徐紀(jì)偉 孫丹華 陳旭東

(漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)?；A(chǔ)醫(yī)學(xué)部，河南 漯河 462000)

鈣信號(hào)不僅是生命活動(dòng)中的基礎(chǔ)信號(hào)之一，還可作為第二信使激活細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)通路，成為生命賴以整合內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和動(dòng)態(tài)的基礎(chǔ)，在生命調(diào)節(jié)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。當(dāng)機(jī)體處于病理狀態(tài)下，鈣離子通道大量開(kāi)放，鈣離子大量?jī)?nèi)流及“鈣池”釋放鈣離子過(guò)度增加，導(dǎo)致鈣穩(wěn)態(tài)失衡，發(fā)生細(xì)胞鈣超載現(xiàn)象，引起細(xì)胞毒性損傷。隨著研究的深入，逐漸發(fā)展鈣信號(hào)還具備與特殊結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)結(jié)合，通過(guò)多個(gè)途徑的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)參與細(xì)胞周期調(diào)過(guò)程〔1〕。

最近發(fā)現(xiàn)的神經(jīng)元型鈣結(jié)合蛋白(NECAB)2屬于鈣結(jié)合蛋白超家族中的一員，鈣結(jié)合蛋白超家族成員通常具有多個(gè)EF-hand保守結(jié)構(gòu)，但它僅具備一個(gè)EF-hand特殊結(jié)構(gòu)，因此這個(gè)鈣結(jié)合能力與其他的鈣結(jié)合蛋白如P物質(zhì)和CB相比較弱，但正是由于它特殊的化學(xué)結(jié)構(gòu)使得其功能具備一定的特異性〔2〕。NECAB2的分布相對(duì)局限，主要在睪丸、大腦和脊髓出現(xiàn)〔3〕，目前研究主要集中在精子發(fā)育代謝和鞭毛運(yùn)動(dòng)的調(diào)控及外周神經(jīng)損傷后疼痛刺激信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制，而關(guān)于NECAB2在中樞神經(jīng)損傷后的神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸傳遞以及神經(jīng)可塑性等方面如何發(fā)揮功能還不是很明確。本研究旨在觀察大鼠脊髓損傷后NECAB2與Caspase-3、Syn、CGRP的共同表達(dá)情況，探討NECAB2對(duì)神經(jīng)損傷后相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的內(nèi)在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和試劑 成年雌性SD大鼠120只，鼠齡6～8 w，體重200～220 g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證：豫SCXK2017-0001)。兔抗大鼠NECAB2抗體(Proteintech Group)、小鼠抗大鼠突觸素(Syn)抗體(Millipore Biotechnology)、小鼠抗大鼠降鈣素基因相關(guān)肽(CGRP)抗體(Santa Cruz)、小鼠抗大鼠半胱氨酸蛋白酶(Caspase)-3抗體(Santa Cruz)、異硫氰酸熒光素(FITC)標(biāo)記的羊抗兔IgG(北京中杉生物技術(shù)公司)、四甲基異硫氰酸羅丹明(TRITC)標(biāo)記的羊抗小鼠IgG、生物素化羊抗兔IgG、親和素-生物素-過(guò)氧化物酶復(fù)合物(ABC)試劑(北京中杉生物技術(shù)公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)分組及模型建立 將動(dòng)物分成對(duì)照組、脊髓損傷組。實(shí)驗(yàn)大鼠用戊巴比妥鈉(45 mg/kg)腹腔注射麻醉后俯臥位固定，以T9胸棘突為中心剪除毛發(fā)，常規(guī)消毒，正中切開(kāi)皮膚，分離肌肉，顯露T9-T10棘突，咬除該段椎板，暴露出脊髓，快速切斷一側(cè)脊髓至正中靜脈右緣，不要損傷靜脈，用生理鹽水沖洗，逐層縫合傷口，按摩膀胱助排尿，室溫下自然蘇醒，建立脊髓半切損傷模型〔4〕。對(duì)照組大鼠只切開(kāi)皮膚肌肉，暴露脊髓，但不損傷脊髓。

1.3組織標(biāo)本制備 每組取10只/時(shí)點(diǎn)大鼠，麻醉后仰臥位固定，剪開(kāi)胸腔暴露心臟，從左心室進(jìn)針插入主動(dòng)脈，立即用生理鹽水快速灌注，等右心房流出無(wú)色清亮液體后，再注入4%多聚甲醛，大鼠僵硬后快速打開(kāi)脊椎管，取損傷段上下各0.5 cm脊髓組織(對(duì)照組取相應(yīng)解剖位置)，置于4%多聚甲醛固定包埋，再進(jìn)行石蠟切片，片厚10 μm。

1.4檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1免疫熒光染色 切片放置于室溫靜置30 min后進(jìn)行抗原修復(fù)；切片放置于10%山羊血清中，4℃過(guò)夜；滴加NECAB2抗體(1∶200)，放置于濕盒，4℃過(guò)夜；磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗(3×5 min)，滴加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG，4℃孵育12 h，PBS漂洗(3×5 min)，滴加甘油封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4.2免疫雙標(biāo)染色 切片滴加NECAB2抗體(1∶200)，再滴加Caspase-3抗體或Syn或CGRP抗體(1∶200)，放置于濕盒，4℃過(guò)夜；PBS漂洗(3×5 min)，再滴加FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG和TRITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG，4℃孵育12 h，PBS漂洗(3×5 min)，滴加甘油封片，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.4.3免疫印跡 每組取10只/時(shí)點(diǎn)大鼠，麻醉后快速打開(kāi)脊椎管，收集損傷區(qū)上下各0.5 cm脊髓組織(對(duì)照組取相應(yīng)解剖位置)，放置裂解液中勻漿，高速離心取上清液備用。用Bio-Rad分析蛋白濃度后，取20 μg蛋白液做十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳，用300 mA進(jìn)行2 h蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到聚偏氟乙烯(PVDF)膜，用脫脂牛奶封閉2 h。TBST漂洗(3×5 min)。滴加NECAB2抗體(1∶500)，4℃過(guò)夜；TBST漂洗(3×5 min)，再滴加生物素化山羊抗兔IgG(1∶500)，放置2 h，TBST漂洗(3×5 min)。再滴加ABC試劑，避光放置1 h，TBST漂洗(3×5 min)。觀察結(jié)果，重復(fù)3次。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1免疫熒光 對(duì)照組在脊髓后角發(fā)現(xiàn)NECAB2陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞呈現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)。脊髓損傷后的1～3 d中NECAB2陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)呈現(xiàn)逐漸降低趨勢(shì)，直到脊髓損傷后7 d發(fā)現(xiàn)NECAB2的表達(dá)水平開(kāi)始逐漸恢復(fù)，且到14 d達(dá)到高峰，之后維持在較高水平表達(dá)，但表達(dá)水平仍低于對(duì)照組。見(jiàn)圖1、表1。

圖1 術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)免疫熒光檢測(cè)NECAB2陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞表達(dá)情況(×400)

表1 脊髓損傷后各時(shí)間點(diǎn)NECAB2陽(yáng)性神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量個(gè)/視野)

2.2Western印跡 脊髓損傷組NECAB2表達(dá)在術(shù)后1～3 d出現(xiàn)了減少現(xiàn)象，術(shù)后7 d開(kāi)始逐漸升高，到術(shù)后14 d達(dá)到高峰，之后維持在較高水平表達(dá)，但仍明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。對(duì)照組NECAB2呈現(xiàn)穩(wěn)定高水平表達(dá)。見(jiàn)圖2、表2。

2.3免疫熒光雙標(biāo) 脊髓損傷后14 d發(fā)現(xiàn)NECAB2與Syn明顯共表達(dá)，NECAB2與CGRP在鄰近細(xì)胞呈現(xiàn)互補(bǔ)表達(dá)，與Caspase-3不存在共表達(dá)。見(jiàn)圖3。

圖2 Western印跡檢測(cè)NECAB2相對(duì)吸光度值

表2 脊髓損傷后各組各時(shí)間點(diǎn)NECAB2表達(dá)水平比較

圖3 脊髓損傷術(shù)后14天NECAB2、CGRP、Syn、Caspase-3表達(dá)情況(×400)

3 討 論

鈣結(jié)合蛋白(CaBPs)鈣結(jié)合蛋白家族包括CaM、CB、PV、CR等兩百多種蛋白質(zhì)，是一組具有E-Fhand保守結(jié)構(gòu)的酸性蛋白超家族，可分為兩種類型：一種類型是激發(fā)型，它們與鈣離子結(jié)合后迅速發(fā)生扭曲變形，進(jìn)而結(jié)合靶分子，調(diào)節(jié)其活性；另一種類型是緩沖型，主要參與胞內(nèi)鈣離子濃度的調(diào)節(jié)〔5〕。其中緩沖型鈣結(jié)合蛋白又是通過(guò)兩個(gè)途徑發(fā)揮作用：首先，鈣結(jié)合蛋白可以減少由T/L型電壓敏感的鈣離子通道進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的鈣離子流；其次，鈣結(jié)合蛋白具備EF-hand特殊結(jié)構(gòu)，高親和度結(jié)合鈣離子，共同作用降低細(xì)胞內(nèi)游離的鈣離子濃度〔6〕。

NECABs家族有3個(gè)成員，即NECAB1、NECAB2、NECAB3，其中NECAB1主要存在于大腦、結(jié)腸、肝臟和胰腺等器官，NECAB3主要存在于大腦、心臟和骨骼肌等器官，而NECAB2的分布相對(duì)局限，主要在睪丸、大腦和脊髓出現(xiàn)，它能夠發(fā)現(xiàn)細(xì)胞鈣離子濃度的微小變化，去極化時(shí)高親和力結(jié)合鈣離子，維持細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)〔7,8〕。

在脊髓損傷后的早期，神經(jīng)組織直接遭受機(jī)械性打擊破壞組織結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞及微血管床等出現(xiàn)損傷，細(xì)胞出現(xiàn)急性腫脹、細(xì)胞器崩解、結(jié)構(gòu)消失，進(jìn)而發(fā)生脂質(zhì)過(guò)氧化損傷和細(xì)胞鈣超載現(xiàn)象，最終引發(fā)組織細(xì)胞“瀑布式”級(jí)聯(lián)損傷作用。細(xì)胞損傷過(guò)程中鈣離子超載現(xiàn)象是最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，因?yàn)榇罅库}離子內(nèi)流不僅激活凋亡蛋白酶激活因子(Apaf)-1，還能抑制凋亡抑制因子B細(xì)胞淋巴瘤(Bcl)-2活性〔9,10〕，通過(guò)蛋白激酶(PK)C和絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號(hào)通路，進(jìn)而激活Caspase-3大量表達(dá)，誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞凋亡〔11〕。Sch?ndorf等〔12〕研究發(fā)現(xiàn)通過(guò)慢病毒介導(dǎo)的短發(fā)夾shRNA技術(shù)敲除誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞(iPSC)衍生神經(jīng)元中NECAB2基因，再將iPSC衍生神經(jīng)元暴露于鈣鎂混合載體A23187，并通過(guò)免疫染色評(píng)估神經(jīng)毒性，發(fā)現(xiàn)咖啡因誘導(dǎo)的胞質(zhì)鈣離子水平增加，加重了神經(jīng)毒性損傷，這也從側(cè)面說(shuō)明NECAB2具備鈣緩沖特性。因此在脊髓損傷早期由于損傷區(qū)域存活的神經(jīng)細(xì)胞較少及鈣離子大量?jī)?nèi)流發(fā)生鈣超載，細(xì)胞凋亡情況較為嚴(yán)重，導(dǎo)致NECAB2表達(dá)水平相對(duì)較低。

在脊髓損傷的后期，由于炎性介質(zhì)的促發(fā)效應(yīng)引起星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞和少突膠質(zhì)細(xì)胞前體細(xì)胞在損傷區(qū)域聚集，尤其是星形膠質(zhì)細(xì)胞被大量活化，產(chǎn)生神經(jīng)膠質(zhì)纖維逐漸形成致密的瘢痕組織，這些瘢痕組織雖然限制了神經(jīng)軸突生長(zhǎng)，但是也同時(shí)形成了保護(hù)性屏障，將具有吞噬性能力的小膠質(zhì)細(xì)胞限制在壞死核心，密封傷口并促進(jìn)碎屑清除、炎癥抑制，隨著炎癥的消退，刺激小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型極化，釋放大量具有神經(jīng)保護(hù)及促進(jìn)軸突再生作用的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)和神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)，逐漸修復(fù)損傷的神經(jīng)組織〔13,14〕。這些原因?qū)е录顾钃p傷區(qū)域的炎癥減輕，有利于神經(jīng)細(xì)胞存活，同時(shí)促進(jìn)NECAB2合成增加，進(jìn)而反饋調(diào)節(jié)BDNF從興奮性神經(jīng)末梢的釋放〔15～18〕。脊髓損傷后由于興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸仍持續(xù)從神經(jīng)突起的囊泡釋放，不僅激活了突觸后膜上的谷氨酸受體，同時(shí)浸潤(rùn)在損傷部位的中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞上的腺苷A2A受體也同樣被激活，在脊髓損傷后期NECAB2大量表達(dá)不僅能降低腺苷A2A受體在細(xì)胞膜上的表達(dá)，還可以穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，二者共同作用減輕氧化應(yīng)激和炎癥損傷，減少了細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，有利于損傷區(qū)神經(jīng)細(xì)胞存活，但是其整體表達(dá)仍低于正常水平，這與相關(guān)實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致〔3，19，20〕。Syn是一種與神經(jīng)生長(zhǎng)、修復(fù)再生和突觸重塑密切相關(guān)的蛋白，廣泛存在于突觸前膜中，其水平被認(rèn)為是神經(jīng)遞質(zhì)釋放、神經(jīng)元之間突觸強(qiáng)度的重要指標(biāo)，通過(guò)其磷酸化與突觸囊泡解離，允許神經(jīng)遞質(zhì)的胞吐，而NECAB2也具備調(diào)節(jié)神經(jīng)突起囊泡胞吐神經(jīng)遞質(zhì)的作用，它們共同表達(dá)的量和密度分布可作為反映神經(jīng)功能的特異標(biāo)志物〔21～23〕。CGRP可通過(guò)抑制興奮性谷氨酸的釋放，阻止谷氨酸介導(dǎo)的細(xì)胞鈣離子內(nèi)流，降低細(xì)胞膜鈣離子的通透性，從而維持細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)定，調(diào)節(jié)Bcl-2和c-fos等基因的表達(dá)〔24,25〕，促進(jìn)睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)的釋放，增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄激活子3的活性，促進(jìn)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白(GAP)-43大量表達(dá)，提高再生基因蛋白(Reg)的水平，有利于神經(jīng)細(xì)胞再生修復(fù)〔26,27〕，而NECAB2與CGRP在鄰近細(xì)胞呈現(xiàn)互補(bǔ)表達(dá)，這說(shuō)明NECAB2神經(jīng)細(xì)胞可以與釋放CGRP肽能的神經(jīng)纖維構(gòu)成突觸，進(jìn)而調(diào)節(jié)神經(jīng)突觸的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)平衡，以免過(guò)度釋放大量谷氨酸造成興奮性中毒，有利于神經(jīng)細(xì)胞傳遞信息。

脊髓損傷后NECAB2通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度維持鈣穩(wěn)態(tài)，與Syn共同促進(jìn)神經(jīng)突起囊泡胞吐BDNF，與CGRP共同穩(wěn)定神經(jīng)突觸內(nèi)的谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)平衡，抑制氧化應(yīng)激和炎癥損傷，減少神經(jīng)細(xì)胞凋亡現(xiàn)象，在神經(jīng)遞質(zhì)釋放、突觸傳遞及神經(jīng)可塑性等方面發(fā)揮重要作用。