李園園 王英紅

(石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦科，新疆 石河子 832000)

宮頸癌是在世界范圍內(nèi)女性最常見的癌癥之一，也是造成女性腫瘤死亡的主要原因，在大于500 000例宮頸癌患者中，有80%都是在發(fā)展中國家，對女性健康造成嚴重威脅〔1，2〕。導致宮頸癌發(fā)生的因素包括病毒感染、遺傳因素和環(huán)境因素等，目前，手術切除是治療早期宮頸癌的主要手段，放化療也是治療宮頸癌的一種先進方法〔3〕。雖然宮頸癌的診斷和治療策略在不斷發(fā)展和進步，但是患者的生存率仍然較低〔4〕。因此，研究宮頸癌發(fā)生和發(fā)展新的潛在生物學機制是開發(fā)創(chuàng)新且有效治療方案的關鍵。微小RNA(miRNA)可通過誘導mRNA分裂和抑制翻譯來介導基因的表達，是腫瘤發(fā)生的重要影響因素〔5〕。其中miR-411、miR-198、miR-216、miR-137等已報道與宮頸癌細胞的生物過程密切相關〔6～9〕。miR-1290可通過抑制人LIM同源異性域(LHX)6 mRNA表達促進膠質(zhì)瘤細胞的增殖和轉移〔10〕。miR-1290通過靶向肌醇多磷酸-4-磷酸酶B(INPP4B)促進結直腸癌細胞增殖，并在mRNA水平上降低p27表達〔11〕。miR-1290通過靶向細胞因子信號通路(SOCS)4促進肺腺癌細胞的增殖和侵襲〔12〕。因此推測miR-1290可能有原癌基因作用，但miR-1290對于宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響尚未有研究。本研究通過體外細胞實驗，探討抑制miR-1290對宮頸癌細胞增殖、遷移和侵襲的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞 人宮頸癌細胞株HeLa(貨號：TCHu 20)、SiHa(貨號：TCHu 113)和CaSki(貨號：TCHu 137)均購自中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會細胞庫；人宮頸上皮永生化細胞H8(貨號：C0397)購自上海冠導生物工程有限公司。

1.1.2主要試劑 含10%胎牛血清(FBS)的DMEM/F12培養(yǎng)基購自美國Giboc公司；二甲基亞砜(DMSO)和四甲基偶氮唑藍(MTT)均購自美國Sigma公司；Transwell小室購自北京明陽科華生物科技有限公司；Lipofectamine2000轉染試劑盒購自美國Invitrogen公司；RNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司；逆轉錄試劑盒購自美國Genecopoeia公司；雙熒光素酶檢測試劑盒購自北京索萊寶生物科技有限公司；野生型和突變型STK17A 3′UTR熒光素酶報告基因載體(STK17A WT、STK17A MUT)由上海生工生物有限公司構建；miR-1290陰性對照(miR-1290 NC)、miR-1290抑制劑(miR-1290 inhibitor)、miR-1290模擬物(miR-1290 mimics)及miR-1290、絲氨酸蘇氨酸激酶(STK)17A、β-actin引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.1.3實驗儀器 酶標儀Fax-20100購自美國INStat公司；尼康SMZ745光學顯微鏡購自上海普赫生物科技有限公司；FACSCanto流式細胞儀購自美國Beckman公司；TL988實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR)儀購自西安天隆科技有限公司。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR檢測宮頸癌細胞及正常宮頸細胞miR-1290和STK17A表達 將SiHa、HeLa、CaSki、H8細胞接種于含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%的細胞培養(yǎng)箱中。當細胞融合80%以上時，胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)期生長狀態(tài)良好的細胞，使用RNA提取試劑盒提取總RNA，用逆轉錄試劑盒反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，進行PCR擴增。miR-1290基因上、下游引物分別為5′-ACACTCCAGCTGGGTGGATTTTTGG-3′和5′-CTCAA CTGGTGTCGTGGA-3′；STK17A基因上、下游引物分別為：5′-GAACACCATGATCCCTTTGG-3′和5′-GTGCCTTTTCCATCCTGAAA-3′；內(nèi)參基因β-actin的上、下游引物分別為5′-GGGAAATCGTGCGTGACATTAAGG-3′和5′-CAGGAAGGAAGGCTGGAAGAGTG-3′。反應體系為2×SYBR mix 10 μl，H2O 8 μl，上下游引物各0.5 μl，10×cDNA模板1 μl。反應條件設定為：95 ℃預變性5 min、95 ℃變性10 s、60℃退火30 s、40個循環(huán)、72 ℃延伸10 min。以β-actin作為內(nèi)參基因根據(jù)2-ΔΔCt算法進行mRNA表達量的計算與分析。取miR-1290相對表達量最高的宮頸癌細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.2細胞轉染及分組 將Hela癌細胞接種于含10% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，置于37℃、5%細胞培養(yǎng)箱中。當細胞融合達80%以上時，胰蛋白酶消化傳代，取對數(shù)期生長狀態(tài)良好的細胞，將細胞以1×106個/ml密度傳代培養(yǎng)于96孔板中，24 h后取出細胞，根據(jù)轉試劑盒說明書用Lipfectamine 2000將miR-1290 NC和miR-1290 inhibitor分別轉染入HeLa細胞。將細胞隨機分為3組：Control組(HeLa細胞未轉染)、miR-1290 NC組(HeLa細胞轉染miR-1290 NC)、miR-1290 inhibitor組(HeLa細胞轉染miR-1290 inhibitor)，轉染或培養(yǎng)48 h后，用于后續(xù)實驗。

1.2.3MTT比色法檢測細胞增殖率 收集上述1.2.2分組并培養(yǎng)或轉染48 h后的細胞，每組設置6個復孔，每孔加入10 μl MTT繼續(xù)孵育4 h，吸取上清，加入150 μl DMSO，充分震蕩混勻15 min后用酶標儀檢測各孔570 nm處OD值。細胞增殖率(%)=(實驗組OD570 nm-空白組OD570 nm)/(對照組OD570 nm-空白組OD570 nm)。

1.2.4檢測細胞遷移和侵襲數(shù) 遷移實驗：收集上述1.2.2分組并培養(yǎng)或轉染48 h后的細胞，胰蛋白酶消化，用無血清DMEM/F12培養(yǎng)基吹打成單細胞懸液。將Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜用磷酸鹽緩沖液(PBS)提前潤濕5 min，上室加入5×104個細胞，下室加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基，然后將Transwell小室置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h，取出聚碳酸酯微孔膜，用中性甲醛固定10 min，結晶紫染色20 min后，顯微鏡下觀察。隨機選取5個100倍不重疊視野，計數(shù)穿膜細胞數(shù)。以穿膜細胞數(shù)表示細胞遷移能力。實驗重復3次。侵襲實驗：實驗前2 h將Transwell小室的聚碳酸酯微孔膜用基底膠包被，其余步驟同遷移實驗。

1.2.5雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?采用TargetScan在線網(wǎng)站(http：//www.targetscan.org/vert_72/)對miR-1290作用的靶基因進行預測，篩選STK17A作為其可能的靶分子。取對數(shù)生長期的HeLa細胞接種于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，將細胞分為miR-1290 mimics+STK17A WT組、miR-1290 NC+STK17A WT組、miR-1290 mimics+STK17A MUT組和miR-1290 NC+STK17A MUT組，每組設3個復孔，進行細胞共轉染。轉染48 h后，應用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測STK17A的熒光強度，具體操作按照試劑盒說明書進行，驗證miR-1290與STK17A的靶向關系。

1.3統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0軟件進行單因素方差分析、SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1宮頸癌細胞與正常宮頸細胞miR-1290和STK17A表達比較 宮頸癌細胞SiHa、HeLa、CaSi的miR-1290表達量顯著高于人正常宮頸上皮細胞H8，STK17A表達量顯著低于人正常宮頸上皮細胞H8(均P<0.05)，且STK17A均得到表達的宮頸癌細胞中以HeLa的miR-1290相對表達量最高。見表1。所以，選擇HeLa細胞進行后續(xù)實驗。

2.2抑制miR-1290對HeLa細胞STK17A表達的影響 與Control組(0.15±0.11)和miR-1290 NC組(0.23±0.17)相比，miR-1290 inhibitor組HeLa細胞STK17A mRNA表達水平(10.27±0.96)顯著升高(P<0.05)。

2.3抑制miR-1290對HeLa細胞增殖的影響 與Control組〔(27.35±1.12)%〕和miR-1290 NC組〔(29.77±1.01)%〕相比，miR-1290 inhibitor組〔(10.53±1.28)%〕HeLa細胞增殖率顯著降低(P<0.05)。

2.4抑制miR-1290對HeLa細胞遷移和侵襲的影響 與Control組和miR-1290 NC組相比，miR-1290 inhibitor組HeLa細胞遷移穿膜細胞數(shù)和侵襲穿膜細胞數(shù)顯著降低(P<0.05)。見表2。

表2 miR-1290對HeLa細胞遷移和侵襲的 影響個，n=3)

2.5miR-1290與STK17A的靶向關系的預測與驗證 生物信息學預測結果顯示，miR-1290序列上存在STK17A連續(xù)的結合位點。見圖1。與miR-1290 NC+STK17A WT組(1.03±0.12)相比，miR-1290 mimics+STK17A WT組(0.47±0.06)STK17A報告基因的熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而miR-1290 mimics+STK17A MUT組(0.96±0.09)和miR-1290 NC+STK17A MUT組(0.98±0.10)STK17A報告基因的熒光素酶活性無明顯變化(P>0.05)。

圖1 生物信息學預測miR-1290與 STK17A 3′ UTR結合位點

3 討 論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)中較為常見的腫瘤，惡性程度極高。癌細胞的遷移和侵襲是導致患者病情惡化，甚至死亡的重要原因〔13〕，miRNAs的異常表達與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展密切相關，miRNAs可通過調(diào)控其對應的靶基因表達水平影響癌細胞的生物過程。

miRNA是由長度為18～26個核苷酸構成的內(nèi)源性非編碼單鏈小分子RNA，不具備編碼蛋白質(zhì)的功能，但其表達異?？梢鹉[瘤等多種疾病的產(chǎn)生〔14〕。miRNA對于宮頸癌的治療和預后都有重大意義，可能參與宮頸癌發(fā)生發(fā)展的全過程，調(diào)節(jié)癌細胞的增殖、侵襲、轉移和凋亡。Huang等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)miR-1290在胃癌患者的細胞系中過表達，可加強胃癌細胞的增殖和侵襲能力，Jin等〔16〕研究發(fā)現(xiàn)上調(diào)非小細胞肺癌中miR-1290表達可增強細胞增殖、集落形成和侵襲能力。本研究結果提示抑制miR-1290可能抑制宮頸癌細胞的增殖、侵襲和遷移。

miRNA可作為宮頸癌早期診斷和治療的靶標，有創(chuàng)傷小、易獲取和可重復等優(yōu)點。Liu等〔17〕研究發(fā)現(xiàn)miR-1290在結直腸癌和胰腺癌組織中表達異常，可作為結直腸癌和胰腺癌早期診斷的生物標志物。本研究結果提示miR-1290和STK17A之間可能存在靶向關系。STK17A是凋亡相關蛋白(DAP)激酶的家族成員，編碼有蛋白激酶結構的自磷酸化核蛋白，有誘導細胞凋亡的作用，在腫瘤細胞中表達較低〔18〕。作為一種凋亡相關因子，紫外線或某些藥物的刺激可通過STK17A高表達引起細胞凋亡，Xu等〔19〕研究表明過表達STK17A可促進人乳腺癌細胞的凋亡，Gao等〔20〕研究表明卵巢癌細胞中STK17A表達水平的改變導致癌細胞對卡鉑和紫杉醇的易感性發(fā)生變化。而miRNA主要通過與靶基因3′ UTR結合而調(diào)控細胞生物學功能，為了進一步驗證miR-1290與STK17A的靶向關系，本研究結果提示miR-1290可能通過靶向STK17A進而抑制宮頸癌細胞的增殖、遷移和侵襲。

綜上，miR-1290能通過靶向調(diào)控STK17A抑制宮頸癌細胞增殖、侵襲和遷移，為宮頸癌的治療提供又一新的靶標，但是STK17A在各種類型的腫瘤細胞表達及其對腫瘤發(fā)生和轉移的作用機制較為復雜，尚需進一步研究。