文榮 王翠峰 張智燕 任美英

(內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗科，內(nèi)蒙古 包頭 014010)

通常在正常人體肺臟層胸膜和壁層胸膜之間有5～15 ml液體，在呼吸運動中起潤滑作用，當(dāng)循環(huán)障礙、炎癥刺激，尤其腫瘤轉(zhuǎn)移時胸膜腔就可形成大量液體，導(dǎo)致胸腔積液的發(fā)生。臨床診斷胸腔積液的方法中，輔助檢查以實驗室檢查最為常見，其檢查項目包括胸腹水的脫落細胞學(xué)檢查、免疫組化病理學(xué)檢查，但目前仍無十分明確的診斷方法，故存在一定假陰性率〔1,2〕，因此探尋敏感性和高特異度的早期診斷方法就顯得尤為重要。腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)信號通路作為細胞能量感受器，任一環(huán)節(jié)出現(xiàn)問題都會導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔3〕，肝激酶(LK)B1是AMPK的上游激酶，它對細胞的有效調(diào)控是其抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要原因；LKB1-AMPK負(fù)向調(diào)控某些重要的信號通路，如哺乳動物雷帕霉素蛋白等。本研究探明AMPK信號通路對中老年腫瘤患者胸腔積液表達的影響。

1 材料與方法

1.1研究對象 2017～2019年包頭醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院呼吸科及胸外科門診及住院病人，具有完整的病例資料中老年肺癌患者的胸腔積液標(biāo)本120例，均為未接受任何治療前采集的胸水。結(jié)合臨床資料從中篩選出惡性胸腔積液78例，良性胸腔積液42例，所有病例經(jīng)組織活檢及細胞學(xué)檢查確證。其中男85例，女35例，年齡50～71〔平均(58.5±13.1)〕歲，所有患者簽署知情同意書。

1.2實驗試劑 細胞染液試劑盒：購自南京三生生物公司；實時熒光定量RT-PCR試劑盒(購自天津生物芯片技術(shù)有限責(zé)任公司；引物：由Invitrogen賽默飛世爾科技(中國)有限公司合成；蛋白印跡抗體：LKB1、AMPKα1、AMPKα2、p-AMPK抗體均購自Invitrogen賽默飛世爾科技(中國)有限公司，二抗購自美國CST公司。

1.3標(biāo)本處理 分別收集良、惡性胸腔積液標(biāo)本80 ml，分裝于不同離心管中并做標(biāo)識，以2 000 r/min離心10 min，留取細胞沉淀。分別于4℃冰箱和-80℃冰箱保存，用于脫落細胞學(xué)檢查、RT-PCR及Western印跡實驗。

1.4脫落細胞學(xué)檢查 將良、惡性胸腔積液分組后離心留取沉淀，制作細胞涂片，用瑞吉(瑞氏-吉姆薩)染色法進行細胞染色。由高年資細胞組專家在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并做出良、惡性胸腔積液的判斷。

1.5判斷依據(jù) (1)良性胸腔積液：顏色多為淡黃色或乳白色，主要以白細胞、吞噬細胞等非上皮細胞為主，偶見間皮細胞小團，其形態(tài)呈圓形或卵圓形。(2)惡性胸腔積液：顏色大部分以血性或洗肉水色多見，腫瘤細胞形態(tài)畸形，核質(zhì)比增大，染色深，可見乳頭狀、桑葚狀排列，見圖1。

1.6實時熒光定量PCR檢測基因表達 從-80℃冰箱取出良惡性組胸腔積液標(biāo)本，待充分融化后以3 500 r/min離心10 min，棄去上清，留取下層細胞沉淀。用Trizol提取液提取各組胸水總RNA，并計算RNA 濃度，應(yīng)用RT-PCR將其反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)條件第一步:50℃ 2 min；第二步：97℃ 2 min；第三步:96℃ 10 s，60℃ 30 s，75℃ 30 s；第四步：70℃ 2 min,共35個循環(huán)，實驗重復(fù)3次。引物序列如下：AMPKα1：上游：5′-CAGCTTGCAGTGGCTTATCA-3′，上游：5′-CAGTTCATCCAATGGACATC-3′；AMPKα2：上游5′-CGCTGTCATCGCTTTATCG-3′，下游：5′-ATGCTCAGACACCTCCACC-3′；LKB1上游：5′-TGGTTCCGGAAGGAACATCCC-3′，下游：5′-CACCGTGAAGTCCTGAGTGTAG-3′；β-actin上游：5′-TC-CCTGAAGAAGAGCTACGA-3′，下游：5′-AGCACTGTGGTGGCGTACAG-3′。

圖1 倒置顯微鏡下細胞形態(tài)學(xué)(×20)

1.7Western印跡方法檢測蛋白水平表達 將良惡性胸腔積液標(biāo)本分組后分別取80 μl放入EP管中并做好標(biāo)記。用蛋白裂解液裂解兩組細胞，提取總蛋白。輕取蛋白樣品95C°至完全變性，再進行10% 聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，用含5% 牛血清白蛋白的TBST室溫封閉1 h。之后將PVDF膜分別與AMPKα1(1∶1 000)、AMPKα2(1∶1 000)、p-AMPK(1∶2 000)、LKB1(1∶1 000)和β-actin(1∶1 000)抗體4℃孵育過夜。待一抗孵育結(jié)束后，室溫?fù)u床上用TBST洗膜3次，每次10 min。加入稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔二抗(1∶4 000)37℃室溫孵育2 h，用電化學(xué)發(fā)光(ECL)法顯影，曝光5～10 min。后用Image J軟件分析兩組蛋白條帶的灰度值，與內(nèi)參灰度值比值即為該蛋白含量。

1.8統(tǒng)計學(xué)分析 采用GraphPad Prism7.0軟件進行t檢驗。所有Real-time數(shù)據(jù)mRNA相對值以ΔΔCt值表示：ΔΔCt=2-ΔΔCt。

2 結(jié) 果

良、惡性胸腔積液組LKB1 AMPKα1、AMPKα2 mRNA相對表達量、LKB1、p-AMPK蛋白表達差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.001)，見表1，圖2。

表1 良惡性胸腔積液LKB1、AMPKα1、AMPKα2蛋白和mRNA及p-AMPK蛋白表達

圖2 良惡性胸腔積液中LKB1、AMPKα1、AMPKα和 p-AMPK蛋白表達

3 討 論

肺癌對人類健康和生命存在極大危害，發(fā)生機制較為復(fù)雜。胸腔積液是常見的臨床癥狀，對其類型的明確診斷對于臨床病情評估和對癥治療尤為重要。AMPK信號傳導(dǎo)通路被稱之為“細胞能量感受器”〔4〕，可感受腺苷-磷酸/腺苷三磷酸(AmP/ATP)的比值的變化。LKB1作為AMPK的上游基因可直接激活A(yù)MPK，被激活的AMPK正向調(diào)節(jié)結(jié)節(jié)性硬化復(fù)合體基因(TSC)，增加TSC1/2復(fù)合物表達水平，使mTOR負(fù)向調(diào)節(jié)〔5,6〕。本研究結(jié)果表明，AMPK信號通路在老年患者良、惡性胸腔積液中均有表達。本研究結(jié)果與該信號通路對原發(fā)腫瘤細胞〔7〕代謝的調(diào)節(jié)相一致。本研究結(jié)果也和Matsumto等〔8〕在NSCLC中表明的基因突變研究相一致；另外，在鼠模型研究中，Contreras等〔9,10〕也有相同的結(jié)果，本研究結(jié)果惡性胸水LKB1蛋白表達的降低可能與之有關(guān)；與良性胸水比較，AMPKa與p-AMPKα蛋白表達在惡性胸水中僅有部分樣本有趨勢性改變，這可能與惡性積液中存在某些干擾腫瘤細胞代謝相關(guān)的因子有關(guān)；王麗紅等〔11〕對子宮內(nèi)膜癌發(fā)病機制中的研究證實，在增殖階段子宮內(nèi)膜、內(nèi)膜樣腺癌、內(nèi)膜非典型增生組織內(nèi)，AMPK與LKB1表現(xiàn)出較低表達水平，在這兩種基因表達水平而言，相比正常子宮內(nèi)膜組，子宮內(nèi)膜樣腺癌組則顯著較低。說明在子宮內(nèi)膜出現(xiàn)非典型增生與此增生不斷進行最終癌變這一環(huán)節(jié)， AMPK信號傳導(dǎo)通路的異常發(fā)揮起到關(guān)鍵作用。目前有關(guān)AMPK信號傳導(dǎo)通路在子宮內(nèi)膜癌、肺小細胞肺癌及喉鱗狀細胞癌等中的研究表明:LKB1與AMPK表達均表現(xiàn)為下降趨勢，這與本研究結(jié)果肺腺癌性胸腔積液中的AMPK信號傳導(dǎo)通路變化趨勢相一致。

本研究結(jié)果與許晶等〔12〕AMPK信號通路對原發(fā)腫瘤細胞代謝調(diào)節(jié)結(jié)果的變化趨勢相一致，雖然該信號通路在相關(guān)研究中取得了一些進展和成果，但尚未完全闡明關(guān)鍵機制，因此仍需做進一步實驗研究為腫瘤診斷及治療開辟一條新的途徑。