魯榮華 楊群 趙玲

(滕州市中心人民醫(yī)院 1感染病科，山東 滕州 277599；2功能檢查科)

核轉(zhuǎn)錄因子E2相關(guān)因子(Nrf)2通路是體內(nèi)重要抗氧化應(yīng)激通路，其在肝損傷、肺損傷等機(jī)體多種臟器損傷中發(fā)揮重要作用，目前已成為肝臟疾病重要潛在治療靶點(diǎn)〔1～4〕。金銀花具有清熱解毒、解暑化濕等作用，其有效成分中黃銅、綠原酸等是天然抗氧化劑，可清除體內(nèi)超氧離子自由基，保護(hù)機(jī)體免受氧化損傷〔5，6〕。金銀花提取物(HFE)可改善肝臟病理損傷，降低血糖，改善小鼠胰島素抵抗〔7〕，但是否通過Nrf2抗氧化損傷通路發(fā)揮作用尚未可知。本研究采用四氯化碳(CCl4)誘導(dǎo)并建立急性肝損傷大鼠模型，以探究HFE對急性肝損傷大鼠的保護(hù)作用，并探討其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)大鼠 50只6周齡清潔級SD大鼠，雄性，體重200～220 g，由常州卡文斯實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2016-0010，使用許可證號：SYXK(蘇)2017-0015。于20～25℃溫度，50%～70%濕度、12 h/12 h光照、黑暗條件下，自由采食，自由飲水。本研究經(jīng)過醫(yī)院動物倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)通過。

1.2主要試劑及儀器 HFE(綠原酸含量6%)購自新鄉(xiāng)博凱生物技術(shù)有限公司；CCl4(貨號：48604)購自Sigma-Aldrich公司；大鼠丙二醛(MDA)酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒(貨號：ER1878)購自武漢菲恩生物科技有限公司；大鼠超氧化物歧化酶(SOD)ELISA試劑盒(貨號：YM-2972B)購自上海遠(yuǎn)慕生物科技有限公司；大鼠谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)ELISA試劑盒(貨號：ZK-R4121)購自深圳子科生物科技有限公司；大鼠谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)ELISA試劑盒(貨號：ab234579)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)ELISA試劑盒(貨號：ab263883)、堿性磷酸酶(ALP)ELISA試劑盒(ab83259)、兔源一抗anti-Nrf2(貨號：ab137550)、anti-血紅素氧化酶(HO)-1(貨號：ab13243)、anti-β-actin(貨號：ab179467)，二抗羊抗兔IgG(貨號：ab205718)均購自英國Abcam公司；引物均購自生工生物工程(上海)股份有限公司；ix73顯微鏡購自日本Olympus公司；MODEL550型酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司等。

1.3方法

1.3.1模型制備及分組 50只SD大鼠隨機(jī)分為5組：對照組(NC組)、模型組(M組)、M+HFE組、M+Nrf2通路抑制劑ML385組(M+ML385組)、M+ ML385+HFE組，每組10只。M+HFE組給予HFE 62.5 mg/kg，約為人的臨床等效用量；M+ML385組給予ML385 30 mg/kg；M+ML385+HFE組給予ML385 30 mg/kg及HFE 62.5 mg/kg；NC組、M組灌胃等量蒸餾水，灌胃量均為5 ml/kg，連續(xù)干預(yù)4 w，各組灌胃最后1 d禁食16 h，除NC組外其余4組一次性腹腔注射0.12% CCl4花生油(1 ml/kg)誘導(dǎo)急性肝損傷模型〔8〕，NC組腹腔注射等量花生油，4 h后每組大鼠進(jìn)行最后1次灌胃，之后禁食不禁水，24 h后腹主動脈采血，處死后取肝臟組織，部分置于液氮中保存?zhèn)溆茫糠诌M(jìn)行石蠟包埋保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2生化指標(biāo)檢測 血液常規(guī)離心后收集血清，采用ELISA檢測各組大鼠血清肝功能指標(biāo)ALT、AST、ALP水平；制備大鼠肝臟組織勻漿液，采用ELISA檢測各組大鼠肝臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)MDA、SOD、GSH-Px水平，具體步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.3.3肝臟組織病理學(xué)檢測 取各組大鼠部分肝臟組織石蠟包埋塊，以5 μm厚度進(jìn)行切片，蘇木素-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察肝臟組織病理學(xué)形態(tài)變化。

1.3.4實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR) 采用Trizol提取肝臟組織總RNA，濃度及純度檢驗(yàn)合格后制備cDNA，采用RT-qPCR法擴(kuò)增Nrf2、HO-1 mRNA部分片段。Nrf2上游引物序列：5′-GGGCAAGCGACTCATGGTCAT-3′，下游引物序列：5′-AAGCTGCAT ACAGTCTTCAAA-3′；HO-1上游引物序列：5′-GATAGAGCGCAACAAGCAGAA-3′，下游引物序列：5′-CAGTGAGGCCCATACCAGAAG-3′；內(nèi)參β-actin上游引物序列：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCA-3′，下游引物序列：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAGT-3′。反應(yīng)體系(20 μl)：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10.0 μl，ROX Dye Ⅱ(50×)0.4 μl，cDNA(50 ng/μl)2.0 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，雙蒸水(ddH2O) 6.0 μl。反應(yīng)條件：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔCt法定量分析肝臟組織Nrf2、HO-1 mRNA相對表達(dá)水平。

1.3.5Western印跡 提取各組大鼠肝臟組織總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，置于-80℃保存?zhèn)溆?。?0 mg蛋白樣品進(jìn)行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，聚偏氟乙烯(PVDF)膜轉(zhuǎn)膜，室溫封閉，添加anti-Nrf2(1∶1 000)、anti-HO-1抗體(1∶2 000)、anti-β-actin抗體(1∶5 000)，4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜，添加二抗羊抗兔IgG(1∶5 000)室溫孵育2 h，顯色，曝片，觀察結(jié)果并分析蛋白灰度值。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、SNK-q檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組血清肝功能指標(biāo)比較 與NC組比較，M組血清ALT、AST、ALP水平顯著增加(P<0.05)；與M組比較，M+HFE組血清ALT、AST、ALP水平顯著降低(P<0.05)，M+ML385組血清ALT、AST、ALP水平顯著增加(P<0.05)；M+HFE+ML385組血清ALT、AST、ALP水平顯著高于M+HFE組，顯著低于M+ML385組(P<0.05)，見表1。

表1 各組血清肝功能指標(biāo)及肝臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)比較

2.2各組肝臟組織病理學(xué)形態(tài)變化 NC組肝臟小葉結(jié)構(gòu)清晰，未見異常形態(tài)變化；M組肝臟組織多處融合壞死，肝細(xì)胞腫脹、變性，有大量炎性細(xì)胞浸潤；M+HFE組、M+HFE+ML385小葉結(jié)構(gòu)尚存在，壞死灶減少；M+ML385組肝臟組織存在大量壞死灶，肝細(xì)胞變性、腫脹程度增加，見圖1。

圖1 各組肝臟組織病理學(xué)形態(tài)變化(HE染色，×200)

2.3各組肝臟組織氧化應(yīng)激指標(biāo)水平比較 與NC組比較，M組肝臟組織MDA含量顯著增加，SOD、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；與M組比較，M+HFE組肝臟組織MDA含量顯著降低，SOD、GSH-Px活性顯著增加(P<0.05)，M+ML385組肝臟組織MDA含量顯著增加，SOD、GSH-Px活性顯著降低(P<0.05)；M+HFE+ML385組肝臟組織MDA含量顯著高于M+HFE組，顯著低于M+ML385組(P<0.05)，SOD、GSH-Px活性顯著低于M+HFE組，顯著高于M+ML385組(P<0.05)，見表1。

2.4各組肝臟組織Nrf2、HO-1 mRNA相對表達(dá)水平比較 與NC組比較，M組肝臟組織Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；與M組比較，M+HFE組肝臟組織Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)，M+ML385組肝臟組織Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；M+HFE+ML385組肝臟組織Nrf2、HO-1 mRNA表達(dá)水平顯著低于M+HFE組，顯著高于M+ML385組(P<0.05)，見表2。

表2 各組肝臟組織Nrf2、HO-1 mRNA相對表達(dá) 水平比較

2.5各組肝臟組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)水平比較 與NC組比較，M組肝臟組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)；與M組比較，M+HFE組肝臟組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量顯著增加(P<0.05)，M+ML385組肝臟組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量顯著降低(P<0.05)；M+HFE+ML385組肝臟組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)量顯著低于M+HFE組，顯著高于M+ML385組(P<0.05)，見圖2、表3。

1～5：NC組、M組、M+HFE組、M+ML385組、M+HFE+ML38組圖2 Western印跡檢測各組肝臟組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)

表3 各組肝臟組織Nrf2、HO-1蛋白 表達(dá)量比較

3 討 論

CCl4是一種無色有毒液體，主要通過刺激機(jī)體自由基過量形成，引起細(xì)胞壞死引發(fā)鏈?zhǔn)竭^氧化反應(yīng)，可造成化學(xué)性器官損傷，其中以肝損傷最快速且最顯著，廣泛用于動物實(shí)驗(yàn)中急慢性肝損傷動物模型的建立，簡單、易行、可靠且可重復(fù)性好〔9，10〕。本研究結(jié)果顯示，CCl4作用后產(chǎn)生大量氧自由基，抑制抗氧化酶產(chǎn)生，誘導(dǎo)脂質(zhì)過氧化，提示CCl4誘導(dǎo)急性肝損傷模型大鼠制備成功。肝臟是機(jī)體最大的消化腺，是體內(nèi)物質(zhì)能量代謝中心，目前，臨床研究顯示，藥物引起的肝損傷危害性極大，因此對保肝藥物的篩選及作用機(jī)制探究具有重要意義。

金銀花又名忍冬、二花、銀花等，首次記載于《本草綱目》中，是一味傳統(tǒng)中藥，富含多種化學(xué)成分，其中綠原酸、異綠原酸等有機(jī)酸類化合物，金絲桃苷、木犀草素等黃酮類化合物均具有廣泛抗菌、消炎、抗病毒、抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、護(hù)肝降糖等多種藥理作用〔11，12〕。有研究報(bào)道，HFE對乙醇導(dǎo)致小鼠化學(xué)性肝損傷有一定保護(hù)作用〔13〕，可能與通過增加血清抗氧化酶GSH-Px、SOD活性，降低MDA含量，提高機(jī)體抗氧化能力，保護(hù)機(jī)體細(xì)胞免受氧化應(yīng)激損傷有關(guān)〔14〕。許萬紫等〔15〕報(bào)道，HFE可通過清除氧自由基，減輕氧化應(yīng)激，保護(hù)小鼠心肌缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果提示HFE可減輕CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷，可能與提高其抗氧化能力有關(guān)。

Nrf2通路激活與內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)增強(qiáng)密切相關(guān)，正常生理?xiàng)l件下，Nrf2與Kelch樣ECH相關(guān)蛋白(Keap)1相耦聯(lián)位于細(xì)胞質(zhì)中，無生物活性；而氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，Nrf2可發(fā)生磷酸化與Keap1解耦聯(lián)并轉(zhuǎn)移入核，進(jìn)而與DNA上氧化反應(yīng)元件(ARE)啟動HO-1、SOD、GSH-PX等下游抗氧化酶表達(dá)，引發(fā)抗氧化反應(yīng)〔16，17〕。研究表明，Nrf2抗氧化通路在大鼠急性肝損傷中發(fā)揮重要保護(hù)作用，激活Nrf2信號通路可減輕化學(xué)性肝損傷，該通路可作為肝損傷治療靶點(diǎn)〔18～20〕。本研究結(jié)果提示HFE保護(hù)CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝損傷作用可能與Nrf2通路激活有關(guān)。HFE可通過促進(jìn)Nrf2通路激活減輕CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷，但HFE作為一種中藥提取物，可能具有多靶點(diǎn)活性，可能還通過調(diào)節(jié)其他相關(guān)通路共同發(fā)揮抗氧化作用，減輕肝損傷，但有待進(jìn)一步探究。

綜上所述，HFE可通過促進(jìn)Nrf2通路激活，發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用，減輕CCl4誘導(dǎo)的大鼠急性肝損傷。但HFE作為一種中藥提取物，可能具有多靶點(diǎn)活性，在減輕肝損傷作用過程中還可能通過調(diào)節(jié)其他相關(guān)通路共同發(fā)揮抗氧化作用，有待進(jìn)一步深入探究。