陳瑞廷 趙俊峰 董建設(shè) 孫繼建 張林超 王國(guó)橋 楊錦建 賈占奎

(1河南省中醫(yī)院(河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院) 泌尿外科，河南 鄭州 450002；2鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院泌尿外科)

膀胱癌是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，具有高復(fù)發(fā)率和高死亡率的特點(diǎn)〔1〕；中藥因其取材廣，毒副作用小等優(yōu)點(diǎn)可用于膀胱癌的治療〔2〕。蘆薈苷是從蘆薈的主要活性成分之一，研究顯示蘆薈苷具有抗癌作用，蘆薈苷可抑制食管癌細(xì)胞系KESY70的增殖和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔3〕。蘆薈苷可以抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力，同時(shí)可以抑制體外成瘤能力〔4〕。蘆薈苷可抑制胃癌細(xì)胞的增殖和遷移〔5〕。蘆薈苷可通過(guò)磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)/雷帕霉素靶蛋白(mTOR)途徑抑制肝細(xì)胞癌的生長(zhǎng)和侵襲并誘導(dǎo)其凋亡和自噬，從而增強(qiáng)抗腫瘤作用〔6〕。但蘆薈苷對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制尚不清楚。研究報(bào)道黃芩素通過(guò)抑制PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯及凋亡〔7〕。蟲草素通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路誘導(dǎo)人膀胱癌T24細(xì)胞凋亡〔8〕。本實(shí)驗(yàn)旨在研究蘆薈苷對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制是否與PI3K/AKT信號(hào)通路有關(guān)。

1 材料與方法

1.1材料 膀胱癌細(xì)胞T24購(gòu)自美國(guó)ATCC；RPMI1640培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；蘆薈苷(純度≥98%)、順鉑(純度≥98.5%)購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司；PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑LY294002購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；AKT激活劑胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF)-Ⅰ購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(CCK)-8、凋亡檢測(cè)試劑盒、放射免疫沉淀法(RIPA)蛋白裂解液購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；一抗及山羊抗兔IgG-HRP購(gòu)自上海恒斐生物科技有限公司。

1.2細(xì)胞處理與分組 膀胱癌細(xì)胞T24用RPMI1640培養(yǎng)液常規(guī)培養(yǎng)，分別用12.5、25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L蘆薈苷處理T24細(xì)胞，作為不同濃度蘆薈苷組，其中用200 μmol/L蘆薈苷處理的T24細(xì)胞，記為蘆薈苷組，10 μmol/L順鉑處理的T24細(xì)胞記為順鉑組，不做任何處理的T24細(xì)胞作為空白組。

用50 μmol/L LY294002和200 μmol/L蘆薈苷處理T24細(xì)胞，記為蘆薈苷+AKT抑制劑組；用100 ng/ml IGF-Ⅰ和200 μmol/L蘆薈苷處理T24細(xì)胞，記為蘆薈苷+AKT激活劑組；用等量的磷酸鹽緩沖液(PBS)和200 μmol/L蘆薈苷處理T24細(xì)胞為對(duì)照，記為蘆薈苷+PBS組。

1.3CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖存活率 各組細(xì)胞培養(yǎng)24、48、72 h時(shí)，按試劑盒說(shuō)明操作，每孔加入10 μl CCK-8試劑，最后用酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm波長(zhǎng)處吸光度值(A)。計(jì)算細(xì)胞增殖存活率(%)。

1.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期 收集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的70%乙醇固定，加入核糖核酸酶(RNase)A，37℃水浴30 min，加入400 μl碘化丙啶(PI)后4℃避光30 min，上機(jī)流式細(xì)胞儀檢測(cè)，同時(shí)用DNA細(xì)胞周期分析軟件進(jìn)行檢測(cè)分析。

1.5流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集各組細(xì)胞，漂洗，分別加入膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素(Annexin V-FITC)和PI，混勻后避光孵育10 min；上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.6Western印跡檢測(cè)細(xì)胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21、B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-xL、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved caspase)-3、Cleaved caspase-9、PI3K、p-PI3K、AKT、p-AKT蛋白表達(dá) 提取各組細(xì)胞的總蛋白，進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜上，封閉1 h，加入一抗(1∶1 000)4℃孵育過(guò)夜；加入二抗(1∶2 000)室溫孵育2 h，顯影、成像，分析蛋白條帶灰度值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1不同濃度的蘆薈苷對(duì)膀胱癌細(xì)胞存活的影響 與空白組相比，不同濃度蘆薈苷處理膀胱癌細(xì)胞48 h及72 h后細(xì)胞增殖存活率顯著降低(P<0.05)，濃度25.0、50.0、100.0、200.0 μmol/L的蘆薈苷在處理膀胱癌細(xì)胞24 h時(shí)細(xì)胞增殖存活率也顯著降低(P<0.05)；順鉑組24 h、48 h及72 h細(xì)胞增殖存活率顯著降低(P<0.05)，見表1。后續(xù)試驗(yàn)選用200 μmol/L蘆薈苷。

表1 不同濃度蘆薈苷對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖存活率的影響

2.2蘆薈苷及AKT抑制劑、AKT激活劑對(duì)膀胱癌細(xì)胞存活的影響 與空白組相比，蘆薈苷組和順鉑組24、48、72 h細(xì)胞增殖存活率顯著降低(P<0.05)；與蘆薈苷+PBS組相比，蘆薈苷+AKT抑制劑組24、48、72 h細(xì)胞增殖存活率顯著降低(P<0.05)，蘆薈苷+AKT激活劑組24、48、72 h細(xì)胞增殖存活率顯著升高(P<0.05)，見表2。

表2 各組對(duì)膀胱癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、蛋白表達(dá)的影響

2.3蘆薈苷及AKT抑制劑、AKT激活劑對(duì)膀胱癌細(xì)胞周期的影響 與空白組相比，蘆薈苷組和順鉑組G0-G1期細(xì)胞所占比例顯著升高，S期細(xì)胞所占比例顯著降低(均P<0.05)；與蘆薈苷+PBS組相比，蘆薈苷+AKT抑制劑組G0-G1期細(xì)胞所占比例顯著升高，S期細(xì)胞所占比例顯著降低，蘆薈苷+AKT激活劑組G0-G1期細(xì)胞所占比例顯著降低，S期細(xì)胞所占比例顯著升高(均P<0.05)，見表2。

2.4蘆薈苷及AKT抑制劑、AKT激活劑對(duì)膀胱癌細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的影響 與空白組相比，蘆薈苷組和順鉑組CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低，P21蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與蘆薈苷+PBS組相比，蘆薈苷+AKT抑制劑組CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低，P21蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，蘆薈苷+AKT激活劑組CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著升高，P21蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見表2、圖1。

2.5蘆薈苷及AKT抑制劑、AKT激活劑對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡的影響 與空白組相比，蘆薈苷組和順鉑組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)；與蘆薈苷+PBS組相比，蘆薈苷+AKT抑制劑組細(xì)胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，蘆薈苷+AKT激活劑組細(xì)胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，見圖2，表3。

1～6:空白組，蘆薈苷組，蘆薈苷+PBS組，蘆薈苷+AKT抑制劑組，蘆薈苷+AKT激活劑組，順鉑組，圖3同圖1 Western印跡檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞周期蛋白CyclinD1和 p21蛋白表達(dá)

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞凋亡

2.6蘆薈苷及AKT抑制劑、AKT激活劑對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)的影響 與空白組相比，蘆薈苷組和順鉑組Bcl-xL蛋白表達(dá)水平顯著降低，Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；與蘆薈苷+PBS組相比，蘆薈苷+AKT抑制劑組Bcl-xL蛋白表達(dá)水平顯著降低，Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)，蘆薈苷+AKT激活劑組Bcl-xL蛋白表達(dá)水平顯著升高，Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，見表3，圖3。

2.7蘆薈苷及AKT抑制劑、AKT激活劑對(duì)膀胱癌細(xì)胞PI3K/AKT信號(hào)通路蛋白表達(dá)的影響 與空白組相比，蘆薈苷組和順鉑組p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與蘆薈苷+PBS組相比，蘆薈苷+AKT抑制劑組p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，蘆薈苷+AKT激活劑組p-PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05)；而各組PI3K、AKT蛋白水平無(wú)顯著差異(P>0.05)，見表3。

表3 各組對(duì)膀胱癌細(xì)胞凋亡蛋白表達(dá)、PI3K/AKT信號(hào)通路、細(xì)胞凋亡的影響

圖3 Western印跡檢測(cè)膀胱癌細(xì)胞凋亡蛋白Bcl-xL、 Cleaved caspase-3和Cleaved caspase-9蛋白表達(dá)

3 討 論

細(xì)胞增殖和凋亡失衡可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生，近年來(lái)研究表明中藥及其天然藥物活性成分具有抗腫瘤作用〔9,10〕。尋找高效低毒的抗腫瘤藥物一直是腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。研究報(bào)道蘆薈苷通過(guò)靶向高遷移率族框(HMGB)1抑制AKT-mTOR-P70S6K和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)-cAMP調(diào)節(jié)元件結(jié)合(CREB)信號(hào)通路激活可誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡〔11〕。蘆薈苷通過(guò)激活p38和c-Jun NH2-末端激酶(JNK)信號(hào)通路并抑制ERK信號(hào)通路在體外誘導(dǎo)人胃癌細(xì)胞凋亡〔12〕。蘆薈苷可能通過(guò)ROS-促分裂原激活的蛋白激酶(MEK)信號(hào)傳導(dǎo)途徑和p53磷酸化誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞凋亡〔13〕。Bcl-xL是抗凋亡蛋白，下調(diào)其表達(dá)可促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔14〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明蘆薈苷可抑制膀胱癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡。

惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展是多種信號(hào)傳導(dǎo)通路共同作用的結(jié)果，PI3K/AKT信號(hào)通路的異?；罨瘏⑴c多種腫瘤細(xì)胞存活、增殖、侵襲的等發(fā)生發(fā)展過(guò)程〔15〕。隱丹參酮通過(guò)抑制PTEN/PI3K/AKT途徑抑制膀胱癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔16〕。冬凌草甲素可通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)G2/M細(xì)胞周期停滯和凋亡〔17〕。蝙蝠葛堿通過(guò)抑制腎癌細(xì)胞中的PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)途徑抑制細(xì)胞活力并誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和凋亡〔18〕。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明蘆薈苷可能抑制PI3K/AKT信號(hào)通路。PI3K/AKT信號(hào)通路抑制劑LY294002可增強(qiáng)蘆薈苷對(duì)膀胱癌細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。而PI3K/AKT信號(hào)通路IGF-Ⅰ逆轉(zhuǎn)了蘆薈苷對(duì)膀胱癌細(xì)胞的增殖抑制和凋亡促進(jìn)作用。

綜上，蘆薈苷可能通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路抑制膀胱癌細(xì)胞T24增殖、促進(jìn)細(xì)胞凋亡。