樊建平 趙玉軍 錢軍

(衢州市人民醫(yī)院胃腸外科，浙江 衢州 324000)

胃癌是一種發(fā)病率高、癌轉(zhuǎn)移率高、致死率高的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一〔1，2〕，屬于器質(zhì)性疾病，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜。盡管目前的外科手術(shù)和化療手段不斷進(jìn)步，但胃癌的死亡率仍居高不下，胃癌患者的5年生存率遠(yuǎn)低于30%〔3〕。胃癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)移成為影響治療成功與否的關(guān)鍵因素〔4〕。研究證實〔5〕因胃癌的局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移導(dǎo)致死亡的患者逐年上升。因此，探究與胃癌的病程發(fā)展相關(guān)的分子及作用機(jī)制在胃癌的診斷和治療中具有重大價值。肝腸-鈣黏連蛋白(CDH17)是新近發(fā)現(xiàn)的鈣黏蛋白(CAD)超家族的新成員，屬于一種鈣離子依賴性的細(xì)胞黏附蛋白，在正常生理狀態(tài)下僅在肝、腸組織中定位表達(dá)〔6〕。研究〔7〕顯示CDH17在胃癌中過表達(dá)，并且與腫瘤的惡性轉(zhuǎn)移與侵襲關(guān)系密切。Lee等〔8〕研究表明在早期胃腸系統(tǒng)中，CDH17的異常表達(dá)是胃腸腺體腫瘤的標(biāo)志物。Lin等〔9〕研究證實沉默CDH17的表達(dá)后明顯抑制胃癌細(xì)胞的淋巴轉(zhuǎn)移，提高胃癌患者生存率。因此，本研究通過對臨床上胃癌組織樣本及胃癌細(xì)胞株BGC823的研究，探討CDH17的表達(dá)對胃癌細(xì)胞侵襲及遷移的作用機(jī)制，以期為臨床上胃癌的靶向治療提供新的實驗數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1胃癌組織標(biāo)本的選取及臨床資料 選取2012年3月至2014年3月在衢州市人民醫(yī)院進(jìn)行手術(shù)切除的80例胃癌患者(男28例，女52例，患者年齡38～72歲，中位年齡51歲)的癌組織及對應(yīng)的癌旁組織(距離癌組織超過2.5 cm)作為研究對象，同時收集胃癌轉(zhuǎn)移淋巴組織標(biāo)本45例，入選患者術(shù)前均未接受放化療干預(yù)，均是首次手術(shù)切除病灶，組織病理學(xué)確診為原發(fā)性胃癌，并納入相關(guān)性研究。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者或其家屬均對本研究的目的知情，并簽署同意書。以定期門診復(fù)查和電話相結(jié)合的方式對患者進(jìn)行5年隨訪，總生存期(OS)為從手術(shù)開始至患者死亡或隨訪結(jié)束。

1.2實驗材料與方法

1.2.1實驗動物 30只，6～8周齡雄性 SD 裸鼠，SPF級，體重(150±30)g，由衢州市人民醫(yī)院基礎(chǔ)實驗動物研究中心從浙江海隆生物科技有限公司采購，動物的使用許可證號：SYXK(浙)2019-0024。

1.2.2細(xì)胞、試劑及主要儀器 人胃癌細(xì)胞BGC823從美國菌種保藏中心ATCC采購。過表達(dá)rAAV9-CDH17及陰性對照rAAV9-CDH17-NC由上海吉瑪科技公司提供。DMEM培養(yǎng)基(美國HyClone公司)；膜聯(lián)蛋白(ANX)A4，ANXA7抗體、兔抗大鼠抗甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(美國Cell Signaling公司)，Transwell小室(美國Santa Cruz公司)；Western印跡試劑盒(美國sigma公司)，免疫組化試劑盒、全蛋白抽提試劑盒(上海生工生物科技公司)，Lipofectamine3000轉(zhuǎn)染試劑(美國Corning公司)；磷酸鹽緩沖液(PBS，上海碧云天生物技術(shù)公司)。無菌生物工作臺(北京泰克儀器廠)，恒溫恒壓多功能細(xì)胞培養(yǎng)箱(上海力新儀器有限公司)；5810R 型高速離心機(jī)(日本島津公司) 。

1.3方法

1.3.1免疫組化法檢測CDH17蛋白的表達(dá) 將各樣本常規(guī)固定，按免疫組化試劑盒要求進(jìn)行包埋、切片、修復(fù)、浸泡、封閉，染色，復(fù)染，脫水，干燥、封片后鏡檢。切片結(jié)果經(jīng)病理科兩位醫(yī)師根據(jù)染色面積(面積范圍≤10%計為0分，>10%且≤25%計為1分，>25%且≤50%計為2分，>50%且≤75%計為3分，>75%計為4分)及染色強(qiáng)度(細(xì)胞無染色計為0分，弱黃色計為1分，黃色染色計為2分，棕黃色計為3分)進(jìn)行評分，兩者積分之和≥3分則為CDH17蛋白陽性表達(dá)，<3分則為CDH17蛋白陰性表達(dá)。

1.3.2細(xì)胞復(fù)蘇、培養(yǎng)以及分組處理 將人胃癌細(xì)胞BGC823細(xì)胞復(fù)蘇，接種于DMEM培養(yǎng)基中，37℃，5%CO2條件下恒溫恒壓多功能細(xì)胞培養(yǎng)箱進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞的生長密度超過85%時，消化傳代。進(jìn)行實驗。細(xì)胞分為正常組(僅有BGC823細(xì)胞，細(xì)胞培養(yǎng)基中只加入Lipofectamine3000試劑)、對照組(BGC823細(xì)胞經(jīng)Lipofectamine3000試劑轉(zhuǎn)染100 nmol/L 的rAAV9-CDH17-NC)、實驗組(BGC823細(xì)胞經(jīng)Lipofectamine3000試劑轉(zhuǎn)染100 nmol/L 的rAAV9-CDH17)。

1.3.3Transwell小室實驗檢測各組細(xì)胞的遷移和侵襲能力 遷移實驗：在Transwell小室的上室底部鋪一層不含血清的40 μl基質(zhì)膠，細(xì)胞分組處理同上，消化細(xì)胞并用1 ml的PBS清洗2遍后，同時用無血清RPMI1640培養(yǎng)液將細(xì)胞稀釋至1×105個/ml，加200 μl細(xì)胞懸液到Transwell上室，加500 μmol/L 含20%胎牛血清(FBS)的RPMI1640到Transwell下室，嚴(yán)格按試劑盒要求進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)、染色，鏡檢并拍照，采用ImagePro Plus6.0對圖片進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)。侵襲實驗與遷移實驗相同，但不鋪基質(zhì)膠。

1.3.4裸鼠皮下成瘤實驗 調(diào)整細(xì)胞濃度，以1×105個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，分組處理同上，置入在恒溫恒壓多功能細(xì)胞培養(yǎng)箱37℃繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞生長密度達(dá)到1×106個/ml時，消化細(xì)胞，離心5 min，棄掉上清液，加入500 μl PBS，避光放置于冰上，使用1 ml 注射器分別將胃癌細(xì)胞懸液注射進(jìn)預(yù)先麻醉好的裸鼠右前肢皮下。接種第5天后連接活體成像系統(tǒng)(IVIS)。留取大鼠皮下成瘤瘤組織轉(zhuǎn)移圖像。7 w后頸部放血處死裸鼠，收集皮下成瘤的標(biāo)本，稱量質(zhì)量同時留取記錄。

1.3.5Western印跡檢測各組細(xì)胞中CDH17、ANXA4、ANXA7的表達(dá)水平 調(diào)整細(xì)胞濃度按1×105個/孔接種至6孔板中，分組處理同上，置入恒溫恒壓多功能細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)3 h，加入細(xì)胞裂解液，提取總蛋白，二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白含量。每個樣本取50 μg樣品，進(jìn)行凝膠電泳后，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉1 h ，分別加稀釋好的一抗，4℃過夜孵育。次日，取出恢復(fù)至室溫，聚丁二酸-共-對苯二甲酸丁二醇酯(PBST)充分洗膜，加適量稀釋好的辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫震蕩1 h，PBST洗膜，加電化學(xué)發(fā)光(ECL)進(jìn)行顯色，拍照及灰度掃描，最后以GAPDH作為內(nèi)參蛋白，用Image J 軟件分析各條帶的灰度值。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS19.0軟件進(jìn)行t檢驗、χ2檢驗。

2 結(jié) 果

2.1免疫組化法檢測CDH17蛋白的表達(dá) CDH17在癌旁組織中以陰性表達(dá)為主；CDH17在胃癌組織以陽性表達(dá)為主，陽性表達(dá)率78.75%，且CDH17的表達(dá)主要定位在細(xì)胞膜及細(xì)胞質(zhì)中；CDH17在胃癌轉(zhuǎn)移淋巴組織中以陽性表達(dá)為主，陽性表達(dá)率高達(dá)88.89%。見圖1。

圖1 免疫組化檢測標(biāo)本中CDH17的表達(dá)(SP，×400)

2.2CDH17的表達(dá)與胃癌的臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性分析 不同性別、年齡、腫瘤直徑、組織分化程度患者CDH17表達(dá)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；不同淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、浸潤深度、TNM分期患者CDH17表達(dá)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 不同臨床病理特征患者CDH17表達(dá)比較〔n(%)〕

2.3不同CDH17蛋白表達(dá)程度胃癌患者生存分析 CDH17陽性患者(n=63)5年生存率為22.22%，陰性表達(dá)患者(n=17)5年生存率為41.35%，兩者差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖2。

圖2 不同CDH17蛋白表達(dá)程度與胃癌患者生存分析

2.4Transwell小室實驗檢測各組細(xì)胞的遷移和侵襲能力 與正常組相比，實驗組細(xì)胞遷移個數(shù)和通過基質(zhì)膠的個數(shù)明顯增多(P<0.05)；正常組與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、表2。

2.5CDH17對裸鼠成瘤的影響 與正常組相比，實驗組裸鼠內(nèi)移植瘤的明顯變大，瘤體重量明顯增加(P<0.05)；與正常組相比，實驗組裸鼠內(nèi)移植瘤瘤體淋巴轉(zhuǎn)移的病灶比例明顯增加(P<0.05)；正常組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3、圖4、圖5。

圖3 Transwell小室實驗檢測各組細(xì)胞的遷移和侵襲能力(結(jié)晶紫染色，×400)

表2 各組細(xì)胞遷移和侵襲的數(shù)量(個，

表3 瘤體質(zhì)量和淋巴轉(zhuǎn)移比例

圖4 CDH17對裸鼠成瘤瘤體轉(zhuǎn)移的影響

圖5 CDH17 對裸鼠成瘤的影響

2.6CDH17與ANXA4、ANXA7蛋白的關(guān)系及表達(dá)水平 與正常組相比，實驗組細(xì)胞中CDH17、ANXA4、ANXA7的表達(dá)水平明顯上升(P<0.05)；正常組與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖6。

表4 各組細(xì)胞中CDH17，ANXA4， ANXA7的相對表達(dá)量

圖6 各組CDH17、ANXA4、ANXA7蛋白表達(dá)

3 討 論

Wang等〔10〕研究證實胃癌細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)移和侵襲是胃癌預(yù)后差的關(guān)鍵因素。胃癌細(xì)胞具有較強(qiáng)的侵襲和遷移能力，促使胃癌早期即發(fā)生轉(zhuǎn)移，或者在轉(zhuǎn)移過程中胃癌細(xì)胞會發(fā)生進(jìn)一步變化，導(dǎo)致化療失敗，誘導(dǎo)胃癌復(fù)發(fā)或者更深層的轉(zhuǎn)移〔11〕。

研究表明〔12〕胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲過程中，黏附分子介導(dǎo)的細(xì)胞黏附力降低是至關(guān)重要的環(huán)節(jié)。已證實〔13〕鈣黏蛋白介導(dǎo)的細(xì)胞黏附在胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。CDH17定位于8q22.1染色體上，是由832個氨基酸構(gòu)成的跨膜蛋白。已有的研究證實〔14〕，CDH17在胃正常組織中基本不表達(dá)，在胃腸系統(tǒng)腺體癌中高表達(dá)，本研究與之一致。本研究結(jié)果推斷CDH17的陽性表達(dá)可能與腫瘤細(xì)胞的侵襲有關(guān)。Jin等〔15〕研究表明CDH17的表達(dá)上調(diào)能增加胃腺癌的轉(zhuǎn)移率，降低胃癌患者的生存率，起到關(guān)鍵的促癌作用。Bartolomé等〔16〕研究證實下調(diào)CDH17能明顯降低結(jié)腸癌細(xì)胞和肝癌細(xì)胞的增殖，起到明顯的抑癌作用。這可能與CDH17在不同腫瘤中所起的作用不同或不同組織中CDH17與不同的特異性結(jié)合分子結(jié)合產(chǎn)生的效應(yīng)不同有關(guān)。本研究結(jié)果表明過表達(dá)CDH17后，胃癌細(xì)胞BGC823細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降增強(qiáng)；體外裸鼠成瘤實驗結(jié)果顯示CDH17的促癌作用。

轉(zhuǎn)移和侵襲是惡性腫瘤的基本生物學(xué)特征，這過程中涉及多種蛋白因子相互協(xié)調(diào)共同作用完成〔17〕。ANXA4和ANXA7是一類與鈣離子特異性結(jié)合的鈣依賴性磷脂蛋白。膜聯(lián)蛋白結(jié)構(gòu)上含有可變的N-末端結(jié)構(gòu)域，依靠該結(jié)構(gòu)域的變化，膜聯(lián)蛋白能直接參與細(xì)胞膜的形成、轉(zhuǎn)運(yùn)、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及細(xì)胞增殖、分化和凋亡等生物學(xué)細(xì)胞活動〔18〕。ANXA4和ANXA7作為細(xì)胞表面受體，一方面可與組織型纖維蛋白溶解酶原激活物及纖溶酶原特異性結(jié)合生成纖溶酶，促進(jìn)纖維蛋白的降解；另一方面能夠激活內(nèi)皮細(xì)胞的纖溶酶原促進(jìn)金屬蛋白和多種膜蛋白的水解，細(xì)胞外基質(zhì)的降解，加速腫瘤的血管新生推動腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移〔19〕。有研究證實〔20〕ANXA4和ANXA7在胃癌對淋巴轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮了重要作用。本研究結(jié)果表明推斷CDH17可能通過調(diào)控ANXA4、ANXA7的表達(dá)來影響胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲。

綜上，CDH17在胃癌中呈高表達(dá)，并且能夠促進(jìn)胃癌細(xì)胞823的遷移和侵襲，這可能與CDH17能夠調(diào)控ANXA4，ANXA7的表達(dá)有關(guān)。但是CDH17能否通過調(diào)控其他蛋白因子的表達(dá)來影響胃癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，還需進(jìn)一步的研究。