陳薪旭 王埮 張?zhí)?

(海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，海南 ?？?570102)

帕金森病(PD)是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一〔1〕。由于人口增長及人口老齡化，根據(jù)已發(fā)表的流行病學(xué)研究數(shù)據(jù)計算，10年后我國PD人數(shù)將達(dá)到500萬〔2〕。腸道菌群已被認(rèn)為是包括PD在內(nèi)的許多神經(jīng)退行性疾病發(fā)病機制的一個組成部分〔3,4〕。然而，腸道微生物菌群失調(diào)與PD發(fā)病機制之間的機制尚不清楚，也沒有公認(rèn)的治療方法可以阻止或減緩PD進展。糞菌移植(FMT)作為重建腸道菌群最有效的方法之一，已顯示出對PD的潛在治療作用，但其有效性及安全性有待進一步確定〔5〕。神經(jīng)炎癥在PD的神經(jīng)退行性過程中起主導(dǎo)作用〔6,7〕。本研究用1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)構(gòu)建慢性PD小鼠模型，探討FMT對PD小鼠模型黑質(zhì)區(qū)炎癥反應(yīng)的影響。

1 資料與方法

1.1實驗動物 本實驗選用8周齡、體重20 g左右雄性SPF級C57BL/6小鼠〔浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院，許可證號：SCXK(蘇)2019-0002〕。飼養(yǎng)環(huán)境：室內(nèi)溫度控制在24℃左右、相對濕度50%～60%，每日光照時間12 h，黑暗時間12 h。

1.2實驗試劑 MPTP、丙舒磺(美國Sigma)； 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)染色、二喹啉甲酸(BCA)蛋白測量試劑盒、辣根過氧化物酶(HRP)抗小鼠抗體、HRP抗兔抗體、HRP抗山羊抗體(碧云天)；Triton X-100、牛血清白蛋白(BSA)、四甲基乙二胺(TEMED)、蛋白marker(Solarbio)；聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore)；ECL發(fā)光液(Tanon)；精氨酸(Arginase)抗體、離子鈣結(jié)合銜接分子(Iba)-1抗體、p-張力蛋白同源物基因(PTEN)、PTEN(abcam)；SYBR green溶液、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、RNAiso Plus(Takara)。

1.3實驗設(shè)備 轉(zhuǎn)棒測試儀(上海欣軟)；組織脫水機、組織包埋機、組織攤片機(睿普思星)；顯微鏡、成像系統(tǒng)(日本尼康)；激光掃描共聚焦顯微鏡(蔡司)；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)電泳儀、濕法轉(zhuǎn)膜儀(BioRad)；化學(xué)發(fā)光檢測系統(tǒng)(Tanon)；熒光定量PCR儀(Applied Biosystems)。

1.4實驗分組與造模 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機分為對照組、PD模型組、PD+FMT組，每組6只。MPTP腹腔注射構(gòu)建慢性PD小鼠模型：MPTP 20 mg/kg腹腔注射，觀察1 h，再予丙磺舒250 mg/kg腹腔注射；此后每3.5 d注射一次，造模時間為35 d。對照組每日予等量生理鹽水腹腔注射；自由飲用純凈水。第36天開始，PD+FMT組每天給予200 μl新鮮糞菌懸液(108CFU/ml)灌胃1次，共14 d；對照組、PD模型組每天給予等量生理鹽水灌胃。

1.5行為學(xué)檢測 轉(zhuǎn)棒實驗：使用Rotamex裝置測量旋轉(zhuǎn)腳架性能測試。旋轉(zhuǎn)腳架系統(tǒng)的參數(shù)包括啟動速度、加速和最高速度〔1 r/min，加速12 r/(min·2 s)，50 r/min〕。小鼠進行3個連續(xù)試驗，每個試驗之間的休息時間為30 min。在最后兩次試驗中，從旋轉(zhuǎn)桿上掉下來的平均等待時間用于分析。

爬桿實驗：爬桿高50 cm，直徑1 cm，頂端有直徑35 mm的圓球。測試過程中，將老鼠放置在圓球上，分析老鼠頭朝下的時間(T-turn)，如果老鼠在圓球上停留超過30 s，則引導(dǎo)其爬下桿，并將 T-turn 計為 30 s；分析爬到桿底時間(T-LA)。每只老鼠在測試前1 d進行3次訓(xùn)練。測試當(dāng)天，每只老鼠重復(fù)爬桿2次，記錄平均值。

1.6腸道菌群檢測 用1.5 ml無菌EP管收集新鮮糞便，收集完成后將糞便立即置于-80℃冰箱保存。行16 S rDNA 基因測序技術(shù)檢測小鼠腸道菌群，通過多樣性指數(shù)chao1、observed species進行多樣性比較，從腸道菌群屬水平對比進行菌群結(jié)構(gòu)分析。

1.7蘇木素-伊紅(HE)染色檢測小鼠盲腸黏膜組織形態(tài)學(xué)變化 取盲腸頂部1.5 cm(包括盲腸扁桃體)進行脫水、包埋、切片后，予蘇木素染細(xì)胞核、伊紅染細(xì)胞質(zhì)，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。

1.8免疫熒光染色檢測黑質(zhì)酪氨酸羥化酶(TH)、Iba-1、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)、Arginase表達(dá) 每只小鼠按體重給予100 mg/kg劑量的戊巴比妥鈉腹腔注射處死，開顱取腦后將腦至于-80℃速凍5 min，分離挖取黑質(zhì)。4%多聚甲醛固定小鼠腦標(biāo)本24 h以上，在4℃冰箱予15%蔗糖溶液、30%蔗糖溶液進行2次脫水，隨后OCT包埋、切片，切片厚度為6 μm。固定切片，5%BSA溶液滴在切片上并溫育30 min，將第一抗體(1∶200稀釋度)滴在切片上4℃孵育過夜，第二抗體(1∶200稀釋度)滴在切片，室溫避光孵育30 min，最后用DAPI染核10 min，每個步驟均用磷酸鹽緩沖液(PBS)溶液清洗3次。染色成功后進行熒光照片。

1.9Western印跡檢測黑質(zhì)TH、Iba-1、iNOS、Arginase表達(dá) 分離小鼠中腦黑質(zhì)，液氮速凍，以50 mg/ml比例加入含有苯甲基磺酰氟(PMSF)裂解液，經(jīng)超聲裂解后得到總蛋白。采用BCA試劑盒測蛋白濃度，取部分蛋白溶液，加入上樣緩沖液，沸水中變性3 min。微量器加量，SDS-PAGE，PVDF膜轉(zhuǎn)膜，一抗(抗TH)4℃孵育過夜，5%脫脂奶粉封閉1 h，加入二抗，室溫孵育2 h，凝膠成像儀顯影拍照，使用Image J進行灰度值分析。

1.10實時定量PCR檢測小鼠黑質(zhì)白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-10 分離小鼠中腦黑質(zhì)，液氮速凍后磨成粉末，取出組織，提取RNA，根據(jù)通過Nano Drop和OD230，OD260和OD280檢測的濃度確定RNA純度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒按步驟逆轉(zhuǎn)錄，隨后進行熒光定量PCR，根據(jù)儀器收集的數(shù)值對數(shù)據(jù)進行分析。

1.11統(tǒng)計處理 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組行為學(xué)及TH表達(dá)情況 轉(zhuǎn)棒實驗：與對照組〔(99±6.94)s〕相比，PD模型組轉(zhuǎn)棒掉落的潛伏期〔(46±5.11)s〕明顯縮短(P<0.01)；與PD模型組相比，PD+FMT組轉(zhuǎn)棒掉落時間〔(69±7.10)s〕明顯延長(P<0.05)。爬桿實驗：與對照組T-turn〔(1.75±0.22)s〕及T-LA〔(3.83±0.27)s〕相比，PD模型組T-turn〔(9.83±2.03)s〕及T-LA〔(8.42±0.6)s〕明顯延長(P<0.01)；PD+FMT組T-turn〔(5.25±0.68)s〕及T-LA〔(6.42±0.5)s〕均較PD模型組明顯縮短(P<0.05)。免疫熒光檢測PD模型小鼠中腦黑質(zhì)TH表達(dá)，PD模型組腦內(nèi)黑質(zhì)區(qū)TH表達(dá)顯著下調(diào)，PD+FMT組較PD模型組黑質(zhì)區(qū)TH表達(dá)回升。見圖1。

圖1 各組黑質(zhì)中TH表達(dá)(免疫熒光染色，×100)

2.2各組腸道菌群情況 與對照組相比，PD模型組腸道菌群多樣性指數(shù)chao1(1 104±50.46 vs 807±53.67)、observed species(1 043±58.25 vs 791±54.89)均明顯升高(P<0.05)，PD+FMT組多樣性指數(shù)chao1(942±50.12)、observed species(896±41.96)相比PD模型組下降，但無明顯差異(P>0.05)。與對照組比較，PD模型組厭氧菌屬(0.946±0.149 vs 0.070±0.029)、雙歧桿菌屬(0.046±0.004 vs 0.000±0.000)、桿菌屬(0.038±0.009 vs 0.004±0.001)、ASF356屬(0.166±0.040 vs 0.016±0.012)和瘤胃球菌屬(0.137±0.030 vs 0.003±0.001)的構(gòu)成比顯著上升，布勞特菌屬(0.090±0.011 vs 0.374±0.063)的構(gòu)成比顯著下降(均P<0.01)；PD+FMT組厭氧菌屬(0.191±0.066)、雙歧桿菌屬(0.006±0.002)、桿菌屬(0.197±0.008)、ASF356(0.012±0.003)和瘤胃球菌屬(0.011±0.003)的構(gòu)成比較PD模型組顯著下降(P<0.01)，布勞特菌屬(0.322±0.076)的構(gòu)成比較PD模型組顯著上升(P<0.05)。對照組與PD+FMT組比較，以上菌屬豐度占比無明顯差異(P>0.05)。

2.3各組腸道炎癥情況 HE染色可見，對照組盲腸黏膜形態(tài)正常，而PD模型組盲腸黏膜下有炎癥細(xì)胞浸潤，PD+FMT組炎癥細(xì)胞較PD模型組明顯減少。見圖2。

圖2 各組盲腸HE染色(×100)

2.4各組黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞的表達(dá) 免疫熒光檢測發(fā)現(xiàn)，PD模型組黑質(zhì)中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目(Iba1+iNOS+)〔(34±3)個〕明顯高于對照組〔(4±1)個〕，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目(Iba1+Arginase+)〔(14±2)個〕明顯高于對照組〔(3±0)個〕，M1/M2比值(2.45±0.17)大于1；與較PD模型組比較，PD+FMT組中M1型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目〔(20±2)個〕下降，M2型小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)目上升〔(29±2)個〕，M1/M2比值(0.68±0.06)小于1。見圖3、圖4。實時定量 PCR法檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組(1.00±0.19、1.00±0.18)相比，PD模型組黑質(zhì)組織中炎癥因子IL-1β表達(dá)上調(diào)(2.37±0.20)，抗炎因子IL-10表達(dá)下調(diào)(0.61±0.19)，F(xiàn)MT處理后炎癥因子IL-1β表達(dá)下調(diào)(1.47±0.34)，抗炎因子IL-10表達(dá)上升(0.77±0.05)。

圖3 各組黑質(zhì)Iba-1、Arginase表達(dá)(×400)

圖4 各組黑質(zhì)Iba-1、iNOS表達(dá)(×400)

Western印跡檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組(0.48±0.10、0.32±0.06、0.51±0.08)相比，PD模型組黑質(zhì)中Iba-1、iNOS、Arginase表達(dá)(1.02±0.13、0.90±0.09、0.83±0.03)上調(diào)，F(xiàn)MT處理后Iba-1、iNOS表達(dá)(0.76±0.08、0.61±0.07)有所下調(diào)，Arginase表達(dá)(1.00±0.08)進一步上升。見圖5。

圖5 各組黑質(zhì)Iba-1、iNOS、Arginase表達(dá)

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)，約有80%的PD患者合并胃腸功能障礙，常見的臨床特征包括便秘、異常流涎、吞咽障礙、惡心、胃排空障礙〔8〕。此外，其他已知的可增加腸道通透性的疾病，最近也證實增加了罹患PD的風(fēng)險〔9〕。大量證據(jù)表明，PD患者腸道菌群改變，PD發(fā)病、進展與腸道菌群密不可分〔8～11〕。Lubomski等〔10〕回顧研究發(fā)現(xiàn)，PD組與健康對照組之間存在顯著差異，且與非PD對照組相比，PD患者的整體糞便菌群組成在總體上也顯示出顯著差異。本實驗也驗證了MTPT致慢性PD小鼠模型中腸道菌群組成的明顯改變，同時PD模型小鼠出現(xiàn)腸道及黑質(zhì)區(qū)炎癥反應(yīng)。MTPT致慢性PD小鼠模型較完整的模擬了人類PD的疾病特征。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)MT通過恢復(fù)PD小鼠的腸道菌群組成結(jié)構(gòu)進而減輕腸道炎癥，同時促進黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2抗炎表型極化，使炎癥因子表達(dá)減少，抗炎因子表達(dá)增加，從而減輕小鼠運動障礙癥狀?，F(xiàn)有研究表明〔11〕，紊亂的腸道菌群會破壞胃腸道保護性屏障的穩(wěn)定，腸道菌群或其微生物代謝物如脂多糖(LPS)等的移位，繼而誘發(fā)腸道氧化應(yīng)激和炎癥，從而誘導(dǎo)黏膜通透性的增加及ENS中的α-Syn聚集。Toll樣受體(TLR)4是一種存在于在免疫細(xì)胞中的模式識別受體，是LPS的唯一受體，革蘭陰性細(xì)菌釋放其表面LPS，后者與TLR4結(jié)合，將信號轉(zhuǎn)到免疫細(xì)胞內(nèi)部，分泌細(xì)胞因子腫瘤壞死因子(TNF)-α、干擾素(INF)-γ、IL-6和IL-1β等導(dǎo)致炎癥反應(yīng)〔11〕。Colonna等〔12〕也在PD患者結(jié)腸組織中發(fā)現(xiàn)了更多的CD3+T細(xì)胞和TLR4，且在PD小鼠病理模型中敲除TLR4后，腸道炎癥、腸道和運動功能障礙、神經(jīng)炎癥和神經(jīng)退行性變有所緩解。LPS、IFN-γ可觸發(fā)TLR信號通路和IFN-γ信號通路，誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型活化〔12〕，向小鼠腸道內(nèi)注射LPS，發(fā)現(xiàn)中樞神經(jīng)系統(tǒng)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型激活，產(chǎn)生神經(jīng)炎癥〔12〕。LPS可能是腸道菌群影響PD腸道炎癥、小膠質(zhì)細(xì)胞M1型活化及腦內(nèi)炎癥反應(yīng)的橋梁。本實驗中，PD模型小鼠腸道厭氧菌、雙歧桿菌、桿菌、球菌豐度增加，其中雙歧桿菌屬、桿菌屬以革蘭陰性細(xì)菌為主。本研究結(jié)果提示，腸道菌群對PD模型組小鼠黑質(zhì)區(qū)小膠質(zhì)細(xì)胞影響的機制可能是PD小鼠革蘭陰性桿菌比例增加，LPS產(chǎn)生增多，誘發(fā)腸道炎癥、黑質(zhì)區(qū)炎癥反應(yīng)，F(xiàn)MT后，相關(guān)細(xì)菌占比下降，LPS產(chǎn)生減少，腸道炎癥及黑質(zhì)區(qū)炎癥反應(yīng)減輕，多巴胺神經(jīng)元凋亡減少，PD癥狀改善。目前本研究僅探討了現(xiàn)象，腸道菌群如何影響黑質(zhì)區(qū)炎癥反應(yīng)的機制需要深入研究。

FMT是將從健康供體的糞便中獲得的腸道微生物群引入(移植)到患者的胃腸道中重建患者整體腸道菌群的方法。這種療法廣泛用于治療由病原微生物或條件病原微生物活動引起的胃腸道疾病，且效果良好〔13〕。最近越來越多的研究報道了FMT用于治療代謝綜合征、糖尿病、癌癥和阿爾茨海默病等也取得良好效果〔14，15〕。在非PD便秘患者中進行正常人群FMT后，發(fā)現(xiàn)患者的便秘得到明顯改善〔15〕。本研究發(fā)現(xiàn)，給予FMT后小鼠行為學(xué)改善，腸道炎癥好轉(zhuǎn)，黑質(zhì)區(qū)炎癥反應(yīng)減輕，小膠質(zhì)細(xì)胞以M2抗炎表型占主導(dǎo)。而現(xiàn)有臨床病例顯示，F(xiàn)MT并沒有影響PD核心癥狀，最多可能改變相關(guān)的疾病特征，如便秘、焦慮及抑郁〔16〕。健康糞菌來源、移植方式及飲食習(xí)慣、藥物使用都有可能是PD患者FMT治療的影響因素，仍需要進一步研究探討。