柯莉 方登富 潘飛豹 蔣世杰

(遂寧市中心醫(yī)院，四川 遂寧 629000)

阿爾茨海默病(AD)世界范圍內(nèi)患者已逾1億，且隨著人口老齡化程度加深，AD發(fā)病率居高不下〔1，2〕。AD的β淀粉樣蛋白(Aβ)級(jí)聯(lián)是其研究領(lǐng)域最廣泛的假說(shuō)，相關(guān)研究顯示，AD患者細(xì)胞非正常凋亡與大腦神經(jīng)元丟失密切相關(guān)，而Aβ過(guò)量積累會(huì)促進(jìn)細(xì)胞凋亡〔3〕。單磷酸腺苷活化蛋白激酶(AMPK)作為機(jī)體新陳代謝重要的參與者，在生化反應(yīng)過(guò)程中能夠保持外界能量平衡。臨床學(xué)者認(rèn)為，激活A(yù)MPK有利于修復(fù)腦卒中患者受損細(xì)胞〔4〕。同時(shí)AMPK與內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)磷酸化水平呈正相關(guān)，這對(duì)神經(jīng)再生和修復(fù)具有積極意義〔5〕。益母草堿(LEO)是唇形科植物益母草的主要成分之一，具有抵抗血小板凝聚、舒張血管、促進(jìn)血液循環(huán)等生理功能，在保護(hù)急性心肌缺血、腦缺血等方面的優(yōu)勢(shì)已經(jīng)得到證實(shí)〔6〕。但目前尚無(wú)關(guān)于LEO對(duì)Aβ1～42誘導(dǎo)的老年性癡呆大腦保護(hù)機(jī)制的相關(guān)報(bào)道。本研究探究LEO對(duì)Aβ1～42致癡呆大鼠腦保護(hù)作用及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)雄性SD大鼠購(gòu)自成都百裕制藥股份有限公司〔許可證號(hào)：SYXK(川)2019-222〕，體重為180～220 g，遂寧市中心醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心飼養(yǎng)，常規(guī)飼養(yǎng)，溫度、濕度適宜，循環(huán)光照12 h，構(gòu)建模型前禁食12 h。常規(guī)飼養(yǎng)1 w以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)環(huán)境，第2周開(kāi)始實(shí)驗(yàn)流程。

1.2主要試劑 LEO( 批號(hào)為：TZ18938，純度>98%)購(gòu)自西安通澤生物科技有限公司；尼莫地平注射液(NMDP，上海信宜金朱藥業(yè)有限公司，批號(hào)為：國(guó)藥準(zhǔn)字H20057745)；TUNEL試劑盒采購(gòu)自Sigma公司；二氨基聯(lián)苯胺(DAB)化學(xué)發(fā)光試劑盒采購(gòu)自天津祥盛通達(dá)生物有限公司；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)試劑盒采購(gòu)自美國(guó)abcam公司；p-AMPK、p-eNOS和核轉(zhuǎn)錄因子(NF)-κB抗體采購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，戊巴比妥鈉購(gòu)自上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司，p-AMPK、p-eNOS和NF-κB抗體(美國(guó)abcam公司)購(gòu)自美國(guó)PALL公司，冰凍切片包埋劑采購(gòu)自美國(guó)櫻花公司，Western印跡試劑盒購(gòu)自北京博凌科為生物公司。

1.3模型構(gòu)建及分組構(gòu)建 模型前適應(yīng)性喂養(yǎng)SD大鼠1 w，使用1% 戊巴比妥鈉麻醉Model組、LEO組、NMDP組，麻醉起效后常規(guī)消毒鋪巾，剔除大鼠頭頂毛發(fā)并清潔皮膚，頭頂部做縱向2 cm傷口，使用鑷子分離骨膜充分暴露顱骨，海馬CA1區(qū)應(yīng)用腦立體定位儀定位〔7〕，將顱骨打開(kāi)：以前囟后 3.3 mm、中線1.5 mm、硬腦膜下3.0 mm，采用微量注射器向每側(cè)注射2 μl微量孵育好的Aβ1～42溶液，為了規(guī)避藥物外滲，注射完成后需留針5 min。切口縫合后消毒。切開(kāi)Sham組硬腦膜后注射生理鹽水2 μl，其他流程與上述操作一致。模型構(gòu)建完成3 h后，LEO組腹腔內(nèi)注射LEO 50 mg/kg，NMDP組腹腔注射NMDP 50 mg/kg，注射劑量為10 ml，1次/d，Sham組、Modle組腹腔給予等量生理鹽水，連續(xù)注射14 d。

1.4大鼠學(xué)習(xí)記憶能力檢測(cè)跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)〔8〕跳臺(tái)裝置為10 cm×10 cm×30 cm長(zhǎng)方形反射箱，用黑色塑料板分隔成為5間。底面是可通電的不銹鋼網(wǎng)柵，設(shè)立橡膠站臺(tái)，大鼠不離開(kāi)不銹鋼網(wǎng)柵則會(huì)遭受電擊。進(jìn)行3 d連續(xù)實(shí)驗(yàn)，第1天為適應(yīng)階段，將大鼠面向墻角置于站臺(tái)上，網(wǎng)珊不通電，適應(yīng)環(huán)境5 min。第2天為學(xué)習(xí)階段，大鼠面向墻角輕輕放置于站臺(tái)上，然后通以36 V交流電，持續(xù)5 min。若動(dòng)物跳下站臺(tái)則受電擊，其正常反應(yīng)應(yīng)該是跳回站臺(tái)，記錄每只大鼠跳臺(tái)失敗次數(shù)；第3天為實(shí)驗(yàn)階段，記錄4組第一次受到電刺激及首次跳下站臺(tái)的時(shí)間。

1.5大鼠大腦皮層血流變化監(jiān)測(cè) 跳臺(tái)試驗(yàn)完成后，使用激光散斑成像檢測(cè)4組大腦皮層血流變化，使用0.3%戊巴比妥鈉成功麻醉后，獲取5組額定皮層600 s實(shí)時(shí)圖像，將內(nèi)源成像孔與Baumer相機(jī)連接，觀察大腦皮質(zhì)血流灌注量變化情況，并使用散斑軟件計(jì)算皮層血流差異。

1.6大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài) 蘇木素-伊紅(HE)染色觀察檢測(cè)大鼠腦組織中細(xì)胞凋亡情況，取部分腦組織，采用多聚甲醛固定，制備4 μm的切片，進(jìn)行HE染色，采用光學(xué)顯微鏡觀察癡呆大鼠腦組織神經(jīng)元的形態(tài)變化。

1.7大鼠腦組織中的細(xì)胞凋亡 采用TUNEL染色評(píng)估大鼠腦組織細(xì)胞凋亡率，取部分腦組織，常規(guī)固定后，用60℃恒溫烤箱烘烤石蠟?zāi)X組織切片3 h，二甲苯脫蠟完成后、梯度濃度酒精脫水處理，分別使用不含DNase的蛋白酶K、磷酸鹽緩沖液(PBS)完成消化，沖洗后，放入3% H2O2溶液中黑暗常溫孵育，依次完成PBS沖洗，生物素標(biāo)記，分別用DAB、蘇木素顯色、染色，持續(xù)脫水至切片透明，封固完成后，使用顯微鏡觀察并留存照片。以完整非重疊的5個(gè)高倍鏡(×400)視野計(jì)算同一切片的細(xì)胞凋亡指數(shù)。細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI)=凋亡細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)× 100%，取其均值。

1.8大鼠腦組織中IL-1β、IL-6 和 TNF-α的水平 將細(xì)胞裂解液加入部分腦組織中，離心取上層清液，根據(jù)ELISA 試劑盒操作說(shuō)明檢測(cè)IL-1β、IL-6 和 TNF-α的水平。檢測(cè)完成后，在450 nm處OD值應(yīng)用采用酶標(biāo)儀測(cè)量。

1.9大鼠腦組織中NF-κB的核移位 取部分腦組織石蠟切片，按照免疫熒光的試劑盒說(shuō)明書(shū)：60℃恒溫箱中烤2 h，待恢復(fù)室溫后脫水、脫蠟、抗原修復(fù)處理，1%牛血清白蛋白(BSA)、一抗體中、二抗中分別封閉20 min、孵育1.5 h、孵育30 min，操作中選擇PBS洗滌，熒光顯微鏡觀察NF-κB的核移位現(xiàn)象，平均光密度應(yīng)用圖片分析程序測(cè)定。

1.10大鼠腦組織中p-AMPK、p-eNOS和NF-κB的表達(dá)采用Western印跡檢測(cè) 在裂解液中加入部分腦組織，加入裂解液，冰上放置20～30 min，超聲裂解30 s，12 000 r/min，4℃離心10 min，收集上清，置于-20℃保存。收集組織液中總蛋白，采用二喹啉甲酸(BCA)試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定總蛋白表達(dá)水平，十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)完成后，展開(kāi)轉(zhuǎn)膜、封閉流程，稀釋后的p-AMPK、p-eNOS和NF-κB蛋白一抗添加完成后，在4℃恒溫條件下孵育過(guò)夜，加入標(biāo)記辣根過(guò)氧化物酶(HRP)的羊抗鼠二抗，常溫條件下2 h孵育完成后，磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜，增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光(ECL)顯影后黑暗下曝光拍照，內(nèi)參選擇GAPDH。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS16.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組學(xué)習(xí)成績(jī)和記憶成績(jī) 4組學(xué)習(xí)和記憶成績(jī)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；Model組學(xué)習(xí)成績(jī)高于sham組，記憶成績(jī)低于Sham組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LEO組學(xué)習(xí)成績(jī)低于Model組，記憶成績(jī)高于Model組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LEO組與NMDP組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1 各組學(xué)習(xí)記憶能力、腦皮層血流灌注量、腦組織細(xì)胞凋亡率、IL-1β、IL-6和TNF-α的水平的比較

2.2激光散斑成像檢測(cè)大腦皮層血流變化 4組大腦皮層血液灌注量差異明顯(P<0.05)，Model組大腦皮層血流灌注量顯著少于Sham組(P<0.05)，LEO組、NMDP組大腦皮層血流灌注量顯著多于Model組(P<0.05)，LEO組與NMDP組比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表1、圖1。

2.3各組腦海馬區(qū)形態(tài)學(xué)的比較 HE 染色結(jié)果顯示，Sham組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞核較大且細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整、規(guī)律排列，細(xì)胞形態(tài)正常；Model組海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞細(xì)胞核染色模糊且結(jié)構(gòu)大小不一，排列不規(guī)則，細(xì)胞核縮小且出現(xiàn)較多的凋亡的神經(jīng)元。LEO組可明顯減少神經(jīng)元丟失，改善神經(jīng)元異常形態(tài)；NMDP組與LEO組海馬區(qū)神經(jīng)元結(jié)構(gòu)相似，見(jiàn)圖2。

2.4TUNEL染色觀察腦組織中細(xì)胞凋亡 4組腦組織中細(xì)胞凋亡率均具有明顯差異(P<0.05)，Model組細(xì)胞凋亡率顯著高于Sham組(P<0.05)，LEO組、NMDP組細(xì)胞凋亡率顯著低于Sham組(P<0.05)，LEO組與NMDP組凋亡率比較無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表1、圖3。

圖1 各組腦皮層血流灌注量

圖2 各組腦海馬區(qū)形態(tài)學(xué)的比較(×200)

圖3 TUNEL染色檢測(cè)各組腦組織細(xì)胞凋亡(×400)

2.5ELISA 法檢測(cè)腦組織中IL-1β、IL-6和TNF-α的水平 4組腦組織中IL-1β、IL-6和TNF-α均具有明顯差異(P<0.05)。Model組IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著高于Sham組(P<0.05)，LEO組、NMDP組IL-1β、IL-6和TNF-α水平顯著低于Model組(P<0.05)；LEO組與NMDP組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見(jiàn)表1。

2.6免疫熒光檢測(cè)腦組織中NF-κB的核移位 4組腦組織細(xì)胞內(nèi)NF-κB核移位熒光強(qiáng)度具有明顯差異(P<0.05)。Model組NF-κB核移位熒光強(qiáng)度強(qiáng)于Sham組，LEO組、NMDP組NF-κB核移位熒光強(qiáng)度弱于Model組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LEO組與NMDP組無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)圖4、表2。

圖4 免疫熒光檢測(cè)NF-κB核位移(×400)

2.7Western印跡檢測(cè)腦組織中p-AMPK、p-eNOS和NF-κB蛋白的表達(dá) 4組腦組織中p-AMPK、p-eNOS和NF-κB蛋白表達(dá)具有明顯差異(P<0.05)。Model組p-AMPK、p-eNOS蛋白表達(dá)低于Sham組，NF-κB蛋白表達(dá)高于Sham組，LEO組、NMDP組p-AMPK、p-eNOS蛋白表達(dá)高于Model組，NF-κB蛋白表達(dá)低于Model組，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；LEO組與NMDP組無(wú)明顯差異(P>0.05)，見(jiàn)表2、圖5。

表2 各組NF-κB熒光強(qiáng)度及腦組織p-AMPK、 p-eNOS、 NF-κB蛋白表達(dá)

圖5 Wetern印跡分析p-AMPK、 p-eNOS、NF-κB蛋白表達(dá)

3 討 論

AD起病遲緩且發(fā)病隱匿，屬于慢性神經(jīng)退行性疾病，病理特征包括海馬神經(jīng)元大量凋亡及死亡、Aβ沉積等，多表現(xiàn)為記憶減退、精神障礙及行為障礙等。目前AD發(fā)病機(jī)制尚未明確，積極采取有效治療藥物緩解AD患者病情進(jìn)展是臨床亟待解決問(wèn)題。中藥中的有效成分或單一成分在AD的治療中取得了一定的突破，LEO作為益母草的有效成分之一，具有活血解毒的功效，隨著研究的深入，LEO對(duì)腦神經(jīng)具有良好的保護(hù)作用。據(jù)報(bào)道〔9〕，LEO預(yù)處理能夠明顯降低缺血缺氧導(dǎo)致的大鼠皮層神經(jīng)元凋亡率。研究顯示〔10〕，LFO與SD大鼠皮質(zhì)神經(jīng)元存在潛在關(guān)聯(lián)，LEO能明顯改善局灶性腦缺血再灌注大鼠腦海馬區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞的線粒體功能，并且可以抑制局灶性腦缺血再灌注模型SH-SYSY細(xì)胞凋亡，提示LEO能夠保護(hù)海馬區(qū)缺血引發(fā)的神經(jīng)元凋亡。另有學(xué)者研究證實(shí)，LEO能夠緩解腦震蕩引發(fā)的神經(jīng)功能損傷，其大鼠模型腦水腫明顯改善〔11〕。本研究發(fā)現(xiàn)，LEO減輕AD對(duì)學(xué)習(xí)和記憶能力的損傷程度，減少神經(jīng)元凋亡率，與上述研究結(jié)果一致。

研究表明，AD表現(xiàn)的認(rèn)知功能障礙，與腦部能量代謝失衡有關(guān)。AMPK屬于絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是能量代謝過(guò)程的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。在細(xì)胞能量代謝過(guò)程中，AMPK主要負(fù)責(zé)平衡外圍能量，如果細(xì)胞能量減弱時(shí)，激活A(yù)MPK能夠維持細(xì)胞的新陳代謝穩(wěn)定。所以，有學(xué)者稱之為平衡細(xì)胞能量的“介質(zhì)”〔12〕。有報(bào)道稱〔13〕，AMPK的激活是大腦神經(jīng)元修復(fù)過(guò)程的重要因素之一。eNOS是細(xì)胞氮元素代謝的重要參與者，受AMPK的影響，與神經(jīng)元凋亡、再生密不可分。NF-κB在多種類型細(xì)胞中存在，尤其是神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)元細(xì)胞和星形細(xì)胞〔14〕。是免疫平衡調(diào)節(jié)程序中重要的參與者。相關(guān)研究顯示，在高炎狀態(tài)下細(xì)胞核內(nèi)存在活化后NF-κB，其能夠?qū)Χ喾N編碼炎癥的靶基因展開(kāi)調(diào)控作用，進(jìn)而影響如IL-1β、IL-6 和 TNF-α等的表達(dá)，而高炎狀態(tài)下會(huì)導(dǎo)致腦神經(jīng)損傷加深，上游AMPK/eNOS通路會(huì)抑制NF-κB的表達(dá)〔15〕。相關(guān)研究顯示〔16〕，腦梗死后神經(jīng)細(xì)胞中AMPK/eNOS/NF-κB信號(hào)通路相關(guān)蛋白表達(dá)異常改變，進(jìn)一步說(shuō)明AMPK/eNOS/NF-κB信號(hào)通路參與腦細(xì)胞的修復(fù)和再生。本研究說(shuō)明AD腦部的神經(jīng)損傷與 AMPK/eNOS/NF-κB信號(hào)通路密切相關(guān)。LEO可能激活A(yù)MPK/eNOS通路，抑制NF-κB的活化發(fā)揮對(duì)AD大鼠腦組織的保護(hù)作用。