司晶殊 奚悅

(錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院 1營(yíng)養(yǎng)科，遼寧 錦州 121000；2內(nèi)分泌科)

糖尿病是全世界范圍內(nèi)的常見病，目前估計(jì)成年人中1型和2型糖尿病的全球患病人數(shù)接近4.25億，預(yù)計(jì)到2045年將增加到6.29億，這意味著每11名成年人中就有1人患有糖尿病〔1〕。目前糖尿病骨質(zhì)疏松的發(fā)病機(jī)制尚未闡明，雖然半個(gè)世紀(jì)以前就已發(fā)現(xiàn)糖尿病可引起骨量改變，但近10年糖尿病才被視為骨質(zhì)疏松發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，據(jù)統(tǒng)計(jì)全球約4%的骨質(zhì)疏松性骨折歸因于糖尿病，然而，考慮到糖尿病患病率的增加及它可能與傷害性跌倒的更大風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)的事實(shí)，其實(shí)際比率可能更高〔2〕。

成骨細(xì)胞在骨重塑過程中扮演著重要角色，包括合成分泌骨基質(zhì)，促進(jìn)骨形成及基質(zhì)礦化，調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞分化及骨吸收及完成骨骼內(nèi)分泌功能，成骨細(xì)胞功能的研究對(duì)探討糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)生機(jī)制有著非常重要的意義，成骨細(xì)胞分泌兩種重要的功能蛋白，Ⅰ型膠原蛋白(CoiⅠ)和骨鈣素(BGP)，CoiⅠ是骨基質(zhì)中最豐富的有機(jī)膠原蛋白質(zhì)，賦予骨骼機(jī)械彈性，BGP是成骨細(xì)胞活性標(biāo)志物，在基質(zhì)中增加游離鈣離子及羥基磷灰石的親附性，維持骨的正常礦化，未羧化的BGP進(jìn)入血液循環(huán)，行使內(nèi)分泌激素的作用。葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體(Glut)是介導(dǎo)葡萄糖進(jìn)入細(xì)胞的轉(zhuǎn)運(yùn)載體，在成骨細(xì)胞中表達(dá)3種高親和力的Glut：Glut1，Glut3和Glut4，在成骨細(xì)胞分化過程中Glut1和Glut3的水平保持恒定，Glut4是成骨細(xì)胞后期分化所必需的，隨著成骨細(xì)胞分化和胰島素刺激的葡萄糖氧化而增加，是胰島素依賴的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白〔3〕。

細(xì)胞作為能量代謝的基本單位，調(diào)節(jié)燃料的選擇、分配、利用以適應(yīng)細(xì)胞增殖，分化和代謝等能量需求，保證各組織器官發(fā)揮正常生理功能和機(jī)體的能量平衡，本研究旨在觀察高糖、高胰島素環(huán)境成骨細(xì)胞Glut4、BGP、CoiⅠ等蛋白的表達(dá)情況并探討成骨細(xì)胞葡萄糖代謝對(duì)成骨功能的影響。

1 材料和方法

1.1主要試劑和儀器 胎牛血清(FBS)(浙江天航生物科技股份有限公司)、最低必需培養(yǎng)基(MEM)-α培養(yǎng)基(HyClone公司)、Glut4小鼠單克隆抗體(Proteintech公司)、GAPDH單克隆抗體、羊抗鼠LgG抗體(中國(guó)武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司)、BGP酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒、CoiⅠ ELISA試劑盒(江蘇酶標(biāo)生物科技股份有限公司)、膠原酶Ⅱ、維生素C、β-甘油磷酸鈉、堿性磷酸酶染色試劑盒、茜素紅S染色液、蘇木素染液、細(xì)胞裂解液(北京索萊寶科技有限公司)、胰酶細(xì)胞消化液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(碧云天生物技術(shù)公司)、高敏型電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒(諾唯贊生物)、門冬胰島素注射液(諾和諾德中國(guó)制藥有限公司)、CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國(guó)Thermo公司)、 超凈工作臺(tái)(美國(guó)NUAIRE公司)、倒置相差熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)。

1.2原代成骨細(xì)胞提取 昆明小鼠乳鼠(出生≤5 d)購(gòu)自錦州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，并經(jīng)錦州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)批準(zhǔn)，每次提取10只。參考文獻(xiàn)〔4〕采用膠原酶消化法提取昆明小鼠乳鼠顱骨成骨細(xì)胞，提取后接種于含10%FBS的MEM-α培養(yǎng)基(青霉素100 μg/ml，鏈霉素0.1 mg/ml)10 cm培養(yǎng)皿中，于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.3原代成骨細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞已鋪滿培養(yǎng)皿底壁，密度達(dá)到90%以上，用胰酶-乙二胺四乙酸(EDTA)消化液消化細(xì)胞，顯微鏡下觀察細(xì)胞皺縮，變圓變亮，部分細(xì)胞已從皿底壁脫離，加入完全培養(yǎng)基終止消化；輕輕吹打細(xì)胞轉(zhuǎn)移至離心管中，離心后重懸細(xì)胞，按1∶3比例傳代，提取的原代小鼠成骨細(xì)胞首次傳代之后給予誘導(dǎo)培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，誘導(dǎo)培養(yǎng)基為含10%FBS、 50 μg/ml維生素(Vit)C、10 mmol/L β-甘油磷酸鈉、青霉素100 μg/ml，鏈霉素100 μg/ml的MEM-α培養(yǎng)基。

1.4原代成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色 原代成骨細(xì)胞體外誘導(dǎo)培養(yǎng)14 d左右行堿性磷酸酶染色，染色前把細(xì)胞接種于24孔板中，細(xì)胞貼壁密度達(dá)到60%左右按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行染色，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定，濕盒孵育，核固紅復(fù)染細(xì)胞核，奧林巴斯顯微鏡拍照并保存圖片。

1.5原代成骨細(xì)胞茜素紅S染色 原代成骨細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)21 d左右行茜素紅S染色，染色前把細(xì)胞接種至24孔板中，細(xì)胞貼壁密度達(dá)到90%以上時(shí)按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行染色，PBS清洗3次，4%多聚甲醛固定，茜素紅S染色液染色，奧林巴斯顯微鏡拍照并保存圖片。

1.6實(shí)驗(yàn)分組 分為4組：正常對(duì)照(N)組，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為5.5 mmol/L；高糖(T)組，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為25 mmol/L；高胰島素(Y)組，培養(yǎng)基中胰島素濃度為1 μmol/L；高糖高胰島素(D)組，培養(yǎng)基中葡萄糖濃度為25 mmol/L，胰島素濃度為1 μmol/L，分別誘導(dǎo)6 h和24 h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.7Western印跡檢測(cè)Glut4蛋白表達(dá) 各組細(xì)胞分別誘導(dǎo)6 h和24 h后收集細(xì)胞，冰上裂解細(xì)胞〔RIPA 裂解液：苯甲酸磺酸氟(PMSF)=100∶1〕提取蛋白，用BCA法測(cè)定蛋白濃度，根據(jù)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)配制試劑盒說明制膠，上樣電泳分離蛋白，然后將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDG)膜上，5%脫脂奶粉封閉后，GAPDH、Glut4一抗4℃孵育過夜，次日TBST洗膜，再用辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗鼠二抗室溫孵育后，TBST洗膜ECL液顯影，用Imageproplus6.0軟件掃描各組細(xì)胞條帶的灰度值，以GAPDH作為內(nèi)參，計(jì)算Glut4的蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量，每組重復(fù)3次。

1.8ELISA檢測(cè)BGP、CoiⅠ含量 每組蛋白樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔，按照試劑盒說明書操作步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)檢測(cè)各孔的吸光度OD值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出直線方程，根據(jù)方程計(jì)算各組蛋白樣品BGP、CoiⅠ含量。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié) 果

2.1原代成骨細(xì)胞形態(tài) 奧林巴斯顯微鏡下觀察原代成骨細(xì)胞生長(zhǎng)情況，可見體外生長(zhǎng)2 d細(xì)胞體積較小，呈梭形、三角形、立方形；體外生長(zhǎng)5 d后細(xì)胞體積逐漸增大，立方形、三角形細(xì)胞逐漸增多，細(xì)胞核明顯，細(xì)胞伸出突起與周圍細(xì)胞連接；體外培養(yǎng)12 d，細(xì)胞體積明顯變大，呈立方形、三角形，胞核明顯，胞質(zhì)豐富，細(xì)胞伸出較多突起，呈分層重疊生長(zhǎng)，見圖1。

圖1 原代成骨細(xì)胞第1、5、12天 細(xì)胞生長(zhǎng)變化(×40)

2.2原代成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色 原代成骨細(xì)胞體外傳代培養(yǎng)逐步誘導(dǎo)分化成熟，在細(xì)胞功能成熟早期胞質(zhì)合成分泌堿性磷酸酶，被染成藍(lán)色，并可見藍(lán)色堿性磷酸酶顆粒，核固紅復(fù)染胞核呈紅色，奧林巴斯顯微鏡下觀察，原代成骨細(xì)胞堿性磷酸酶染色陽性率>95%，堿性磷酸酶染色鑒定原代提取成骨細(xì)胞生長(zhǎng)分化良好，見圖2。

圖2 原代成骨細(xì)胞提取后第14天ALP染色

2.3原代成骨細(xì)胞茜素紅S染色 原代成骨細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化成熟，基質(zhì)被礦化，在骨基質(zhì)中形成鈣化結(jié)節(jié)，茜素紅S可與基質(zhì)磷酸鈣中的鈣鹽螯合形成橙紅色的復(fù)合物，經(jīng)茜素紅S染色后，在奧林巴斯顯微鏡下觀察可見橙紅色鈣化結(jié)節(jié)，結(jié)節(jié)周圍成骨細(xì)胞呈同心圓排列，經(jīng)茜素紅染色鑒定原代提取成骨細(xì)胞分化成熟，見圖3。

圖3 原代成骨細(xì)胞提取后第21天茜素紅染色(×40)

2.4Western印跡檢測(cè)原代成骨細(xì)胞Glut4蛋白表達(dá) 細(xì)胞誘導(dǎo)6 h，與N組相比，Y組、T組、D組細(xì)胞Glut4蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)。在誘導(dǎo)24 h后，與T組相比，N組細(xì)胞Glut4蛋白表達(dá)明顯減少，Y組細(xì)胞Glut4蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)，D組與N組比較無明顯差異(P>0.05)，見表1、圖4、圖5。

表1 各組細(xì)胞誘導(dǎo)不同時(shí)間Glut4相對(duì)表達(dá)量

圖4 各組細(xì)胞誘導(dǎo)6 h Glut4蛋白表達(dá)水平

2.5ELISA檢測(cè)原代成骨細(xì)胞BGP、CoiⅠ蛋白含量 在高胰島素、高糖誘導(dǎo)6 h，與N組相比，T組、D組 BGP分泌明顯增加(P<0.05)，24 h后與N組相比，Y組BGP分泌明顯增加，N組BGP分泌明顯減少(P<0.05)，D組與N組相比無明顯差異(P>0.05)；在高糖、高胰島素誘導(dǎo)不同時(shí)間，與N組相比，T組、Y組、D組CoiⅠ分泌無顯著差異(P>0.05)，見表2。

圖5 各組細(xì)胞誘導(dǎo)24 h Glut4蛋白表達(dá)水平

表2 不同誘導(dǎo)時(shí)間各組細(xì)胞BGP、CoiⅠ蛋白含量比較

3 討 論

最近的研究表明無論是1型還是2型糖尿病都引起骨質(zhì)量的惡化和機(jī)械性能的減弱，導(dǎo)致糖尿病骨質(zhì)疏松和脆性骨折風(fēng)險(xiǎn)性增加〔5〕,健康的骨骼由骨重塑的細(xì)胞機(jī)制來維持,成骨細(xì)胞作為骨重塑過程中的主要造骨細(xì)胞，揭示支持其特異性生理活性的生物能學(xué)對(duì)研究糖尿病骨質(zhì)疏松發(fā)生機(jī)制有著非常重要意義。

葡萄糖是大多數(shù)細(xì)胞主要的能源和碳源，葡萄糖也是成骨細(xì)胞的主要營(yíng)養(yǎng)素和能源底物〔6〕，不僅如此，成骨細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用是整個(gè)機(jī)體的能量穩(wěn)態(tài)的決定因素〔7〕。成骨細(xì)胞葡萄糖代謝與成骨細(xì)胞整個(gè)生命過程中能量需求、生理功能相適應(yīng)，研究證明，成骨細(xì)胞分化的不同階段利用氧化磷酸化和糖酵解產(chǎn)生三磷酸腺苷(ATP)〔8,9〕。成骨細(xì)胞選擇產(chǎn)生ATP的方式，可能更有利于成骨細(xì)胞生物蛋白的合成，已證明葡萄糖碳對(duì)膠原蛋白中的氨基酸生成有重要作用〔10〕，亦可能與檸檬酸鹽的大量合成和主動(dòng)分泌有關(guān)，而檸檬酸鹽對(duì)于骨骼中形成磷灰石納米晶體具有重要的意義〔11,12〕。

成骨細(xì)胞通過質(zhì)膜上Glut將葡萄糖順濃度梯度轉(zhuǎn)移到細(xì)胞中，研究表明Glut1介導(dǎo)成骨細(xì)胞以恒定的方式攝取葡萄糖，Glut4是在成熟成骨細(xì)胞上表達(dá)，是以胰島素依賴的方式吸收葡萄糖的主要載體，在基質(zhì)生成和礦化相關(guān)的能量需求中發(fā)揮重要作用〔13〕，在小鼠原代成骨細(xì)胞中Glut4是胰島素依賴的葡萄糖攝取所必需的〔3〕。BGP是成骨細(xì)胞合成并分泌到基質(zhì)的特異蛋白質(zhì)，在骨形成過程中基質(zhì)礦化所必需的。胰島素可能通過胰島素受體IR-FoxO1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)促進(jìn)BGP的分泌〔14〕，最新的研究發(fā)現(xiàn)一個(gè)新的成骨細(xì)胞特異性基因ESP，該基因編碼被稱為OST-PTP的酪氨酸磷酸酶，OST-PTP使胰島素受體去磷酸化，此段基因的敲除可導(dǎo)致成骨細(xì)胞增加胰島素信號(hào)傳導(dǎo)和BGP產(chǎn)生〔15〕，而Glut4是胰島素信號(hào)通路的主要效應(yīng)蛋白，由此可以得出特異的基質(zhì)蛋白BGP分泌與葡萄糖代謝關(guān)鍵蛋白Glut4表達(dá)相一致，Glut4的表達(dá)調(diào)節(jié)了BGP的分泌，在Glut4與BGP之間存在著分子信號(hào)通路的連接。

本研究中T組Glut4表達(dá)和BGP分泌先增加并隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，考慮成骨細(xì)胞最初由于細(xì)胞外環(huán)境中葡萄糖濃度的驟然增加，Glut4順濃度梯度增加葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)伴隨BGP分泌的增加，BGP作用于胰腺-骨骼內(nèi)分泌環(huán)，增加胰島素分泌，改善成骨細(xì)胞對(duì)葡萄糖的利用，降低細(xì)胞外葡萄糖濃度，有利于維持成骨細(xì)胞基質(zhì)合成和礦化，由于本研究為體外實(shí)驗(yàn)不能通過反饋?zhàn)饔谜{(diào)節(jié)胰島素的分泌，持續(xù)的高糖環(huán)境降低了成骨細(xì)胞的活性，抑制Glut4表達(dá)和BGP分泌，量化為骨形成的減少，這可能與高糖干擾成骨細(xì)胞磷脂酰肌醇-3肌酶-蛋白激酶B-內(nèi)皮型一氧化氮合酶(PI3K-AKT-eNOS)信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)，并與相關(guān)研究報(bào)道相一致〔16～18〕。

CoiⅠ是成骨細(xì)胞最早合成分泌的蛋白質(zhì)，是骨骼基質(zhì)主要成分，CoiⅠ的合成先于成骨祖細(xì)胞分化的最早轉(zhuǎn)錄決定因子Runx2的表達(dá)，且不受Runx2的調(diào)控，成骨細(xì)胞分化與CoiⅠ合成之間的脫節(jié)可以由成骨細(xì)胞生物能學(xué)來解釋，Glut1的表達(dá)更先于Runx2的表達(dá)，成骨細(xì)胞通過Glut1以胰島素非依賴性方式攝取葡萄糖，成骨細(xì)胞中的葡萄糖攝取促進(jìn)成骨細(xì)胞分化和骨形成，Runx2的啟動(dòng)又協(xié)同調(diào)節(jié)Glut1表達(dá)和CoiⅠ合成〔19〕。本研究結(jié)果與之前實(shí)驗(yàn)結(jié)果〔4〕相一致，同時(shí)進(jìn)一步印證了之前的研究結(jié)果，Glut1介導(dǎo)的葡萄糖攝取和CoiⅠ合成與Runx2之間的相互作用貫穿于整個(gè)成骨細(xì)胞分化和骨骼形成過程中〔19〕；并且可能解釋了糖尿病患者骨骼脆性和骨折風(fēng)險(xiǎn)性增加，而骨密度(BMD)可表現(xiàn)為正常、增高或減少的不同臨床表現(xiàn)，因?yàn)楣侵厮苓^程中改建更少的骨骼意味著有更多時(shí)間進(jìn)行膠原蛋白交聯(lián)和更完整的次生礦化，導(dǎo)致骨質(zhì)流失和結(jié)構(gòu)性惡化，最終損害骨骼的質(zhì)量，引發(fā)糖尿病骨質(zhì)疏松〔20〕。同樣研究顯示甲狀旁腺激素(PTH)通過增加成骨細(xì)胞葡萄糖代謝，改善成骨細(xì)胞葡萄糖利用，促進(jìn)了成骨細(xì)胞蛋白質(zhì)合成,已經(jīng)應(yīng)用于骨質(zhì)疏松的治療〔21〕。

綜上，成骨細(xì)胞的功能與自身葡萄糖代謝有著獨(dú)特的關(guān)系，成骨細(xì)胞通過響應(yīng)生物能機(jī)制以適應(yīng)其增殖、分化、基質(zhì)合成和礦化的生理要求，實(shí)現(xiàn)細(xì)胞能量代謝和細(xì)胞生物功能的耦合。CoiⅠ的合成與Glut1表達(dá)密切相關(guān)，而在成熟的成骨細(xì)胞Glut4發(fā)揮調(diào)節(jié)BGP分泌的作用，參與整個(gè)機(jī)體的能量代謝和能量循環(huán)中，阻止糖尿病骨質(zhì)疏松骨骼微結(jié)構(gòu)和骨質(zhì)量的惡化，葡萄糖代謝關(guān)鍵蛋白分子Glut4有望成為糖尿病骨質(zhì)疏松治療的新靶點(diǎn)。