3.3方法分離腦組織，將海馬組織切片，于二甲苯、不同濃度乙醇中浸泡5 min后，用蛋白酶K室溫消化1 h后，按TUNEL試劑盒說明書將切片進行染色、終止反應、封片等，于熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡數(shù)目。經(jīng)TUNEL染色的陽性細胞呈棕黃色或棕褐色，細胞凋亡率=凋亡細胞數(shù)目/總細胞數(shù)目×100%。

1.3.5Western印跡檢測各組海馬區(qū)Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達 提取海馬組織總蛋白，BCA法測其濃度，按蛋白30 μg /孔上樣進行電泳分離、轉膜、封閉后分別加入一抗(抗Bax、Bcl-2、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、GAPDH抗體，1∶1 000)，4℃下過夜培養(yǎng)，次日加二抗(1∶5 000)，溫室中培養(yǎng)1 h，洗膜，電化學發(fā)光(ECL)法進行顯色，用GAPDH作內參，掃描膠片，Tanon600圖像分析系統(tǒng)分析條帶灰度值。

1.4統(tǒng)計學分析 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組神經(jīng)功能缺損評分 與假手術組〔(0.00±0.00)分〕相比，模型組神經(jīng)功能缺損評分〔(2.78±0.29)分〕顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，丁苯酞低、中、高劑量組神經(jīng)功能缺損評分〔(2.42±0.26)分、(2.40±0.25)分、(1.73±0.19)分〕顯著降低(P<0.05)；與丁苯酞低、中劑量組相比，丁苯酞高劑量組神經(jīng)功能缺損評分顯著降低(P<0.05)。

2.2各組海馬區(qū)組織病理變化 假手術組海馬區(qū)細胞飽滿、排列緊密、結構清晰；與假手術組相比，模型組海馬區(qū)細胞排列稀疏紊亂、胞體減小、出現(xiàn)細胞核破裂現(xiàn)象；與模型組相比，丁苯酞低、中、高劑量組海馬區(qū)細胞上述病理癥狀明顯減輕。見圖1。

2.3各組海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡的影響 與假手術組〔(3.24±0.25)%〕相比，模型組海馬區(qū)細胞凋亡率〔(30.18±2.43)%〕顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，丁苯酞低、中、高劑量組海馬區(qū)細胞凋亡率〔(22.36±2.65)%、(21.45±2.12)%、(16.13±1.73)%〕顯著降低(P<0.05)；與丁苯酞低、中劑量組相比，丁苯酞高劑量組海馬區(qū)細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。見圖2。

圖1 各組海馬組織HE染色(×200)

圖2 各組海馬神經(jīng)元凋亡TUNEL染色(×200)

2.4各組海馬區(qū)Bax、Bcl-2蛋白表達 與假手術組相比，模型組海馬區(qū)Bax蛋白表達顯著升高，Bcl-2蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，丁苯酞低、中、高劑量組海馬區(qū)Bax蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與丁苯酞低、中劑量組相比，丁苯酞高劑量組海馬區(qū)Bax蛋白表達顯著降低，Bcl-2蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見圖3、表1。

2.5各組海馬區(qū)PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達 與假手術組相比，模型組海馬區(qū)p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與模型組相比，丁苯酞低、中、高劑量組海馬區(qū)p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達顯著升高(P<0.05)；與丁苯酞低、中劑量組相比，丁苯酞高劑量組海馬區(qū)p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達顯著升高(P<0.05)。見表1、圖4。

1～5：假手術組，模型組，丁苯酞低劑量組，丁苯酞中劑量組，丁苯酞高劑量組；圖4同圖3 各組海馬區(qū)Bax、BcL-2蛋白表達

表1 各組海馬區(qū)Bax、Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達比較

圖4 各組海馬區(qū)PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt蛋白表達

3 討 論

近年來，腦癱的患病率逐年上升〔11〕。腦癱是由于缺氧缺血而導致大腦損害引起的，造成肢體殘疾，嚴重影響其生活質量〔12,13〕。因此，研究腦癱的病因及病理特征，有利于其臨床診治。本研究結果與趙鵬舉等〔14〕研究結果一致，提示腦癱大鼠模型構建成功，腦癱引起大鼠神經(jīng)功能缺損。丁苯酞是芹菜揮發(fā)油的主要成分，對缺血性腦損傷疾病有較好的治療作用，江玲軍等〔15〕研究顯示，丁苯酞對脊髓損傷大鼠神經(jīng)運動功能具有保護作用。袁齊宏等〔16〕研究顯示，丁苯酞預處理可改善腦缺血再灌注大鼠神經(jīng)功能，達到較好的腦保護作用。本研究結果提示丁苯酞可以改善腦癱大鼠病理癥狀，減輕其神經(jīng)功能損傷。

神經(jīng)細胞凋亡與腦癱的發(fā)生、發(fā)展密切相關。Bax是一種促凋亡因子，Bcl-2是抑凋亡因子，共同調控細胞凋亡過程〔17〕。本研究結果與王新琳等〔18〕研究結果一致，提示腦癱引起神經(jīng)細胞凋亡增加與Bax、Bcl-2蛋白表達有關。魯玉霞等〔19〕研究顯示，通過下調Caspase-3、Bax mRNA及蛋白、上調Bcl-2 mRNA及蛋白，可以減少大腦皮質神經(jīng)細胞凋亡。陳曉莉等〔20〕研究顯示，丁苯酞通過抑制凋亡因子蛋白表達從而抑制細胞壞死性凋亡，減輕小鼠腦缺血再灌注損傷。本研究結果提示丁苯酞可以促進Bcl-2蛋白表達，抑制Bax蛋白表達，從而抑制神經(jīng)細胞凋亡，減輕腦癱大鼠神經(jīng)功能損傷。

PI3K/Akt信號通路是抗凋亡通路。Zhang等〔21〕研究顯示，調節(jié)PI3K/Akt信號通路可以抑制海馬神經(jīng)元凋亡，改善腦癱大鼠相關的缺陷。劉紅欣等〔22〕研究顯示，PI3K/Akt信號通路參與電針刺激頭部運動區(qū)對腦癱鼠腦損傷區(qū)神經(jīng)生長相關蛋白的調控，在促進神經(jīng)功能康復的作用機制中發(fā)揮重要作用。本研究結果提示，PI3K、p-Akt/Akt蛋白表達與腦癱發(fā)生有關。Cho等〔23〕研究顯示，激活PI3K/Akt信號通路，可以抑制海馬細胞凋亡，改善腦癱大鼠短期記憶。本研究結果提示，丁苯酞可以促進PI3K、Akt磷酸化蛋白表達，推測丁苯酞可能通過促進PI3K/Akt信號通路激活，促進Bcl-2蛋白表達，抑制Bax蛋白表達，從而抑制神經(jīng)細胞凋亡。

綜上，丁苯酞可能通過激活PI3K/Akt信號通路，調控凋亡相關因子表達，抑制腦癱大鼠海馬神經(jīng)元細胞凋亡，改善腦癱大鼠病理癥狀，減輕其神經(jīng)功能損傷，但由于本研究未對特異性干預通路進行驗證，其具體作用機制有待后續(xù)研究。